酸堿度和含水量對枯草芽孢桿菌生物有機肥活性和效應研究

摘要：為了生產(chǎn)高品質的枯草芽孢桿菌生物有機肥料，以腐熟羊糞為主要原料，通過糠醛渣的添加量調節(jié)肥料的酸堿度（pH分別為6.00、6.50、7.00、7.50、8.00、8.88）來測定活菌數(shù)確定最佳配比，并通過不同的水分含量來確定枯草芽孢桿菌生物肥料最佳含水量。結果表明，用糠醛渣的添加量來調節(jié)生物有機肥料的酸堿度，不同酸堿度對生物肥料中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)影響不顯著，各處理保存到180 d后，活菌數(shù)維持在10×109 cfu/g左右。酸堿度對生物肥料中絲狀真菌雜菌數(shù)的影響十分顯著（P < 0.01），雜菌數(shù)先隨著pH的升高而升高，當pH為7.00時，雜菌數(shù)最多，達6.17×106 cfu/g；當pH大于7.00或者小于7.00時，雜菌數(shù)減少。不同酸堿度的生物肥料對種子發(fā)芽指數(shù)有顯著影響，隨著pH升高種子發(fā)芽指數(shù)降低，說明生物肥料中pH過高會抑制根系的生長。隨著水分含量的增加，枯草芽孢桿菌的數(shù)量逐漸減少，而肥料中絲狀真菌雜菌數(shù)隨著水分含量的增加而增加，水分含量達到40%、保存180 d時雜菌數(shù)最多，達3.97×107 cfu/g；水分含量小于10%時，雜菌基本不生長。綜合分析，枯草芽孢桿菌生產(chǎn)生物肥料的最佳pH為6.00～7.00，水分含量以小于20%為宜。

關鍵詞：酸堿度；水分；枯草芽孢桿菌；生物有機肥；有效活菌數(shù)；雜菌數(shù)

中圖分類號：S144 文獻標志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）10-0955-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.10.013

Effects of pH and Water Content on the Activity and Effectiveness of

Bacillus subtilis Bio-organic Fertilizer

LI Juan， TANG ying， ZHAO Xu

（Institute of Soil， Fertilizer and Water-saving Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： In order to produce high-quality Bacillus subtilis bio-organic fertilizer， decomposed sheep manure was used as the main raw material， the pH value of the fertilizer was adjusted to 6.00， 6.50， 7.00， 7.50， 8.00 and 8.88 by adding furfural residue， and the optimal proportion was determined by measuring the number of live bacteria， and the optimal water content of the Bacillus subtilis bio-fertilizer was determined by different water contents. The results showed that adjusting the acidity and alkalinity of bio-organic fertilizers with rice bran aldehyde residue did not significantly affect the viable count of Bacillus subtilis in the biofertilizer. Regardless of the acidity and alkalinity， the viable count remained around 10×109 cfu/g after 180 days. The acidity significantly affected the count of filamentous fungi and miscellaneous bacteria in the biofertilizer（P < 0.01）. The undesirable count increased with pH until it reacheed 7.00， with a maximum of 6.17×106 cfu/g. When the pH was greater or lesst than 7.00， the undesirable count decreased. Different acidity levels of biofertilizers had a significant impact on seed germination index， showing a decreasing trend as pH increased， indicating that excessively high pH in biofertilizers could inhibit root growth. As moisture content increased， the number of Bacillus subtilis gradually decreased， while the count of filamentous fungi and miscellaneous bacteria in the fertilizer increased. When the moisture content reached 40%， the count could reach up to 3.67×107 cfu/g. When the moisture content was below 10%， the count was minimal， suggesting that low moisture levels inhibit miscellaneous bacteria growth. In conclusion， the optimal pH for producing biofertilizers with Bacillus subtilis is between 6.00 and 7.00， with a moisture content below 20%.

Key words： pH; Moisture; Bacillus subtilis; Bio-organic fertilizer; Active cultivable count; Number of contaminant

收稿日期：2024 - 03 - 14；修訂日期：2024 - 09 - 23

基金項目：中央引導地方科技發(fā)展資金項目（23ZYQA0323）；甘肅省農業(yè)科學院科技成果轉化項目（2023GAAS-CGZH01）；甘肅省農業(yè)科學院重點研發(fā)計劃（2022GAAS16）。

