一體化QuEChERS凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中27種吡咯里西啶類生物堿

摘要：針對茶葉中吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）的殘留風(fēng)險，并為進(jìn)一步提高傳統(tǒng)QuEChERS的檢測效率，研究建立使用一體化QuEChERS凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定茶葉中27種PAs的檢測方法。該方法中的試樣經(jīng)1%甲酸乙腈提取，使用離心管一體鹽包鹽析和下壓式QuEChERS凈化，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，27種PAs在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為73.0%～111.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～13.8%（n=6）。該方法具有操作簡單、檢測通量大、靈敏度高、減少傳統(tǒng)QuEChERS反復(fù)開蓋等特點，能夠滿足茶葉中PAs的監(jiān)測需求。對實際60批次茶葉樣品進(jìn)行檢測，部分茶葉樣品分別檢出了不同含量的PAs，證明茶葉中有殘留該類植物毒素的風(fēng)險，建議持續(xù)跟蹤監(jiān)測。

關(guān)鍵詞：茶葉；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；QuEChERS；吡咯里西啶類生物堿

中圖分類號：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-369X（2024）05-831-12

Simultaneous Determination of 27 Pyrrolizidine Alkaloids in Tea by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Integrated QuEChERS Purification

YAO Leijun1，2，3，4， CHEN Yanqiu1，2，3，4， LIN Hao1，2，3，4， WANG Luyao1，2，3，4， SHI Peiyu1，2，3，4，

ZHANG Yangyang1，2，3，4， HUANG Ting1，2，3，4， SONG Juan1，2，3，4 ， WANG Yi1，2，3，4，

DAI Qin1，2，3，4*， LIU Chuan1，2，3，4*

1. Chengdu Institute of Food Inspection， Chengdu 611130， China; 2. Key Laboratory of Monitoring and Assessment on Novel Food Raw Materials， State Administration for Market Regulation， Chengdu 611130， China; 3. Key Laboratory of Chemical Metrology and Applications on Nutrition and Health， State Administration for Market Regulation， Beijing 100029， China; 4. Irradiation Preservation Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 611130， China

Abstract： In this study， an integrated QuEChERS purification-ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was established to detect 27 pyrrolizidine alkaloids （PAs） in tea， taking into account the residual risk of PAs in tea and the challenges of traditional QuEChERS. The method involves extracting the sample with 1% formic acid in acetonitrile， salting out using the centrifuge tube integrated salt bag and Down-Pressure QuEChERS Cleanup， detecting by multiple reaction monitoring mode （MRM）， and quantifying it using the matrix-matched external standard method. The 27 PAs exhibit a strong linear relationship within their concentration ranges， with average recovery rates ranging from 73.0% to 111.8% and relative standard deviations from 1.6% to 13.8% （n=6）. This method has the characteristics of simple operation， large detection throughput， high sensitivity， and reduction of repeated opening of the traditional QuEChERS， meeting the monitoring requirements for PAs in tea. During the actual testing of 60 batches of samples， different levels of PAs were detected in some tea samples， proving that there is indeed a risk of these plant toxins in tea， and continuous monitoring and tracking is recommended.

Keywords： tea， UPLC-MS/MS， QuEChERS， pyrrolizidine alkaloids

茶葉及其制品作為一種在國內(nèi)具有較大消費量和出口量的特殊食品類型[1]，有關(guān)其農(nóng)藥殘留、重金屬、產(chǎn)地溯源等方面的質(zhì)量安全與品質(zhì)研究一直具有較高的關(guān)注度[2]。吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）為一類具有雙稠吡咯啶結(jié)構(gòu)的生物堿，廣泛分布于紫草科、豆科、菊科等植物中，對人體肝臟、腎臟、胚胎等具有明顯的毒性，甚至可致畸、致突變、致癌等，因此部分國家和組織均對食品中PAs的殘留給予了高度關(guān)注[3-4]。以歐盟為例，其對茶葉中的PAs殘留限量為150 μg·kg-1（21種PAs的殘留量總和），并長期在歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)（Rapid alert system for food and feed，RASFF）中發(fā)布有關(guān)茶葉及其制品中檢出高含量PAs的通報，而中國作為茶葉消費大國，目前尚未對茶葉中該類物質(zhì)的殘留制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]。

