銅在狐尾藻中的積累及亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)

關(guān)鍵詞：狐尾藻；銅；亞細(xì)胞分布；化學(xué)形態(tài)；耐性機(jī)制

在規(guī)?；⒓s化養(yǎng)殖體系中，銅和鋅等金屬元素通常作為添加劑被頻繁加入動物飼料中，目的是增強(qiáng)動物的免疫能力和促進(jìn)其成長。但是，禽畜對這類添加劑的實(shí)際攝取率僅為10%-20%，大部分以原形或其代謝產(chǎn)物形式隨糞尿排入環(huán)境中。由于金屬具有易沉積、難降解等特性，導(dǎo)致畜禽養(yǎng)殖廢水中銅、鋅等金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年飼料中銅添加量已超10萬t，而畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞污中銅含量達(dá)2397.23t。銅作為一種生物必需的微量營養(yǎng)元素，對于動植物的生長和發(fā)育具有重要作用，適量可促進(jìn)動植物的生長代謝，過量（銅濃度升至某一閾值）則會抑制其生長發(fā)育，甚至毒害死亡。研究也發(fā)現(xiàn)過量銅進(jìn)入水體，會嚴(yán)重污染環(huán)境，影響人類健康。

利用對某種或多種重金屬具有超富集能力和耐受能力的植物修復(fù)重金屬污染技術(shù)，其關(guān)鍵是植物對重金屬的耐性和富集能力。植物對重金屬的耐性一般是通過兩個途徑，一是防止有毒金屬過量被植物吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部分，如風(fēng)眼蓮、旱柳陽和馬纓丹等通過根系對銅的穩(wěn)定作用，限制銅向地上部的運(yùn)輸，削弱銅對地上部的毒害。二是通過一系列的解毒機(jī)制降低重金屬在植物體內(nèi)活性或者毒性，如輪葉黑藻將銅固定在細(xì)胞壁上，減少銅離子對細(xì)胞原生質(zhì)體的毒害；紫鴨跖草則借助細(xì)胞原生質(zhì)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸等組分與銅相結(jié)合，從而減緩銅的生物毒性；蘋果樹體內(nèi)銅以鹽酸、醋酸等低活性形態(tài)存在，降低銅對植物的損害。這表明，不同植物對重金屬銅的耐性機(jī)制不同。植物中重金屬在各組織器官亞細(xì)胞中的分布與化學(xué)形態(tài)同重金屬毒性、遷移能力和生物有效性緊密相連。目前不同植物對重金屬的富集能力和解毒機(jī)制研究更多的是關(guān)注于土壤中的重金屬，而沉水植物對畜禽養(yǎng)殖廢水中重金屬耐性機(jī)制研究較為少見。

狐尾藻（Myriophyllum spicatum L），作為一種多年生、粗壯的沉水草本植物，根莖發(fā)達(dá)，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于水體修復(fù)。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，狐尾藻耐污染能力較強(qiáng)，對養(yǎng)殖廢水中銅具有良好的富集能力，但其對銅的耐性機(jī)制尚不明確。對狐尾藻富集養(yǎng)殖廢水中銅的作用機(jī)理開展進(jìn)一步研究，明確銅在狐尾藻器官、亞細(xì)胞中分布特征與存在形態(tài)，對提高狐尾藻收割后作為魚飼料的有效性與安全性具有十分重要的意義。因此，本文以狐尾藻為試驗(yàn)材料，通過水培試驗(yàn)，研究狐尾藻中銅的含量及分布特征；通過差速離心法和五步提取法，本研究分析了狐尾藻亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中銅的分布及其銅的化學(xué)形態(tài)特征，旨在探討狐尾藻對銅的耐性機(jī)制，并為利用狐尾藻處理養(yǎng)殖廢水提供理論支持。

1材料與方法

1.1供試材料

狐尾藻：從基地生物塘采集狐尾藻，用清水沖洗干凈后安置于溫室的玻璃缸內(nèi)培育2-3個月。利用可自動調(diào)節(jié)光照、溫度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)狐尾藻。其具體參數(shù)設(shè)置：光照強(qiáng)度為115-120umol·m-2·s-1、25℃，相對濕度維持在55%～65%，光／暗為14h/10h。

試驗(yàn)所用水為模擬養(yǎng)殖廢水，其配方如表1所示。

1.2水培試驗(yàn)