作者簡介：李 娟（1971 —），女，甘肅永登人，副研究員，研究方向為農業(yè)廢棄物資源化利用。Email： 466815228@qq.com。

糠醛渣是以玉米芯、玉米稈、稻殼、棉籽殼等農業(yè)廢棄物為原料制備糠醛后的副產(chǎn)品，其主要成分為纖維素和木質素［1 - 2 ］?？啡┰哂休^強的酸性，且有機質含量很高，可以增加土壤水穩(wěn)性團聚體數(shù)量，疏松土壤，增加孔隙率，改善鹽堿地鹽漬化［3 - 5 ］?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是一種生防細菌，能夠提高作物抗逆性、促進作物生長，治理農業(yè)污染，對多種作物的病蟲害有良好的防治效果［6 - 7 ］。在土壤質量改良方面，可以增加土壤有機質含量，增強土壤酶活性，降低土壤鹽分含量［8 ］?？莶菅挎邨U菌生物肥料已經(jīng)在水稻、玉米、百合、馬鈴薯、中藥材、大白菜等多種作物上應用［9 - 16 ］。但我國微生物肥料在生產(chǎn)工藝和技術方面存在諸多問題，如用于微生物肥料的載體質量較差［17 ］，而載體對微生物肥料質量有關鍵影響［18 ］。由于生物肥料是含有微生物的特定制品，利用微生物的代謝活動及產(chǎn)物為植物提供養(yǎng)分和生長發(fā)育所必需的物質，微生物是微生物肥料的核心，必須確保添加的功能微生物的生物活性，因此微生物肥料質量控制一直是最突出的問題。其中產(chǎn)品貨架期短，功能菌有效活菌數(shù)偏低，有害雜菌較多，特別是霉菌滅活等問題尤為嚴重，阻礙了微生物肥料產(chǎn)品的商業(yè)化與應用效果［19 - 20 ］。而影響微生物活性的因素很多，其中載體的酸堿度和水分是主要的影響因素，酸堿度的變化是通過糠醛渣與羊糞的不同配比來實現(xiàn)的。因此，我們以腐熟羊糞為主要原料，通過糠醛渣的添加量來調節(jié)肥料的酸堿度，以期研究出微生物生長良好的最佳配比，并通過不同的水分含量來確定枯草芽孢桿菌生物肥料最佳含水量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試熟羊糞（pH 8.88）、糠醛渣（pH 3.43）由甘肅普康生物科技有限公司提供，枯草芽孢桿菌菌粉（有效活菌數(shù)2 000×109 cfu/g）由天津坤禾生物科技集團股份有限公司生產(chǎn)。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)方法基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 000 mL（固體培養(yǎng)基加15 g瓊脂粉），pH 7.2～7.4。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同酸堿度對生物肥料中活菌數(shù)的影響 試驗于2022年10月至2023年8月在甘肅省農業(yè)科學院土壤肥料與節(jié)水農業(yè)研究所微生物實驗室進行。共設6個酸堿度處理：pH 6.00（糠醛渣1∶羊糞2）、pH 6.50（糠醛渣1∶羊糞4）、pH 7.00（糠醛渣1∶羊糞6），pH 7.50（糠醛渣1∶羊糞10）、pH 8.00（糠醛渣1∶羊糞14）、pH 8.88（羊糞）。各處理分別按比例（質量比）混合均勻后，稱取1 kg裝入不銹鋼盆中，每盆加入枯草芽孢桿菌5 g攪拌混勻后，分裝到無菌的密封袋中，每袋約30 g，封口后置于室溫下保存。分別在接種后10、30、60、90、120、150、180 d用稀釋平板法測定肥料中的活菌數(shù)和雜菌數(shù)。

1.2.2 不同水分含量對生物肥料中活菌數(shù)的影響

水分含量設置6個處理，分別為10%（不加水）、20%、25%、30%、35%、40%，各處理稱取1.0 kg生物肥料配方載體分別裝入不銹鋼盆中，每盆加入枯草芽孢桿菌5 g，按試驗設計再加入相應的水，攪拌混勻后，分裝到無菌的密封袋中，每袋約30 g，封口后置于室溫下保存。用稀釋平板法分別在接種后60、90、150、180 d測定肥料中的活菌數(shù)、在接種后60、150、180 d測定肥料中的雜菌數(shù)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 載體中有效菌體釋放率的測定 將菌劑放置在陰涼處保存，10 d后取10 g樣品加入裝有100 mL無菌水的三角瓶中，在200 r/min下振蕩30 min，然后立即用稀釋平板計數(shù)法（牛肉膏培養(yǎng)基）測定釋放的菌數(shù)［21 ］。用釋放菌數(shù)（測定時載體實際的有效活菌數(shù)）與接種菌數(shù)相比計算釋放率。

有效菌體釋放率=載體釋放出的活菌數(shù)/載體中接種菌數(shù)×100%。

1.3.2 種子發(fā)芽指數(shù)（GI）的測定 以未包衣的蘿卜種子為指示材料，在有機肥料浸提液中培養(yǎng)，其種子發(fā)芽率和種子平均根長的乘積與在水中培養(yǎng)的種子發(fā)芽率和種子平均根長的乘積的比值。種子發(fā)芽指數(shù)以百分數(shù)（%）表示，計算公式為：

式中，A1為有機肥浸提液培養(yǎng)的種子中種子發(fā)芽率，A2為有機肥浸提液培養(yǎng)的全部種子的平均根長數(shù)值，B1為水培養(yǎng)的種子中種子發(fā)芽率，B2為水培養(yǎng)的全部種子的平均根長數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2007 進行處理和計 算［22 - 23 ］，采用 DPS 統(tǒng)計軟件對不同處理間差異顯著性進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同酸堿度對枯草芽孢桿菌生物肥料中活菌數(shù)、雜菌數(shù)影響

