腸腎蟲感染的黑斑蛙外周血血細胞指標變化

摘要：黑斑蛙具有極高生態(tài)價值和經(jīng)濟價值，也是我國近年來養(yǎng)殖蛙類的主要品種之一。腸腎蟲是蛙類腸道內(nèi)常見的寄生蟲之一，本研究采用顯微鏡細胞計數(shù)、常規(guī)瑞氏染色的方法，對腸腎蟲感染的黑斑蛙外周血細胞的形態(tài)計量學、顯微結(jié)構(gòu)進行了研究。瑞氏染色顯示，寄生蟲感染對黑斑蛙血細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響。細胞計數(shù)顯示，感染組黑斑蛙紅細胞數(shù)量極顯著下降（P < 0.01），白細胞數(shù)量、血栓細胞數(shù)量顯著上升（P < 0.05）。白細胞分類計數(shù)表明，感染組與未感染組相比，淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)量極顯著上升（P < 0.01），單核細胞和嗜堿性粒細胞數(shù)量變化無統(tǒng)計學差異。根據(jù)本研究結(jié)果和已有的文獻報道，本研究認為嗜酸性粒細胞數(shù)量的變化可以作為黑斑蛙腸腎蟲感染檢測的重要指標。

關(guān)鍵詞：黑斑蛙；腸腎蟲；血細胞；白細胞比例

中圖分類號：Q958.9 文獻標志碼：A 文章編號：1001-2443（2024）04-0333-07

引言

外周血血液學參數(shù)常用于評價人和動物的健康及營養(yǎng)狀況，血液學檢查是一種低創(chuàng)傷的檢測技術(shù)［1］。紅細胞的數(shù)目變化可反映動物的營養(yǎng)和貧血狀況［2］。白細胞的數(shù)目及各種白細胞比例的變化常涉及機體在不同環(huán)境下的免疫反應，諸如應激［3］、炎癥反應［4］、寄生蟲感染［5］和細菌性感染性疾?。?］。血栓細胞在止血和凝血中起重要作用［ 7］，研究表明血栓細胞數(shù)量的變化與病原菌感染［6］、寄生蟲類感染［8］、環(huán)境狀況［9］等密切相關(guān)。

目前，有關(guān)寄生蟲引起的低等脊椎動物血細胞變化的病理學研究主要集中于魚類，如奧尼羅非魚（Oreochromis aureus×Oreochromis niloticus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、黃鱔（Monopterusalbus）等［10-12］。對兩棲動物腸道中寄生蟲感染所致病變時其血液學參數(shù)變化的研究甚少，李朝波等對寄生蟲感染后黑斑蛙腸道組織的病理變化進行了觀察［13］，但未涉及外周血血細胞指標的檢測。

黑斑蛙（Rana nigromaculate）是蛙科、側(cè)褶蛙屬的兩棲動物，在我國分布很廣，是農(nóng)田蛙類的優(yōu)勢種，因其肉質(zhì)細嫩、脂肪少、糖分低、蛋白質(zhì)含量高等優(yōu)點而深受消費者喜愛［14］。目前，黑斑蛙養(yǎng)殖已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中快速興起的一個養(yǎng)殖項目，然而各種疾病尤其是寄生蟲病嚴重阻礙著蛙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，腸腎蟲是黑斑蛙腸道內(nèi)常見的寄生蟲之一［15］，本研究采用瑞氏染色、細胞計數(shù)對上述寄生蟲感染的黑斑蛙外周血細胞顯微結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量變化進行了研究，以探索寄生蟲對黑斑蛙外周血細胞數(shù)目和比例的影響，為黑斑蛙養(yǎng)殖中寄生蟲病的診斷和防治提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的采集

本實驗所用黑斑蛙均購買自蕪湖縣朗田黑斑蛙養(yǎng)殖專業(yè)合作社，選用了20只成年黑斑蛙（10只腸道寄生蟲感染和10只健康蛙），健康成年黑斑蛙平均體重為37.33±10.93g，平均體長為7.74±0.93 cm，寄生蟲感染黑斑蛙平均體重為24.28±2.14 g，平均體長為6.61±0.17 cm。購買后，在實驗室的水箱中靜養(yǎng)一天，排除黑斑蛙的應激反應（水箱長寬高分別是52 cm、37 cm和32 cm）。