試驗(yàn)為無土栽培，以模擬養(yǎng)殖廢水為水培液。取馴化后狐尾藻，10cm植物頂枝（20株）栽于15L塑料培養(yǎng)箱（長×寬×高29cmx20cmx31cm）中，添加10L模擬養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)。在室外同一區(qū)域放置15個等體積的塑料水箱，在每個實(shí)驗(yàn)桶中分別種植長勢良好、株高、莖粗、生物量較一致的10株狐尾藻，并持續(xù)穩(wěn)定7d。設(shè)置3種處理，重金屬銅添加量分別為：0（CK，不添加）、20mg·L-1（Hl）和50mg·L-1（H2），每個處理設(shè)置5個重復(fù)。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，植物生長環(huán)境溫度為（20±5）℃，自然光照，相對濕度為43.52%左右。每間隔3d用蒸餾水補(bǔ)給因蒸發(fā)作用而損失的水分，每周觀察記錄狐尾藻的生長狀況，植物試驗(yàn)周期為28d。在試驗(yàn)結(jié)束后將狐尾藻整株收獲，先用預(yù)先曝氣的自來水反復(fù)沖洗去除雜質(zhì)，再用去離子水反復(fù)清洗去除吸附在植株上的培養(yǎng)液，最后將植株晾干保存。

1.3測定方法

1.3.1生物量的測定

首先，所采集的植物樣本置于去離子水中進(jìn)行徹底沖洗，以去除潛在的雜質(zhì)。隨后，采用吸水紙將樣本表面水分擦除。接著，將狐尾藻的葉、莖、根分別取樣并稱質(zhì)量，分別準(zhǔn)確記錄。最后，在105℃條件殺青0.5h后，經(jīng)60℃烘干至質(zhì)量恒定，稱量干質(zhì)量。

1.3.2葉綠素含量、丙二醛及超氧化物歧化酶的測定

葉綠素含量通過無水乙醇提取法測定；丙二醛（MDA）含量參照李玲等的硫代巴比妥酸（TBA）法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照陳天等的方法：取新鮮狐尾藻葉片（根系）0.10g置于預(yù)冷（先用冰塊或者放冰箱中處理）的研缽中，加入少許研磨珠與pH為7.8、濃度為0.05mol·L-1的磷酸緩沖液，然后在冰浴中充分研磨勻漿。之后，將勻漿化的混合物在低溫離心機(jī)中離心15min，轉(zhuǎn)速為4000r·min-1，溫度保持在4℃，離心后收集上清液（酶粗提取液），冷藏待測。酶粗提取液經(jīng)試劑盒（Solarbio，北京）處理后，用酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan FC，上海）統(tǒng)一測定。

1.3.3亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分級

狐尾藻各器官亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分級參考羅浩文等的方法：植物鮮樣（葉、莖、根）經(jīng)兩次預(yù)冷存的提取緩沖液充分研磨勻漿混合，一起轉(zhuǎn)入離心管中，利用差速離心法分離出細(xì)胞壁、原生質(zhì)體、線粒體和可溶組分四個組分。上述所有過程在4℃條件下進(jìn)行，分離的每個組分全部轉(zhuǎn)移至消解管消解待測。

1.3.4重金屬銅化學(xué)形態(tài)提取

狐尾藻體內(nèi)不同形態(tài)銅的逐步提取參考許嘉琳等的化學(xué)試劑逐步提取法：稱量1.0g狐尾藻（葉片、莖、根）各部位新鮮樣品，利用干凈的剪刀將其切碎，并放入50mL的離心管中。加入提取劑（第一次40mL、第二次10mL）以充分浸泡樣品實(shí)現(xiàn)提取。將兩次提取的液體收集合并，存放在150mL的錐形瓶中，以備后續(xù)分析使用。所用提取劑根據(jù)下列順序進(jìn)行逐步浸提：80%乙醇、去離子水、1mol·L-1氯化鈉溶液、2%醋酸和0.6mol·L-1鹽酸；上述提取劑極性按順序依次升高，前3種（乙醇、去離子水和氯化鈉）提取態(tài)銅活性較強(qiáng)，而醋酸和鹽酸提取態(tài)銅活性較弱。

1.3.5狐尾藻葉片微觀形態(tài)