茶葉中殘留PAs的主要原因有兩方面，其一是茶葉生長環(huán)境部分雜草中含有PAs，其在伴隨茶葉采摘過程中造成茶葉污染[6-7]；其二是茶園中土壤、水分等中的部分PAs被茶樹吸收，造成茶葉的污染[8-9]。另外，茶葉中的PAs在沖泡過程中會轉(zhuǎn)移至水中，這進(jìn)一步增加了人體受Pas危害的風(fēng)險[10]。且研究表明，PAs的部分氮氧化物的毒理學(xué)活性與PAs相當(dāng)，應(yīng)受到同等重視[11]。由此可見，茶葉中PAs的殘留具有一定的隨機性和偶然性，需要對茶葉中PAs殘留持續(xù)監(jiān)控。

目前，利用硫酸水溶液提取，MCX小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析是植物源性食品中PAs殘留檢測的主流方案。基于該種技術(shù)背景下，茶葉中的PAs殘留被不斷檢出并顯示潛在的食品安全風(fēng)險，同時由于部分PAs為同分異構(gòu)體且理化性質(zhì)接近，導(dǎo)致部分PAs的色譜分離度較差[12-14]。針對PAs種類和同分異構(gòu)體較多的情況，Rizzo等[8]利用高分辨質(zhì)譜完成了118種PAs及其類似物的快速篩查，為該類未知化合物的定性、預(yù)測、解析提供了思路；而張新娜等[15]則利用QuEChERS法完成了甘草中多種PAs的風(fēng)險評估，在證明該類化合物在部分藥材中殘留的同時為利用QuEChERS提取凈化該類物質(zhì)提供了參考。QuEChERS法可有效凈化茶葉中多種色素、有機酸等物質(zhì)，已經(jīng)在茶葉中農(nóng)藥殘留、污染物檢測方面具有較為廣泛的應(yīng)用[7，16-17]。

本研究立足茶葉中PAs殘留的現(xiàn)狀并針對傳統(tǒng)QuEChERS需要反復(fù)開蓋、過程繁瑣的缺陷，力求結(jié)合現(xiàn)有成品方案建立更為簡便的一體化QuEChERS凈化，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定27種PAs的檢測方法，提高茶葉中PAs殘留的監(jiān)測水平，提升茶葉品質(zhì)并助力茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

含石松胺（Lycopsamine）、石松胺氮氧化物（Lycopsamine N-oxide）、倒千里光堿氮氧化物（Retrorsine N-oxide）、藍(lán)薊定氮氧化物（Echimidine N-oxide）、歐天芥菜堿（Europine）、歐天芥菜堿氮氧化物（Europine N-oxide）、春千里光堿氮氧化物（Senecivernine N-oxide）、克氏千里光堿（Senkirkine）、促黑激素（Intermedine）、芝麻菜葉千里光堿氮氧化物（Erucifoline N-oxide）、野百合堿（Monocrotaline）、野百合堿氮氧化物（Monocrotaline N-oxide）、促黑激素氮氧化物（Intermedine N-oxide）、倒千里光堿（Retrorsine）、毛束草堿（Trichodesmine）、千里光菲林堿（Seneciophylline）、千里光菲林堿氮氧化物（Seneciophylline N-oxide）、天芥菜堿（Heliotrine）、天芥菜堿氮氧化物（Heliotrine N-oxide）、千里光寧堿（Senecionine）、千里光寧堿氮氧化物（Senecionine N-oxide）、藍(lán)薊定（Echimidine）、毛果天芥菜堿（Lasiocarpine）、毛果天芥菜堿氮氧化物（Lasiocarpine N-oxide）、夾可靈（Jacobine）、夾可靈氮氧化物（Jacobine N-oxide）、春千里光堿（Senecivernine）等27種吡咯里西啶生物堿的甲醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，購自天津阿爾塔科技有限公司，濃度均為100 μg·mL-1。