1.2 血涂片的制備

首先對正常蛙進行外形觀察，確定實驗所用正常蛙表面無傷且活躍，外觀上看（體型較小且消瘦）可能被寄生蟲感染的黑斑蛙毀髓后取其靠近肛門處1 cm的直腸制片，并在基恩士VHX-5000顯微鏡下鏡檢，確定寄生蟲的存在（主要是腸腎蟲）。用干凈紗布將蛙體表擦干，用雙毀髓法致癱，立即測量體長并稱重，隨即打開黑斑蛙心腔，使用無菌的5 ml注射器和22 G針頭抽取血液樣本，避免凝血，需采用K2-EDTA作為抗凝劑，采血后立即制備血涂片，晾干備用。

1.3 瑞氏染色

將干燥后的血涂片水平放在濕盒中，滴加600 μL的瑞氏染液至完全覆蓋血涂片，等待30 s，再滴加等量的磷酸鹽緩沖液與瑞氏染液混合，并用洗耳球吹勻覆蓋整個血涂片，等待10 min。10 min后染色完成，將血涂片上的染液在流動的蒸餾水下沖洗干凈，注意流速緩慢，防止血細胞脫落，最后在室溫下再次風干，滴加香柏油在Olympus BX61顯微鏡下進行鏡檢拍照。

1.4 血細胞計數(shù)

用移液槍吸取995 μL的血細胞稀釋液放入EP管中，將5 μL的黑斑蛙血液樣本加入其中并打勻，使黑斑蛙血液樣本稀釋200倍，便于細胞計數(shù)。取干燥潔凈的血球計數(shù)板平放于實驗臺上，蓋上20 mm*20 mm的蓋玻片，在蓋玻片邊緣一角滴加剛混勻的血液樣本。待血液樣本擴散到整個血球計數(shù)板時，拿到顯微鏡下觀察計數(shù)。每個黑斑蛙樣本數(shù)三次，按照公式即得血細胞總數(shù)TBC（個/mL）=N×25×104×200（N為血球計數(shù)板五個中方格里血細胞的平均數(shù)目）。

在Olympus BX61顯微鏡下隨機拍攝20張細胞照片，計算出紅細胞、白細胞和血栓細胞的比例，再根據(jù)上述得到的血細胞總數(shù)計算出紅細胞數(shù)目（RBC）、白細胞數(shù)目（WBC）和血栓細胞數(shù)目（TC）。每只黑斑蛙的血液樣品在顯微鏡下隨機選取1000個白細胞，根據(jù)白細胞形態(tài)及著色差異區(qū)分不同類型的白細胞并統(tǒng)計出各種白細胞的百分比。

1.5 統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS Statistics 26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行T檢驗，得到的數(shù)據(jù)用平均值（Mean）±標準差（SD）表示，P < 0.05表示感染蛙與未感染蛙存在顯著差異（*），P < 0.01表示感染蛙與未感染蛙存在極顯著差異（**）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑斑蛙腸腎蟲感染情況

感染蛙（圖1 A）食欲下降，體形消瘦，與正常蛙（圖1 B）相比平均體重輕34.96％，體長比正常蛙短14.60％。

取蛙靠近肛門處1 cm的直腸進行鏡檢，將直腸黏膜制成活體鋪片顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸腎蟲感染的黑斑蛙在200倍下一個視野內(nèi)蟲體達4～6只（圖1 C），正常蛙直腸中未見腸腎蟲感染（圖1 D）。

2.2 黑斑蛙外周血血細胞的顯微結(jié)構(gòu)

2.2.1 紅細胞 在光鏡下，紅細胞表面比較光滑，成熟紅細胞多為橢圓形，細胞核為橢圓形，位于細胞的中央，染色質(zhì)致密，被染成紫紅色，細胞質(zhì)被染成粉紅色（圖2A）。還能觀察到梨形紅細胞，可能是剛經(jīng)過無絲分裂形成的，核質(zhì)的比例較大（圖2B）。