取試驗(yàn)處理前后狐尾藻葉片（5mm2）中段，置于4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中。采用高分辨率透射電鏡對葉片實(shí)現(xiàn)表面形態(tài)掃描，并通過Digital Mi-crograph軟件完成數(shù)據(jù)分析。

1.4植物銅含量分析

（1）植物干樣：借鑒Zhang等的濕灰化技術(shù)，對植物葉、莖、根三個器官中的銅含量進(jìn)行定量分析。具體步驟為：取0.50g混合均勻的植物干樣放入雛形瓶，加入4：1的硝酸和高氯酸混合液進(jìn)行消化，直至溶液透明。消化后，將溶液轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度線，再過濾待測。利用原子吸收光譜儀（AA7700，Thermo Elemental，美國，檢出限0.02mg·kg-1）測定消煮液中的銅濃度。試驗(yàn)測得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（灌木枝葉，GBW07602，GSV-1）的銅濃度（5.19+0.33）mg·kg-1，該數(shù)值處于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)設(shè)定的參考界限內(nèi)[（4.90+0.30） mg·kg-1]，說明該消解方法可靠。

（2）植物鮮樣：將采集的亞細(xì)胞組分和提取液裝入消解管，添加5mL混酸（硝酸和高氯酸按4：1混合），密封后置于漏斗中過夜。次日將其置于電熱板上進(jìn)行完全消解，之后用去離子水對消解液進(jìn)行定容處理。用原子吸收光譜儀（型號同上）測定樣品中銅含量。

1.5數(shù)據(jù)處理

收獲植物根系、莖和葉，分別測量銅含量，計(jì)算植物各器官對銅的吸收及遷移系數(shù)。通過遷移系數(shù)來探討銅在植物不同器官間的積累與分布能力。遷移系數(shù)（transfer factor，TF）分為TF根一莖（莖部銅濃度／根部銅濃度）和TF莖_n十（葉片銅濃度／莖部銅濃度）。

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)Origin8.0和SPSS19.0軟件處理，差異顯著性利用單因子方差分析（ANOVA）來檢驗(yàn)，設(shè)定顯著性水平為Plt;0.05。

2結(jié)果與分析

2.1銅脅迫對狐尾藻生長的影響

從圖1a分析可知，隨著銅處理濃度的升高，狐尾藻的葉、莖和根的生物量表現(xiàn)出先上升后下降。當(dāng)銅濃度為20mg·L-1時，狐尾藻葉、莖和根的生物量相比對照組無明顯差異，其生物量分別為（4.02+0.16）、（5.16+0.28）g和（2.46+0.14）g；銅處理濃度為50mg'L-1時，狐尾藻葉、莖和根的生物量分別為對照的67.78%、63.01%和46.52%，其顯著低于對照組。

葉綠素含量高低是反映葉片光合作用強(qiáng)弱的重要生理指標(biāo)。從圖1b中可知隨著銅濃度的增加，狐尾藻葉綠素含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)銅濃度為20mg·L-1時，葉綠素含量為（1.24+0.016）mg·g-1，相比CK處理提高了10.87%;當(dāng)銅濃度為50mg·L-1時，狐尾藻葉綠素含量為（0.80+0.019）mg·g-1，比CK處理減少了28.52%。由此說明，低濃度的銅對狐尾藻葉綠體色素合成具有促進(jìn)作用，間接提升植物的光合效率，進(jìn)而增加狐尾藻生物量，但銅濃度高于50mg·L-1時，則會削減葉綠素含量，出現(xiàn)部分葉子發(fā)黃脫落，狐尾藻生物量減少。

圖2a顯示，在受銅離子脅迫的情況下，狐尾藻葉片中MDA含量隨著銅處理濃度的上升而顯著增加，當(dāng)銅濃度為50mg·L-1時，達(dá)到0.34umol·L-1，分別是CK、H1處理的1.33倍和1.51倍。銅脅迫使狐尾藻根部MDA含量顯著增加，20mg·kg-1和50mg·kg-1的銅處理分別使根部MDA含量較對照增加58.64%和109.26%，該結(jié)果表明植物根的膜脂過氧化程度比葉大。圖2b顯示狐尾藻根和葉在不同銅濃度處理后SOD活性變化，從圖中可看出，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度范圍內(nèi)，隨著銅濃度升高，狐尾藻SOD活性呈上升趨勢。銅濃度為20mg·L-1和50mg·L-1時，狐尾藻葉片SOD活性相比對照處理分別提高25.89%和81.46%，而其根部SOD活性分別提高39.07%和84.74%，根部SOD活性顯著高于相應(yīng)葉片。

