鎘脅迫對鹽地堿蓬二型種子幼苗生長及抗逆生理的影響

關(guān)鍵詞：鹽地堿蓬；鎘脅迫；二型種子；抗逆牛理

濱海濕地易沉積上游水體的重金屬元素，常成為重金屬元素的儲存庫，從而使得河口區(qū)域的生態(tài)環(huán)境惡化。鎘（Cd）是一種環(huán)境污染物，可以通過食物鏈富集，有很強的生態(tài)毒性積累效應(yīng)[。遼東灣大遼河底柄無脊椎動物的Cd、Cu和Zn含量顯著高于魚類，其中，Cd的生物富集系數(shù)最高。由于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和其他人類活動的發(fā)展，我國濕地沉積物的Cd污染問題應(yīng)當(dāng)?shù)玫街匾暋Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，黃河口從淡水濕地、微咸濕地到鹽沼濕地0～50cm土壤中Cd的平均含量均高于相應(yīng)的背景值。此外，Zhao等分析了中國14個典型三角洲地區(qū)采集的217個表層沉積物樣品，結(jié)果表明，Cd含量范圍為0～0.51mg·kg-1，有11個地區(qū)的土壤受到中度生態(tài)風(fēng)險的影響。因此，濕地Cd污染灘涂的治理顯得尤為迫切和重要。

土壤中高含量Cd會降低植物的根系活力，使根系營養(yǎng)吸收功能受損，從而抑制植物的株高、葉面積及生物量等。黃東華等發(fā)現(xiàn)堇葉碎米薺（Carda-mine violifolia）的生長受到重金屬Cd的抑制作用，葉片保護酶活性和葉綠素含量等呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。低含量重金屬可以提高米氏凱倫藻葉片（Kare-ma mLkLmotoI）超氧化物歧化酶活性和葉綠素含量，以及水稻根系分泌物含量和根系活力。陳雷等用不同含量Cd對鹽地堿蓬（Suaeda salsa）進行處理的盆栽試驗結(jié)果表明，鹽地堿蓬對Cd處理的鹽堿土有一定的耐受能力，鹽地堿蓬具有修復(fù)Cd污染鹽漬土的潛力；楊佳等通過室外盆栽試驗對鹽地堿蓬修復(fù)Cd污染鹽漬土進行研究，發(fā)現(xiàn)低含量Cd污染的鹽漬土促進了鹽地堿蓬的生長，高含量Cd污染抑制鹽地堿蓬的生長。然而，關(guān)于Cd脅迫下對比2種類型種子幼苗抗Cd脅迫響應(yīng)機理吸對Cd污染鹽漬土壤修復(fù)潛力的研究相對較少。

鹽地堿蓬是遼河口濕地潮間帶生境的單優(yōu)群落，是改善鹽堿土壤和恢復(fù)退化濕地的先鋒物種。鹽地堿蓬具有二型性種子，即同一植株上產(chǎn)生兩種（黑色種子和棕色種子）形態(tài)種子的現(xiàn)象。鹽地堿蓬液泡在低鹽環(huán)境中以葉綠素為主，植株表現(xiàn)為綠色；而在高鹽度的潮間帶生境中，則形成較多的甜菜紅素，植株表現(xiàn)為紅色，因此形成了遼河口濕地“紅海灘”景觀。遼河口濕地的土壤中Cd的含量范圍為0.04～0.78mg·kg-1，平均值為0.23mg·kg-1，高于背景值（0. 11mg·kg-1），且土壤重金屬Cd污染面積大，Cd污染已經(jīng)成為遼河口濕地鹽地堿蓬生態(tài)退化的主要因素。由于重金屬污染和富營養(yǎng)化，遼河口濕地出現(xiàn)生態(tài)退化，鹽地堿蓬數(shù)量減少，生物多樣性銳減，河口鹽地堿蓬濕地退化已經(jīng)成為人們不可忽視的問題。