甲酸、甲醇、乙腈（色譜純）購自德國Merck公司；鹽包一體化離心管（6 g硫酸鎂/1.5 g乙酸鈉）購自山東青云化學(xué)科技有限公司；一體化下壓式QuEChERS凈化柱（900 mg硫酸鎂/400 mg C18/400 mg PSA/120 mg GCB/200 mg POLY）購自天津安邦鍵合科技有限公司。試驗用水符合GB/T 6682—2008實驗室一級用水要求。

本研究過程中所用60份茶葉樣品均為市購，采購地點為成都市。

1.2 儀器與設(shè)備

ACUITY I-Class-Triple Q 5500超高效液相色譜-串聯(lián)串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司、美國SCIEX公司）；Centrifuge 5810 R高速離心機（德國Eppendorf公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；BP211D型天平（德國Sartorius公司）；ME203型天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

提?。悍Q取粉碎后充分混勻的樣品2 g（精確至0.01 g）置于50 mL鹽包一體化離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置30 min。加入10 mL 1%甲酸乙腈，蓋上離心管蓋，1 500 r·min-1渦旋振蕩2 min。

凈化：按下鹽包釋放按鈕，將鹽包釋放至提取溶液中，劇烈振搖離心管使提取溶液中水層與有機溶劑層分離，4 000 r·min-1離心2 min并棄去離心管蓋。將一體化下壓式QuEChERS凈化柱垂直安裝于離心管口，緩慢按壓凈化柱，使上層有機溶劑通過填料區(qū)進(jìn)入凈化溶液腔。準(zhǔn)確吸取5 mL凈化溶液至刻度氮吹管中，于40 ℃條件下氮吹至近干，使用初始流動相定容至2 mL，待測。整個提取凈化流程見圖1。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取100 μL 27種吡咯里西啶生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻得到27種吡咯里西啶生物堿質(zhì)量濃度均為1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

稱取多份陰性茶葉樣品，參照1.3.1章節(jié)所述方法制備空白基質(zhì)溶液，分別吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用空白基質(zhì)溶液進(jìn)行稀釋，配制基質(zhì)匹配工作曲線溶液。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC HSS C18柱（3.0×150 mm，1.7 μm）；流動相A為5 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），流動相B為甲醇溶液；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序：0～2.0 min，85%流動相A；2.0～13.0 min，85%～60%流動相A；13.0～15.0 min，60%～5%流動相A；15.0～18.0 min，5%流動相A；18.0～18.5 min，5%～95%流動相A；18.5～20.0 min，95% 流動相A。

離子源類型為ESI源，氣簾氣（氮氣）流速35 psi；噴霧氣（氮氣）流速55 psi；輔助加熱氣（氮氣）流速55 psi；離子源溫度400 ℃；離子化電壓5 000 V；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式，監(jiān)測離子對和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)計算方法

考察檢測茶葉中27種PAs時基質(zhì)效應(yīng)強弱，以曲線斜率計算基質(zhì)效應(yīng)（ME），具體方法見公式（1）。

式中：k1為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；k2為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在流動注射方式下，分別對27種PAs化合物進(jìn)行一級全掃描，確定各化合物的正負(fù)離子采集模式和離子加和模式。結(jié)果表明，所有化合物在正離子模式下均具有較為良好的響應(yīng)，且[M+H]+母離子的響應(yīng)最高。在確定各化合物最佳母離子的情況下，對其進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，選擇響應(yīng)相對較高、專屬性較強的2個子離子建立多反應(yīng)監(jiān)測通道（MRM）并完成去簇電壓和碰撞電壓優(yōu)化。同時在接入流動相后繼續(xù)優(yōu)化氣簾氣、噴霧氣、輔助加熱氣、離子源溫度、離子化電壓等離子源條件。