2.2.2 白細胞 顯微鏡下白細胞可分為嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞。嗜酸性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)有橘紅色的圓形顆粒，且顆粒較大，常遮蓋住核，核常呈啞鈴型或眼鏡形（圖2C）。嗜堿性粒細胞胞核較大，常偏位，在核一側(cè)有許多被染成紫紅色或深紫色的顆粒（圖2D）。嗜中性粒細胞胞質(zhì)呈藍色，染色均勻較淺，核有單葉核和多葉核之分，多葉核一般分兩到三葉，各葉的大小和形狀常不規(guī)則（圖2E）。單核細胞細胞核呈腎形或馬蹄形，細胞質(zhì)被染成淺藍色，內(nèi)有大小不等的空泡（圖2F）。淋巴細胞可分為大淋巴細胞和小淋巴細胞，并且小淋巴占多數(shù)。小淋巴細胞胞體較小，胞質(zhì)極少，被染成藍色，部分胞質(zhì)邊緣伸出許多微絨毛突起（圖2G）。

2.2.3 血栓細胞 血栓細胞數(shù)量較少，表面較光滑，多呈紡錘形或長梭形，核染色質(zhì)密集，呈深紫紅色，胞質(zhì)接近無色（圖2H）。

通過顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，腸腎蟲感染對黑斑蛙血細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響。

2.3 黑斑蛙血細胞指標變化

通過細胞計數(shù)和統(tǒng)計，感染組和未感染組黑斑蛙紅細胞數(shù)、各種白細胞數(shù)、血栓細胞數(shù)列入表1，感染組紅細胞數(shù)量與未感染組相比極顯著下降（P < 0.01），感染組白細胞數(shù)量與未感染組相比極顯著上升（P < 0.01），感染組血栓細胞數(shù)量與未感染組相比顯著上升（P < 0.05）。不同白細胞所占的百分比及數(shù)量如表1所示，黑斑蛙中最豐富的白細胞是淋巴細胞，依次是單核細胞、嗜中性粒細胞和噬酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞最少。對白細胞的分類計數(shù)表明，感染組嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)量極顯著增加（P < 0.01），單核細胞、嗜堿性粒細胞數(shù)量無顯著變化。

3 討論

3.1 紅細胞數(shù)量變化

紅細胞的主要功能是通過細胞內(nèi)的血紅蛋白來運輸氧氣和二氧化碳，它是外周血最主要的細胞類型［16-17］，紅細胞數(shù)量也會因生理病理條件及生態(tài)環(huán)境的改變而變化［6，9］ 。兩棲動物對環(huán)境的變化較為敏感，能通過生理改變來適應環(huán)境［2］ 。本研究結(jié)果顯示，寄生蟲感染對黑斑蛙外周血血細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響，而感染組紅細胞計數(shù)極顯著小于未感染組（P < 0.01）。Azevedo等研究發(fā)現(xiàn)車輪蟲感染的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）紅細胞數(shù)量有輕微下降，但差異不顯著［5］；Martins等發(fā)現(xiàn)被線蟲感染的大頭兔脂鯉（Leporinus macrocephalus）紅細胞計數(shù)無明顯變化［18］。此外，Tavares-Dias 等發(fā)現(xiàn)多子小瓜蟲感染的尼羅羅非魚（ Oreochromis niloticus）紅細胞數(shù)量極顯著降低［19］。本研究顯示的結(jié)果與Tavares-Dias 等的發(fā)現(xiàn)一致，這可能是因為部分寄生蟲感染會引起動物貧血［8，18-19］。

3.2 白細胞數(shù)量變化

白細胞的主要功能是殺滅病原體、清除過敏原，參與機體特異性和非特異性免疫防御反應［7］。蛙類外周血中一般可觀察到5種白細胞：嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞［2］。影響全血中白細胞計數(shù)水平的因素有環(huán)境狀況［9］、營養(yǎng)條件［20］、病原菌感染［6］和寄生蟲感染［10］。在本研究中，寄生蟲感染的黑斑蛙的白細胞計數(shù)極顯著高于未感染組，這與一些報道魚類寄生蟲感染后白細胞變化的結(jié)果相一致［8，12］。