因此，本試驗對比研究Cd脅迫下鹽地堿蓬二型種子幼苗（棕色種子和黑色種子）生長、葉片抗氧化酶（SOD、POD、CAT）比活力及滲透調(diào)節(jié)物含量等抗逆生理指標(biāo)的響應(yīng)特征，闡明鹽地堿蓬二型種子幼苗對Cd的耐受能力，為植被修復(fù)退化濕地和重金屬污染土壤提供最佳種子選擇。

1材料與方法

1.1試驗材料

2021年8月從遼寧省遼河口濕地（40°40'～41°27'N，122°05'～122°26' E）潮間帶采集鹽地堿蓬植株，成熟的鹽地堿蓬植株上有二型種子（黑色和棕色），種子形態(tài)特征見表1和圖1。從風(fēng)干穗中將種子分離出來，室溫（20-25℃）下儲存在密閉容器中，直到進一步試驗。

1.2試驗設(shè)計

鹽地堿蓬二型種子幼苗Cd脅迫處理共設(shè)0（對照）、0.04、0.2、0.4、0.8mg·kg-15個處理，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。供試基質(zhì)為蛭石與濕地土壤（Cd含量低于0.01mg·kg-1）1：1比例拌勻，保證混合土壤pH為7.1～7.2。將儲存的種子在5%次氯酸鈉（NaCIO）溶液中滅菌3min，然后用蒸餾水沖洗種子3次，晾干后將測試種子放置在內(nèi)襯雙層消毒濾紙的無菌培養(yǎng)皿（直徑12cm）中進行發(fā)芽，待長出1～2片真葉后，將幼苗分別移植到裝有0.5kg混合土壤的花盆中（直徑12cm、高12cm），每盆3株幼苗。隨后，開始向花盆中噴灑20mL相應(yīng)濃度的CdC12溶液（1、5、10、20mg·L-1）進行Cd脅迫處理，對應(yīng)土壤Cd含量分別為0.04、0.2、0.4、0.8mg·kg-1，符合實際遼河口濕地土壤中Cd的含量范圍（0.04～0.78mg·kg-1）。將30個花盆（5個CdCl2處理x3個重復(fù)x2型種子）放置在培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)箱中溫度20～25℃，相對濕度75%～85%，14h光照／10h黑暗。每周隨機更換花盆的位置，定期施加Hoagland營養(yǎng)液保證植物生長。培養(yǎng)40d后，選取3株幼苗，測定根、莖、葉中Cd含量，以及葉片抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量。剩余幼苗測量其株高并測定地上部分和地下部分鮮、干質(zhì)量。

1.3測定指標(biāo)與方法

1.3.1抗氧化酶活性測定

取鹽地堿蓬新鮮葉片沖洗干凈，拭干后研磨成勻漿進行抗氧化酶活性測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑光還原法測定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定。

1.3.2滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定

取鹽地堿蓬新鮮葉片沖洗干凈，拭干后研磨成勻漿進行葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定?？扇苄蕴呛康臏y定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法，脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮顯色法。

1.3.3質(zhì)量測定

將鹽地堿蓬幼苗清洗干凈，用濾紙吸干表面水分，分為地下（根）部分和地上（莖、葉）部分，稱量幼苗鮮質(zhì)量并測量株高，計算鹽地堿蓬根冠比，即植物地下部分與地上部分的鮮質(zhì)量的比值。然后在105℃下殺青20min，再置于80℃烘箱烘至恒質(zhì)量，分別對每株植株的地上部分干質(zhì)量和地下部分干質(zhì)量進行測定。

1.3.4器官中Cd含量的測定

將幼苗用去離子水清洗干凈，用濾紙擦干，然后烘干（105℃，30min）稱質(zhì)量。用研缽將1g烘干植物組織均勻化10mL混酸中（濃硝酸：高氯酸：濃硫酸=8：1：1），然后緩慢加熱消化，待溶液呈清亮無色后過濾，定容至25mL，用U-5100分光光度計（HITACHI）測定鹽地堿蓬幼苗中Cd的含量。