2.2銅脅迫前后狐尾藻外觀變化與葉片表皮細(xì)胞形態(tài)

高濃度銅（50mg·L-1）脅迫后，相比對照組，狐尾藻葉片發(fā)黃，靠近根部葉片有所脫落；植株莖偏短偏細(xì)；根系須根少，主根短。而低濃度銅（20mg·L-1）脅迫狐尾藻葉片和莖外觀與對照組差別不大，但根系須根多且長，主根稍短而粗。圖3為狐尾藻吸附Cu2+前后其葉片表皮細(xì)胞形態(tài)。觀察圖3可發(fā)現(xiàn)，受銅離子脅迫前狐尾藻植株健壯，其葉片表皮細(xì)胞規(guī)則，近似長方形，且細(xì)胞顆粒飽滿，細(xì)胞壁平滑整齊。吸附Cu2+后，細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生離子交換，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)明顯凹陷、變形，細(xì)胞壁產(chǎn)生褶皺，葉片細(xì)胞受到損傷。

狐尾藻吸附Cu2+前后葉片掃描能譜如圖4所示，從圖中可知狐尾藻富含碳、氧、鈉、鎂、鉀及鈣等元素，其中碳、氧等元素是羥基、羧基等官能團(tuán)的組成成分，可絡(luò)合重金屬。從能譜圖看出狐尾藻吸附銅后，鈉、鎂、鉀、鈣等礦質(zhì)元素含量明顯減少，而銅含量增加，表明銅因發(fā)生離子交換而被轉(zhuǎn)化吸收，其中鈣含量下降最明顯，推測其相較其他礦質(zhì)元素更易于與Cu2+發(fā)生離子交換作用。

2.3銅在狐尾藻各器官間的分布與遷移特征

從圖5a可知，在外源銅處理下，狐尾藻根、莖和葉中銅含量隨著銅濃度增加而增加，且狐尾藻根系中銅含量顯著高于其莖、葉部分含量。試驗(yàn)結(jié)束，H2處理狐尾藻根系銅含量可達(dá)（186.34+3.56） mg·kg-1，分別是H1、CK的4.33倍和15.78倍。從狐尾藻各器官對銅遷移能力分析結(jié)果（圖5b）來看，銅從根到莖（TF根一莖）的遷移系數(shù)為0.04-0.11，從莖到葉（TF）的遷移系數(shù)均大于1，且TF根一莖要比TF莖卅小很多，由此說明狐尾藻經(jīng)一段時間培養(yǎng)，銅主要積累于狐尾藻根部。

2.4銅在狐尾藻亞細(xì)胞內(nèi)的分布特征

由圖6可知，狐尾藻不同器官（葉、莖、根）的亞細(xì)胞組分中銅的分配比例和變化趨勢存在差異。在葉片中，銅的主要分布區(qū)域是細(xì)胞壁，占總量的41.45%-55.92%；其次是可溶性組分，約占總量的18.01%-34.63%，而原生質(zhì)體和線粒體中銅含量較少。隨著銅濃度的升高，可溶性組分中的銅比例有所上升，而細(xì)胞壁中銅分配比例相應(yīng)減少，線粒體和原生質(zhì)體中銅分配比例變化幅度較小，稍有降低。在莖部，銅的分布同樣以細(xì)胞壁為主，占總量的45.44%-49.92%，其次也是可溶性組分，占總量23.03%-27.65%，再者為原生質(zhì)體和線粒體，分別占總量的10.78%-17.65%和9.10%-14.87；隨著銅濃度的增加，細(xì)胞壁中銅分布含量降低，線粒體和可溶性組分部分比例稍有增加。根中銅也主要分布在細(xì)胞壁中，占總量的36.49%-49.61%，可溶性組分與原生質(zhì)體分配比例相當(dāng)，分別為21.65%-25.99%和20.49%-25.39%，比例最低的為線粒體部分，占總量的6.30%-17.02%；隨著銅濃度的增加，細(xì)胞壁和原生質(zhì)體中的分配比例升高，而線粒體和可溶性組分比例降低。由此說明外源銅濃度的高低會影響銅在植株各器官亞細(xì)胞中的分配比例。