嗜酸性粒細胞是外周血白細胞的一種，兩棲動物的嗜酸性粒細胞可觀察到偽足或絨毛狀突起，表明其具有運動和變形能力，具有對異物等病原體進行吞噬或吞飲的作用［7］。報道顯示，在寄生蟲感染時，嗜酸性粒細胞對小型寄生蟲具有吞噬作用，對大型寄生蟲的殺傷作用主要是通過嗜酸性粒細胞顆粒中的離子蛋白參與細胞毒作用［21］，另有研究表明：在寄生蟲感染尤其是蠕蟲感染時，宿主體內(nèi)嗜酸性粒細胞生成增加并遷移至感染部位殺傷蠕蟲，嗜酸性粒細胞還可調(diào)節(jié)宿主的免疫環(huán)境，參與蠕蟲所致的免疫損傷及組織修復［22］。Wiedemann等觀察到蠕蟲感染的小鼠血液中嗜酸性粒細胞的生成增多［23］，Martins等發(fā)現(xiàn)被線蟲感染的大頭兔脂鯉嗜酸性粒細胞百分比顯著升高［18］，這樣的結(jié)果在鱊頭槽縧蟲寄生的鯉魚（C. carpio） ［24］和感染委內(nèi)瑞拉類圓線蟲的小鼠［25］中同樣被報道了，而本研究結(jié)果也顯示感染組與未感染組相比嗜酸性粒細胞的數(shù)目極顯著上升（P < 0.01），因此我們認為蛙類對抗寄生蟲感染時，嗜酸性粒細胞同樣發(fā)揮了重要作用。

嗜中性粒細胞具有明顯的運動和吞噬能力，因而具有較強的免疫抗病能力［8］。有報道表明在寄生蟲感染的過程中，嗜中性粒細胞一般是最活躍的白細胞之一， 例如感染隱藏新棘蟲和胃瘤線蟲的黃鱔， 隨著寄生蟲感染數(shù)量的增加， 其嗜中性粒細胞數(shù)量也隨之增加［12］。Azevedo等研究發(fā)現(xiàn)車輪蟲感染的尼羅羅非魚血液中嗜中性粒細胞百分比與對照組相比無顯著變化［5］，蔡心星等對多子小瓜蟲感染的草魚白細胞分類計數(shù)發(fā)現(xiàn)中性粒細胞分類計數(shù)極顯著下降，并認為可能由于淋巴細胞增殖太快造成中性粒細胞比例相對減少［11］，另有李利等研究表明車輪蟲感染的奧尼羅非魚血液中嗜中性粒細胞百分比極顯著高于未感染組，說明嗜中性粒細胞可能在抵御車輪蟲入侵中起著重要作用［10］，我們的結(jié)果與李利等一致，寄生蟲感染后，嗜中性粒細胞數(shù)量的增加可能與其在非特異免疫中參與機體的炎癥反應，大量吞噬異物，提高免疫力有關(guān)。

單核細胞有活躍的變形運動，明顯的趨化性和一定的吞噬功能［10］。在本研究中，黑斑蛙的單核細胞和淋巴細胞在白細胞中含量最高，這可能使其有較強的防御機制和免疫能力以更好地適應外界環(huán)境［8］。李利等研究了車輪蟲感染奧尼羅非魚的白細胞分類百分比變化，結(jié)果顯示單核細胞百分比比例減少［10］。Azevedo等對感染車輪蟲的尼羅羅非魚的血液學研究，結(jié)果表明患病魚的單核細胞百分比與對照組無顯著差異［5］。而本研究結(jié)果表明感染組單核細胞數(shù)量與未感染組相比無顯著差異，這與Azevedo等的研究結(jié)果一致，表明單核細胞在蛙類抗寄生蟲感染的過程中作用不明顯。

淋巴細胞屬于白細胞中的無粒細胞，在特異性免疫和非特異性免疫中都發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用，且其表面的突起可能與其免疫功能即抗原結(jié)合受體分子有關(guān)［26］。本研究顯示淋巴細胞是黑斑蛙白細胞數(shù)量中最多的，感染組淋巴細胞數(shù)量與未感染組相比極顯著上升（P < 0.01）。與我們的研究結(jié)果相反，Tavares-Dias 等對感染多子小瓜蟲的尼羅羅非魚的血液學研究，結(jié)果表明患病魚的淋巴細胞百分比減少［19］。Azevedo等研究發(fā)現(xiàn)車輪蟲感染的尼羅羅非魚血液中淋巴細胞百分比與對照組相比無顯著變化［5］。另有李利等研究了車輪蟲感染奧尼羅非魚的白細胞分類百分比變化，結(jié)果顯示感染組該魚血液中的淋巴細胞百分比極顯著升高［10］。我們的研究結(jié)果與李利等一致，造成這種結(jié)果的原因可能是感染蛙淋巴細胞受到抗原刺激作用參與機體的特異性免疫，表明淋巴細胞在蛙類抵御寄生蟲感染中占有重要地位。