1.4數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2019計算數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）評價Cd處理對幼苗生長和生理特征的影響。在進行統(tǒng)計分析之前，利用SPSS 22.0的Kolmogorov -Smimov檢驗和Levene檢驗分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。如果方差不齊性，對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，保證方差的正態(tài)和同質(zhì)性。當(dāng)方差分析顯示處理間差異顯著時（Plt;0.05），采用Dun-can進行多重比較。使用Origin 2021繪制柱狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對鹽地堿蓬二型種子幼苗生長的影響

與對照比較，隨著Cd含量的增加，鹽地堿蓬二型種子幼苗株高和鮮質(zhì)量均呈下降趨勢，表明Cd脅迫可明顯抑制鹽地堿蓬的生長（圖2A和圖2B）。棕色種子幼苗和黑色種子幼苗在Cd含量為0.8mg·kg-1時株高達(dá)到顯著差異，較對照降幅分別為18.33%和25.75%;此外，當(dāng)Cd含量達(dá)到0.8mg·kg-1時，棕色種子和黑色種子幼苗每株鮮質(zhì)量較對照分別減少了36.18%和45.09%。黑色種子幼苗株高和鮮質(zhì)量降低幅度明顯大于棕色種子幼苗，說明Cd脅迫對黑色種子幼苗生長的抑制作用顯著大于棕色種子幼苗（Plt;0.05）。

根冠比反映了植物地下部分與地上部分生物量分配情況，黑色種子幼苗根冠比隨著Cd含量增加逐漸降低，而棕色種子幼苗根冠比則出現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖2C）。隨著Cd含量的增加，鹽地堿蓬棕色種子幼苗根、莖、葉生物量均在Cd含量為0.2mg·kg-1時達(dá)到峰值，隨后在Cd含量為0.8mg·kg-1時達(dá)到最低值，與Cd含量為0.2mg·kg-1時相比，分別降低了44.44%、29.41%和36.00%；鹽地堿蓬黑色種子幼苗在受到Cd脅迫時，其根、莖、葉生物量均表現(xiàn)出減小的趨勢，且差異顯著，0.8mg·kg-1Cd脅迫下各指標(biāo)降低幅度最大，分別為62.5%、35.71%、45.83%（圖2D-圖2F），黑色種子幼苗株高和鮮質(zhì)量降低幅度明顯大于棕色種子幼苗。

2.2Cd脅迫對鹽地堿蓬二型種子幼苗抗逆生理特性的影響

棕色種子幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量由對照的0.51、0.93mg·g-1和0.085mg·g-1增加為Cd含量0.8mggkg-1時的1.44、5.62mg·g-1和0.208mg·g-1，黑色種子幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量在高Cd含量（0.8mg·kg-1）時較對照增加了0.63、1.90mg·g-1和0.132mg·g-1（圖3A-圖3C）。鹽地堿蓬幼苗葉片可溶性物質(zhì)含量均隨Cd含量增加而增加，且棕色種子幼苗可溶性物質(zhì)含量明顯高于黑色種子幼苗，各處理間的差異達(dá)到顯著水平（Plt;0.05）。

鹽地堿蓬二型種子幼苗葉片SOD、POD和CAT比活力隨著Cd含量的增加均呈降低的趨勢（圖3D-圖3F）。與對照相比，鹽地堿蓬二型種子幼苗葉片SOD、POD和CAT比活力在Cd脅迫下均達(dá)到顯著差異水平（Plt;0.05）。在Cd含量為0.8mg·kg-1時，棕色種子幼苗葉片SOD、POD和CAT比活力分別比對照組降低77.38%、65.69%和78.47%，而黑色種子幼苗葉片SOD、POD、CAT比活力降低幅度分別為29.59%、31.33%和35.12%。