2.5銅在狐尾藻體內(nèi)的化學(xué)形態(tài)分布特征

圖7為不同濃度銅處理狐尾藻葉、莖和根中銅不同提取態(tài)的分布比例，從圖7可知，銅在狐尾藻各器官組織中以鹽酸提取態(tài)為主，占提取銅總量的40.15%-44.73%（葉）、38.24%-44.16%（莖）和37.19%-43.23%（根）；醋酸提取態(tài)和乙醇提取態(tài)的銅含量居中，而氯化鈉提取態(tài)和水提取態(tài)銅含量相對較低，分別占提取銅總量的6.38%-13.31%和6.69%-12.22%。狐尾藻根部鹽酸提取態(tài)和醋酸提取態(tài)銅含量占比低于莖和葉，而氯化鈉提取態(tài)銅含量占比高于莖、葉，且外源銅濃度越高，氯化鈉提取態(tài)含量增加幅度越大，該研究結(jié)果說明氯化鈉提取態(tài)銅比例的提高可能是狐尾藻富集器官根部對銅污染在提取態(tài)上的響應(yīng)特征之一。

3討論

3.1狐尾藻對銅的脅迫響應(yīng)

銅是植物生長必需的微量元素，是多種酶（如多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶等）的組成成分，對氧化還原反應(yīng)起關(guān)鍵作用；同時，它在葉綠體的質(zhì)體藍(lán)素中發(fā)揮作用，參與光合作用電子傳遞，調(diào)節(jié)植物生長。許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)植物受重金屬脅迫會引起植物色素含量降低，主要是因?yàn)橹亟饘倜{迫會影響葉綠素所需酶的合成，并可能損傷葉綠素分子所結(jié)合的葉綠體膜結(jié)構(gòu)。因此，適宜濃度的銅對植物生長具有促進(jìn)作用，而超量銅則會對植物造成毒害。主要是因?yàn)檫^量銅可能與氮、硫、氧等配體過度絡(luò)合，引起酶及部分功能性金屬蛋白活性降低，對植物細(xì)胞造成傷害；而且，微量元素的過量攝入將誘發(fā)植物氧化應(yīng)激，損害植物細(xì)胞活性，大部分植物適宜的銅含量在5-20mg·L-1之間。因此，植物對重金屬的吸附量不僅影響植物生長，也會影響其各器官細(xì)胞形態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，狐尾藻在外源銅濃度0-20mg·L-1處理?xiàng)l件下，生物量和葉綠素含量相比對照組都有所提高；而濃度為50mg·L-1的銅處理，狐尾藻根、莖、葉生物量顯著減低，相比CK處理分別降低了53.48%、36.99%和32.22%，這也說明狐尾藻受到高濃度銅脅迫抑制了其生長，特別是根，這與Tripathi等的研究結(jié)果相似。其原因可能：一是銅濃度高于50mg·L-1時狐尾藻葉片細(xì)胞干癟，葉綠體合成受損，進(jìn)一步影響植物光合作用；二是根對高濃度銅脅迫響應(yīng)引起極性提取態(tài)銅比例增加，進(jìn)而毒害到植株，導(dǎo)致其生長受到抑制。

植物受到銅脅迫時，會影響細(xì)胞內(nèi)ROS的代謝平衡，使細(xì)胞質(zhì)發(fā)生過氧化或降解反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致植物代謝紊亂。MDA是一種高活性的植物細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物，可與核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生交聯(lián)，對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有破壞作用。因此，可以通過測定MDA含量來評估植物在逆境脅迫下細(xì)胞膜脂過氧化的程度，從而間接判斷植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷程度及其對重金屬污染的抗性。研究發(fā)現(xiàn)狐尾藻在銅脅迫下，各處理MDA含量均增加，尤其是根部MDA含量，該現(xiàn)象表明銅脅迫會對植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡產(chǎn)生影響，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致過氧化損傷。為了消除活性氧自由基、緩和膜損傷和減輕脂質(zhì)過氧化物作用，植物啟動植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)中保護(hù)酶SOD，利用SOD作用將超氧陰離子歧化為H202，并催化芬頓反應(yīng)產(chǎn)生更多的·OH。有研究表明，銅脅迫下，美人蕉、麻瘋樹和濱藜體內(nèi)過氧化物酶含量較對照均有所增加。在本實(shí)驗(yàn)中，狐尾藻葉片和根系中SOD的活性均隨著銅處理濃度的增加而出現(xiàn)不同程度的升高，這是植物體對重金屬脅迫反應(yīng)的典型特征。當(dāng)銅濃度逐漸增加時，狐尾藻激活其自身的抗氧化防御機(jī)制，特別是在根系中，SOD活性和MDA含量顯著高于對照組，反映其根系抗氧化能力較強(qiáng)，且對銅濃度的響應(yīng)更為敏感，這也是狐尾藻根系耐性較強(qiáng)的原因。這與許鐘丹等對香草的研究結(jié)果相似。