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于本研究中27種PAs和氮氧化物中存在多組同分異構(gòu)體，特別是石松胺和促黑激素、石松胺氮氧化物和促黑激素氮氧化物、千里光寧堿和春千里光堿、春千里光堿氮氧化物和千里光寧堿氮氧化物化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，且子離子相同，在使用ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱時，需要較嚴(yán)苛的色譜條件和梯度才能將化合物完全分離。因此，本次研究中選擇ACQUITY UPLC HSS C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，以甲醇、乙腈作為有機相，0.1%甲酸水、5 mmol·L-1乙酸銨（0.1%甲酸）水溶液作為水相進(jìn)行交叉搭配，以優(yōu)化流動相種類和梯度。最終選擇甲醇作為有機相、5 mmol·L-1乙酸銨（0.1%甲酸）水溶液作為水相進(jìn)行色譜分離，按照1.3.3章節(jié)描述的條件對27種PAs進(jìn)行掃描監(jiān)測，總離子流圖見圖2。如圖3所示，通過優(yōu)化梯度條件，以上同分異構(gòu)體能夠?qū)崿F(xiàn)完全分離。

2.3 提取條件優(yōu)化

針對茶葉中PAs提取方法，本研究參考文獻(xiàn)[16，18-19]，結(jié)合PAs類化合物多為生物堿類化合物的性質(zhì)，使用有機溶劑或酸化有機溶劑提取其效果相對較好。因此主要對提取溶液的酸化程度進(jìn)行考察，通過比較乙腈（Acetonitrile，ACN）、0.2%甲酸乙腈（0.2% Formic acid-acetonitrile，0.2% FA）、0.5%甲酸乙腈（0.5% Formic acid-acetonitrile，0.5% FA）、1%甲酸乙腈（1% Formic acid-acetonitrile，1% FA）、2%甲酸乙腈（2% Formic acid-acetonitrile，2% FA）和5%甲酸乙腈（5% Formic acid-acetonitrile，5% FA）的提取效率，確定最優(yōu)提取方法。結(jié)果顯示，隨著乙腈的酸度增加，提取溶液顏色加深，可能是酸度提高后增加了更多色素等物質(zhì)的溶出效率（圖4）。如圖4所示，27種PAs在不同溶劑下的提取效率差異較大，其中石松胺、石松胺氮氧化物、倒千里光堿氮氧化物、藍(lán)薊定氮氧化物、歐天芥菜堿、

歐天芥菜堿氮氧化物、春千里光堿氮氧化物等化合物提取效率隨著酸度增強而提高，并在1%甲酸乙腈下達(dá)到最大提取率，隨后酸度增加并未進(jìn)一步提高提取效率；天芥菜堿、毛果天芥菜堿、夾可靈等化合物其提取效率在1%甲酸乙腈附近達(dá)到最高，繼續(xù)提高酸度則提取效率出現(xiàn)下降；毛果天芥菜堿氮氧化物和千里光寧堿兩種化合物其提取效率一直低于30%。該類化合物在不同提取溶劑下展現(xiàn)出的提取效率差異，極有可能與茶葉中被提取出的各種有機酸、色素等導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)。本研究綜合27種PAs的提取效率，選取1%甲酸乙腈作為提取溶劑，并對可能的影響因素繼續(xù)考察。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

由于茶葉中有大量的色素、脂質(zhì)、有機酸等干擾的存在，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測量時常會產(chǎn)生不同程度的基質(zhì)效應(yīng)。為進(jìn)一步提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究對測定過程中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評估[20-21]。分別稱取適量份數(shù)的陰性茶葉樣品，按照1.3.1章節(jié)獲取空白基質(zhì)溶液。分別使用空白基質(zhì)溶液和甲醇＋5 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸）水溶液（1＋1）將混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，按1.3.4章節(jié)描述的方法計算27種PAs的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果如圖5所示，幾乎所有的PAs都表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)效應(yīng)，特別是毛果天芥菜堿氮氧化物和千里光寧堿兩種化合物，其基質(zhì)效應(yīng)均為﹣70%以上，這與在進(jìn)行提取溶劑優(yōu)化過程中展現(xiàn)的提取效率關(guān)系相符。且在茶葉中部分其他物質(zhì)的檢測過程中所展現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)與PAs所展現(xiàn)的情況相符合[20]，因此為提高所測全部化合物的準(zhǔn)確性，本研究將采用空白基質(zhì)匹配外標(biāo)法進(jìn)行27種PAs的定量分析。同時由于本研究選取了成品的QuEChERS凈化產(chǎn)品，其配方較為固定，后續(xù)研究中可繼續(xù)優(yōu)化配方，降低基質(zhì)效應(yīng)對檢測帶來的干擾。