2.3 Cd脅迫下鹽地堿蓬各器官Cd的積累分配規(guī)律

如圖4所示，隨著Cd含量的增加，鹽地堿蓬種子幼苗根、莖、葉中Cd含量呈上升趨勢，且各處理間的差異均達(dá)到顯著水平。在0.8mg·kg-1 Cd處理時，與莖和葉中Cd含量相比，棕色種子幼苗根部Cd含量分別顯著增加了105.34%和25.51%，黑色種子幼苗根部Cd含量分別顯著增加了103.47%和10.51% （Plt;0.05），表明根系是鹽地堿蓬Cd富集的重要器官，這在一定程度上可以減少地上部Cd含量。在不同Cd含量處理下，棕色種子幼苗根、莖和葉中Cd累積量均高于黑色種子幼苗，在0.8mg·kg-1Cd處理時，棕色種子幼苗根、莖和葉中Cd含量相較于黑色種子幼苗分別增加了23.33%、22.10%和8.56%。

3討論

植物的形態(tài)特征是響應(yīng)環(huán)境變化的重要指標(biāo)，具有極強的敏感性和可塑性。本研究中，Cd脅迫下黑色種子幼苗株高和鮮質(zhì)量較棕色種子幼苗降低更為明顯（圖2A和圖2B）。植物通過調(diào)節(jié)生物量分配模式來提高其生態(tài)適應(yīng)性和競爭能力。隨著Cd含量的升高，黑色種子幼苗的根、莖、葉生物量相較于棕色種子幼苗均下降得更為顯著（圖2D～圖2F）。本研究中，棕色種子幼苗的根冠比明顯高于黑色種子幼苗的，且隨著Cd脅迫增加出現(xiàn)了先上升后降低的趨勢（圖2C）。重金屬脅迫下，植物通過擴大根系規(guī)模來吸收營養(yǎng)元素。因此，Cd脅迫下鹽地堿蓬棕色種子幼苗根系伸長生長導(dǎo)致了較高的根冠比。研究人員在對黑麥草（Lolium）和臺灣榿木（Alnus formo-sana）的研究中也發(fā)現(xiàn)了與本研究一致的結(jié)果。

遭受重金屬脅迫時，植物細(xì)胞產(chǎn)生的過量的活性氧自由基會對細(xì)胞膜產(chǎn)生氧化損傷，而抗氧化酶（SOD、POD和CAT）共同組成調(diào)控活性氧平衡的抗氧化酶系統(tǒng)，其中SOD是清除過量活性氧的第一道防線，可將毒性較強的超氧陰離子自由基歧化為毒性較弱的過氧化氫和基態(tài)氧，避免生成毒性更強的羥自由基，POD和CAT則進一步將過氧化氫分解為水，從而減輕過量活性氧對植物的損傷。鹽地堿蓬二型種子幼苗葉片SOD、POD和CAT比活力均在高含量Cd脅迫時低于對照（圖3D-圖3F），這與刺槐（Black lo-cust）幼苗葉片細(xì)胞抗氧化酶變化結(jié)果一致，說明鹽地堿蓬幼苗體內(nèi)超氧陰離子自由基和過氧化氫的水平超過了抗氧化酶的清除能力，其對葉片細(xì)胞的毒害作用開始顯現(xiàn)，抗氧化酶的合成受到抑制，導(dǎo)致活性下降。同時，棕色種子幼苗抗氧化酶的比活力高于黑色種子幼苗，這可能是鹽地堿蓬棕色種子幼苗具有較強的Cd耐性。綜合本研究和其他研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在重金屬脅迫下，植物抗氧化酶比活力的變化有一定的閾值范圍，說明植物的抗氧化能力有限，還需要其他解毒機制參與其中。