3.2狐尾藻體內(nèi)銅分布與遷移特征

不同植物對重金屬的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)途徑不同。對于完全淹沒在水體中的沉水植物黑藻，植物的莖、葉和根都可能從水溶液中吸收重金屬，且向上運(yùn)輸能力大于向下運(yùn)輸。對于部分淹水（根系和部分莖部沉浸于水中）的沉水植物狐尾藻，水下部分（根系和部分莖部）成為重金屬吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的首要器官。狐尾藻在銅脅迫下其葉、莖和根中銅含量為1.32-186.34mg·kg-1，根中銅的含量大于莖和葉。銅從根到莖（TF根一莖）的遷移系數(shù)遠(yuǎn)小于從莖到葉的遷移系數(shù)，與前人研究發(fā)現(xiàn)鎘在粉綠狐尾藻、褐藻和銅在苦草體內(nèi)的積累分布類似，即重金屬主要滯留在根部，這說明狐尾藻體內(nèi)銅可能大部分也富集于根部。狐尾藻根部相比莖葉具有更強(qiáng)銅富集能力，原因可能是狐尾藻根系在外源重金屬刺激下，通常會分泌草酸、檸檬酸等有機(jī)酸使根際形成酸性環(huán)境，促進(jìn)水體中的重金屬溶解而被吸收；同時狐尾藻根系分泌物容易和重金屬絡(luò)合形成可溶性復(fù)合物，利于重金屬在植物體內(nèi)富集。

3.3銅在狐尾藻各器官亞細(xì)胞中的分布

植物細(xì)胞抵御重金屬脅迫通常采取細(xì)胞壁吸附、液泡區(qū)隔化、胞質(zhì)內(nèi)絡(luò)合與轉(zhuǎn)化等方式，而細(xì)胞壁通常被認(rèn)為是植物原生質(zhì)體對抗金屬離子危害的首道屏障。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)銅在狐尾藻亞細(xì)胞組分中分布關(guān)系總體表現(xiàn)為：細(xì)胞壁gt;可溶性組分gt;原生質(zhì)體gt;線粒體，該結(jié)果與眾多學(xué)者研究結(jié)論相符。其原因可能是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特性（多糖基質(zhì)、獨(dú)特的官能團(tuán)以及帶有負(fù)電的生物大分子）為重金屬離子提供了可利用的結(jié)合位點(diǎn)，限制金屬離子的跨膜擴(kuò)散過程，從而有效減輕其對原生質(zhì)體的毒性作用。隨著銅濃度增加，原生質(zhì)體中銅比例增加，可溶性組分（液泡為主）占比先增后減，說明當(dāng)銅濃度持續(xù)增加時，細(xì)胞壁中重金屬的結(jié)合位點(diǎn)趨于飽和，銅則進(jìn)入原生質(zhì)體，而后轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，與液泡中的蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等物質(zhì)相互作用形成穩(wěn)定復(fù)合物，而被隔離在植物液泡內(nèi)，從而形成液泡內(nèi)區(qū)隔化現(xiàn)象，降低銅在其他細(xì)胞器中的分布，減少銅對植物生理損傷。由此可推斷，狐尾藻利用細(xì)胞壁的固定作用及液泡區(qū)隔化來抵御銅的毒害，這構(gòu)成了其關(guān)鍵的防御機(jī)制。