兩棲動物的血栓細胞生理功能相當于哺乳動物的血小板，主要發(fā)揮止血凝血的作用［8］，有報道稱哺乳動物的血小板通過其表面膜上低親和力的特異性IgE的受體與IgE相互作用，這種IgE依賴的血小板活性可導致寄生蟲殺傷［27］。Omonona 和 Ekpenko對椎蟲寄生的歐洲林蛙（Rana temporaria）進行血液學計數(shù)，結(jié)果表明兩個地區(qū)的林蛙血栓細胞數(shù)量感染組與未感染組無顯著性差異［28］。李振偉等對咽碘泡蟲感染后患病中期的異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）血栓細胞數(shù)量計數(shù)，結(jié)果表明病魚的血栓細胞數(shù)量極著低于健康魚［8］。Abdel-Hafez等對感染多子小瓜蟲的圓鰭雅羅魚（Leuciscus cephalus）的血液學研究結(jié)果表明，感染魚內(nèi)血栓細胞的數(shù)量有所增加［29］。在本實驗中，感染組血栓細胞數(shù)量與未感染組相比顯著上升（P < 0.05），這可能與寄生蟲感染時血栓細胞的免疫功能有關(guān)，隨著寄生蟲侵染程度的加深，為了抵御腸腎蟲的脅迫，大量產(chǎn)生血栓細胞，提高免疫力。另有研究表明，黑斑蛙小腸中的寄生蟲對小腸壁造成嚴重的機械損傷，寄生蟲侵害部位周圍結(jié)締組織增生形成包囊［13］，這些病理反應也可能造成血栓細胞增多從而及時凝血減輕蟲體對腸道造成的損傷。

綜上所述，本研究首次對腸腎蟲感染的黑斑蛙外周血細胞數(shù)量、顯微結(jié)構(gòu)特征進行了研究。觀察外周血血細胞的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)腸腎蟲感染對黑斑蛙血細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響。

血液學計數(shù)結(jié)果表明，感染組黑斑蛙紅細胞數(shù)量極顯著下降，白細胞數(shù)量、血栓細胞數(shù)量顯著上升，白細胞分類計數(shù)表明，感染組與未感染組相比，嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量極顯著上升，單核細胞和嗜堿性粒細胞數(shù)量變化無統(tǒng)計學差異，根據(jù)本研究結(jié)果和已有的文獻報道，我們認為嗜酸性粒細胞數(shù)量的變化可以作為黑斑蛙寄生蟲感染檢測的重要指標。

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Changes of Hematological Parameters in Peripheral Blood of Rana Nigromaculata Infected with Nyctotherans

WANG Qin1， SU Jie-jie2， LI Li3，ZHANG Sheng-zhou2

（1. Osaka College of Medical Engineering， Ma'anshan University， Ma'anshan 243000， China； 2. Key Laboratory for Conservation and Use of Important Biological Resources of Anhui Province， College of Life Science， Anhui Normal University， Wuhu 241000， China）

Abstract： Rana nigromaculate is one of the most important species of frog raised in China in recent years， which has high ecological and economic value. Nyctotheran is one of the common parasites in the intestinal tract of frogs. The morphometrics and microstructure of peripheral blood cells of Rana nigromaculate infected by Nyctortherans were studied by means of microscopic cell counting and routine wright's staining. Wright's staining showed that parasite infection had no significant effect on blood cell morphology and structures. Cell counts showed that the number of erythrocytes in the infected group was extremely significantly decreased （P < 0.01）， and the number of leukocytes and thrombocytes was significantly increased （P < 0.05）. The classified count in leukocytes indicated that the number of lymphocytes， neutrophils and eosinophils increased extremely significantly in the infected group compared with the uninfected group （P < 0.01）， while there was no significant difference in the number of monocytes and basophils. According to the results of this study and existing literature reports， the changes in the number of erythrocytes and eosinophils can be used as important indicators for the detection of parasitic infection.

Key words： Rana nigromaculate； Nyctotherans； blood cells； percentage of leucocytes

（責任編輯：鞏 劼）