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量限

分別吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于不同的10 mL容量瓶中，用陰性（未檢出27

種PAs）茶葉樣品按照1.3.1章節(jié)所制備的空白基質(zhì)溶液定容至刻度，搖勻，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，不同化合物的線性范圍與相關(guān)系數(shù)見表2。

采取在陰性茶葉樣品中逐級稀釋加標(biāo)濃度的方式確定27種PAs的檢出限和定量限。同時在陰性茶葉樣品中加入檢出限和定量限水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.3.1章節(jié)和1.3.3章節(jié)的方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，檢出限水平的各化合物定性離子對、定量離子對信噪比均大于3；定量限水平的各化合物定性離子對、定量離子對信噪比均大于10，相關(guān)結(jié)果見表2。該方法具有較高的靈敏度，能夠滿足所測化合物的檢測需求。

2.6 方法回收率與精密度

依據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》進(jìn)行本方法的回收率和精密度評價[22]，稱取陰性茶葉樣品，按照定量限、二倍定量限和十倍定量限進(jìn)行3水平添加試驗（n=6），按照1.3.1章節(jié)和1.3.3章節(jié)描述的方法進(jìn)行樣品處理和檢測，考察方法的回收率和精密度。如表3所示，本方法的平均回收率在73.0%～111.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）在1.6%～13.8%，具有較高的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。

2.7 實際樣品測試

采用本方法對購自成都市場的60份茶葉樣

品進(jìn)行目標(biāo)物監(jiān)測。其中A號樣品中檢出石松胺（1.2 μg·kg-1）、夾可靈氮氧化物（2.4 μg·kg-1）和春千里光堿（0.5 μg·kg-1），B號樣品中檢出藍(lán)薊定氮氧化物（0.5 μg·kg-1）、克氏千里光堿（6.8 μg·kg-1）、千里光菲林堿（0.8 μg·kg-1）、千里光菲林堿氮氧化物（5.1 μg·kg-1）、千里光寧堿（6.6 μg·kg-1）和千里光寧堿氮氧化物（18.5 μg·kg-1），B號樣品中PAs的總量相對較高。以上監(jiān)測的含量水平與國內(nèi)部分區(qū)域的監(jiān)測結(jié)果基本相當(dāng)[14]，以歐盟對該類化合物51jJnoSZzvBuImwuwWoj/XhA2DhXm+86neMJrlyVcHw=的限量水平為參考，其依然處于安全的含量水平。有關(guān)PAs與地域、時節(jié)、工藝等因素的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究和跟蹤評價。

3 結(jié)論

針對茶葉易殘留吡咯里西啶類生物堿的食品安全風(fēng)險，本研究成功開發(fā)了靈敏度高、專屬性強、檢測效率高的分析方法，為持續(xù)檢測該類物質(zhì)的殘留提供了技術(shù)支撐。在該過程中通過優(yōu)化色譜條件實現(xiàn)了多對同分異構(gòu)體的有效分離。同時針對傳統(tǒng)QuEChERS凈化方法在大批量檢測過程中反復(fù)開蓋導(dǎo)致檢測效率偏低的技術(shù)性難題，通過將離心管蓋一體化鹽包和下壓式QuEChERS凈化相結(jié)合的方式，明顯減少了開關(guān)蓋次數(shù)，優(yōu)化了前處理的操作步驟，提高了使用QuEChERS應(yīng)對大批量樣品時的檢測效率，為QuEChERS方法的持續(xù)改進(jìn)、深入優(yōu)化提供了新思路。同時實際樣品測試表明部分茶葉中確實殘留PAs類化合物，建議對該類化合物持續(xù)監(jiān)控，制定我國對茶葉中該類物質(zhì)的檢測標(biāo)準(zhǔn)和限量值標(biāo)準(zhǔn)。

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