在遭受重金屬脅迫時，植物細(xì)胞合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白、可溶性糖及游離脯氨酸），調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢，維持細(xì)胞正常的生理代謝能力?？扇苄蕴鞘侵参飪Υ婺芰康闹饕问?，植物在抵御重金屬毒害的過程中需要消耗大量的能量，這是鹽地堿蓬幼苗響應(yīng)Cd脅迫的主要生理策略之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd含量的增加，鹽地堿蓬棕色種子幼苗可溶性糖含量上升且高于黑色種子，這與蘇芳莉等研究鹽地堿蓬幼苗響應(yīng)重金屬脅迫結(jié)果一致。Cd脅迫下鹽地堿蓬種子幼苗葉片可溶性蛋白含量較對照增加，表明鹽地堿蓬種子通過提高體內(nèi)可溶性蛋白含量以保護自身免遭Cd脅迫的毒害，這與銀灰楊幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量變化結(jié)果一致，這種生理響應(yīng)可以在一定程度上減低Cd的毒害作用?？扇苄缘鞍踪|(zhì)可以與液泡中離子態(tài)金屬結(jié)合形成螯合物，從而減緩重金屬離子對細(xì)胞的毒害。Cd可以結(jié)合的可溶性蛋白有谷胱甘肽（GSH）、植物螯合肽（PCs）和金屬硫蛋白（MTs）等。此外，2種鹽地堿蓬種子幼苗葉片脯氨酸的累積均被激活，在清除活性氧自由基等方面發(fā)揮了重要作用，一定程度上緩解了Cd脅迫造成的氧化損傷。芥菜（Bras.sica juncea）幼苗對Cd脅迫響應(yīng)研究中也觀察到類似的結(jié)果，但植物誘導(dǎo)脯氨酸積累的能力是有限的，Cd脅迫下鹽地堿蓬黑色種子幼苗葉片的脯氨酸含量逐漸減少且低于棕色種子幼苗，說明棕色種子幼苗有著更強的自我保護能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，鹽地堿蓬二型種子幼苗根系Cd含量最高（圖4），其次是葉和莖，這與重金屬離子在箭葉雨久花（Monochoria ha.stata）及秋華柳（Salix varie-gate）等水生植物中的分布規(guī)律相一致。Cd進入植物根部后，難以被轉(zhuǎn)移到地上部，原因是Cd為植物的非必需元素，植物體內(nèi)沒有專門負(fù)責(zé)其遷移的轉(zhuǎn)運蛋白和相應(yīng)通道，故多數(shù)Cd離子滯留在植物根部，以減緩Cd對葉片的毒害作用。應(yīng)用于土壤修復(fù)實踐時可直接通過收割植物進行焚燒處理，一方面可提高經(jīng)濟效益，另一方面便于集中處理含大量重金屬Cd的灰渣。通過Cd積累、植物生長與酶活性等生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析（圖5），發(fā)現(xiàn)鹽地堿蓬幼苗根、莖和葉Cd含量與葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量之間存在顯著正相關(guān)性（Plt;0.01），鹽地堿蓬幼苗株高和根生物量與葉片SOD、POD和CAT活性之間存在顯著正相關(guān)性（Plt;0.05），鹽地堿蓬幼苗株高、鮮質(zhì)量和根生物量與葉片可溶性蛋白含量之間存在顯著負(fù)相關(guān)性（Plt;0.05）。

4結(jié)論

（1）Cd脅迫對黑色鹽地堿蓬種子幼苗株高、鮮質(zhì)量和根冠比的抑制作用大于棕色種子幼苗，鹽地堿蓬幼苗均優(yōu)先增加葉片生物量，Cd脅迫下棕色種子幼苗的根、莖、葉生物量總體高于黑色種子幼苗的。

（2）鹽地堿蓬棕色種子葉片的SOD、POD和CAT對Cd脅迫的抗氧化響應(yīng)強于黑色種子幼苗的，棕色種子幼苗的可溶性蛋白和游離脯氨酸含量對Cd脅迫的響應(yīng)程度強于黑色種子幼苗的，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮積極作用以減緩重金屬對細(xì)胞的毒害效應(yīng)。

（3）鹽地堿蓬棕色種子幼苗的根、莖、葉中Cd含量均高于黑色種子幼苗的，且根系為鹽地堿蓬Cd富集的重要部位。鹽地堿蓬Cd累積與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量之間呈正相關(guān)（Plt;0.01），植物生長與抗氧化酶活性之間呈正相關(guān)（Plt;0.05）。

（4）棕色種子的抗Cd脅迫能力整體高于黑色種子的，鹽地堿蓬棕色種子幼苗有較好的Cd污染鹽土修復(fù)能力。