3.4銅在狐尾藻體內(nèi)的化學(xué)形態(tài)特征

植物吸收重金屬后，通常以多種化學(xué)形態(tài)存在于植物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)重金屬在不同極性提取劑中的溶解度存在顯著差異，隨著提取劑（80%乙醇、去離子水、氯化鈉、2%醋酸和鹽酸）極性增加．重金屬活性和毒性逐步降低，所以植物對重金屬的耐性程度與重金屬在植物體內(nèi)的存在形態(tài)和可流動性息息相關(guān)。在本研究中，外源銅脅迫下狐尾藻各器官組織中，銅主要以鹽酸提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和乙醇提取態(tài)存在，而水提取態(tài)與氯化鈉提取態(tài)銅含量比例相對較少，這同司江英等和李裕紅等的研究結(jié)果相似。在狐尾藻葉和莖中，隨著銅濃度增加，鹽酸提取態(tài)和醋酸提取態(tài)銅含量比例增加，而其他提取態(tài)銅含量比例減少。在植物體內(nèi)，鹽酸提取態(tài)和醋酸提取態(tài)主要代表的是同草酸與磷酸相互反應(yīng)形成的重金屬形態(tài)，該部分結(jié)合態(tài)的銅移動性和毒性較低。植物中含有豐富的有機(jī)酸，草酸就是其中之一，草酸與銅結(jié)合生產(chǎn)穩(wěn)定且毒性較低的草酸銅復(fù)合物，之后被植物各器官的細(xì)胞壁固定或是被液泡區(qū)隔離，防止過多銅侵入原生質(zhì)體，干擾植物細(xì)胞代謝過程，由此實(shí)現(xiàn)植物對銅的解毒。在狐尾藻根部，隨著外源銅濃度的升高，氯化鈉提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)銅含量比例呈現(xiàn)上升趨勢，乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)銅含量比例則呈現(xiàn)下降趨勢，而其醋酸提取態(tài)銅含量變化不明顯。其原因可能是，在植物體內(nèi)銅主要和蛋白質(zhì)、果膠鹽或金屬配位體絡(luò)合形成復(fù)合物，這些復(fù)合物容易被氯化鈉提取并沉積在細(xì)胞壁中；當(dāng)細(xì)胞壁的結(jié)合位點(diǎn)飽和后，銅離子會轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體中，并最終儲存于液泡中，該過程也解釋了銅在根系中富集的現(xiàn)象；且這種積累減弱了銅向根部其他關(guān)鍵細(xì)胞器以及植物莖葉部分的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而減少銅對植物體的毒害，由此表明銅在植物體內(nèi)的賦存形態(tài)也是植物的一種解毒機(jī)制。細(xì)胞壁固持和液泡區(qū)貯存的銅，以絡(luò)合物為主遷移性較弱，短期釋放能力有限，而狐尾藻中銅的長期釋放能力后續(xù)還需深入研究探討。

4結(jié)論

（1）狐尾藻對水體銅具有較強(qiáng)的吸收和積累能力，是修復(fù)銅污染水體的先鋒植物材料。當(dāng)銅濃度低于20mg·L-1時，可促進(jìn)狐尾藻的生長，當(dāng)銅濃度為50mg·L-1時，則顯著影響狐尾藻生物量的積累。在高濃度銅脅迫下，狐尾藻葉片受到氧化應(yīng)激損傷，而根系顯示較高的抗氧化防御能力，這是狐尾藻對銅耐性較強(qiáng)的一個重要生理機(jī)制。

（2）狐尾藻根系中銅含量高于莖、葉部分。狐尾藻各器官亞細(xì)胞組分中有36%以上的銅被固定于細(xì)胞壁，其次是可溶性組分。狐尾藻各器官細(xì)胞壁和可溶性組分（液泡）對銅的固定、區(qū)隔化有效阻止了銅向細(xì)胞膜、細(xì)胞器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，是狐尾藻重要的防御機(jī)制。

（3）狐尾藻中銅以鹽酸提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和乙醇提取態(tài)3種化學(xué)形態(tài)為主。鹽酸提取態(tài)占主導(dǎo)地位表明，植物內(nèi)部的草酸鹽、果膠酸及蛋白質(zhì)等多種重金屬配位體可與銅絡(luò)合，減少其在細(xì)胞內(nèi)的遷移性和活性，這也是狐尾藻耐銅的重要機(jī)制。