2.1.1 釋放率和活菌數(shù) 載體的菌體釋放率是衡量載體質量的一個重要指標。從表1可知，不同酸堿度的載體對枯草芽孢桿菌的菌體釋放率影響不顯著，6個處理的載體接種枯草芽孢桿菌10 d后，菌體釋放率為98.6%～107.0%，各處理間差異不顯著。說明載體pH為6.00～8.88 時對枯草芽孢桿菌的釋放率基本沒有影響。

圖1結果顯示不同酸堿度對生物肥料中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)影響不顯著，保存的時間對活菌數(shù)有一定的影響。各處理活菌數(shù)都是隨著保存天數(shù)的增加而增加，保存到60 d時活菌數(shù)達到最多，為11.82×109～14.00×109 cfu/g，較保存10 d活菌數(shù)增加13.7%～41.6%；之后隨著保存時間的增長，各處理活菌數(shù)有所減少，保存到180 d后，各處理的活菌數(shù)下降至10×109 cfu/g左右，處理間差異不顯著。

2.1.2 絲狀真菌雜菌數(shù) 通過對室溫下保存了180 d的枯草芽孢桿菌生物肥料中雜菌數(shù)的測定結果（圖2）表明，酸堿度對生物肥料中絲狀真菌雜菌數(shù)的影響十分顯著，雜菌數(shù)隨著pH的升高呈先升高后降低趨勢，當pH為7.00時，雜菌數(shù)最多，達6.17×106 cfu/g；當pH大于7.00時，雜菌數(shù)減少；pH為8.88時，雜菌數(shù)較少，僅為3.0×103 cfu/g。

2.1.3 種子發(fā)芽指數(shù)、根長和發(fā)芽率 從表2可以看出，不同酸堿度的生物肥料對蘿卜種子發(fā)芽指數(shù)有顯著影響。隨著pH升高，種子發(fā)芽指數(shù)降低。pH 6.00時，種子發(fā)芽指數(shù)為82.2%；pH升高到7.00時，種子發(fā)芽指數(shù)顯著下降，降至70.3%，pH 7.00～8.88處理的發(fā)芽指數(shù)較pH 6.00處理下降11.9～26.0個百分點。影響發(fā)芽指數(shù)的因子是根長和發(fā)芽率，本試驗中酸堿度對種子的發(fā)芽率無顯著影響，但對根長影響顯著，植株的根長隨著pH的升高而降低。pH 6.0時，根長為17.9 mm；當pH為8.88時，根長降至13.6 mm，降低幅度達24.0%。說明生物肥料中pH過高會抑制根系的生長。

2.2 不同水分含量對生物肥料中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)、雜菌數(shù)影響

2.2.1 枯草芽孢桿菌活菌數(shù) 生物肥料中不同的含水量對枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)有顯著的影響（圖3）。在不同水分含量下，隨著水分含量的增加，枯草芽孢桿菌的數(shù)量有減少趨勢，水分含量40%時活菌數(shù)較水分含量10%減少35.4%～51.6%。在相同水分含量下，不同保存時間對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)也有顯著的影響，活菌數(shù)均隨著保存天數(shù)的增加呈先增加后減少的趨勢。水分含量為10%的處理150 d活菌數(shù)最多，達16.1×109 cfu/g；當水分大于10%時，各處理的活菌數(shù)均以保存90 d時最多，為9.24×109～12.23×109 cfu/g。保存180 d時，各處理的活菌數(shù)最少，較保存90 d減少7.8%～40.2%；與保存60 d相比，水分含量小于25%處理的活菌數(shù)差異不顯著，當水分含量大于25%處理活菌數(shù)顯著降低（P < 0.05）。

2.2.2 生物肥料中雜菌數(shù) 不同水分含量條件下，對室溫下保存的枯草芽孢桿菌生物肥料分別在60、150、180 d進行雜菌數(shù)的測定，結果（圖4）表明，生物肥料中水分含量對絲狀真菌雜菌數(shù)的影響十分顯著，雜菌數(shù)隨著水分含量的增加而增加，60、150、180 d的雜菌數(shù)以水分含量為40%時最多，分別為3.65×107、3.68×107、3.97×107 cfu/g；當水分含量小于10%時，雜菌基本不生長。

3 討論與結論

生物肥料是以活性微生物為核心制成的菌劑，是一種輔助性、對作物有特定肥效和環(huán)境友好型的肥料［24 ］，對化學肥料起到補充和替代的作用［25 ］。生物肥料因其綠色環(huán)保、在多種作物上有良好的增產(chǎn)效果，還可以增加土壤養(yǎng)分有效性，改良土壤微生態(tài)結構［26 - 27 ］，在我國具有很大的發(fā)展空間與潛力， 將成為農業(yè)產(chǎn)業(yè)革命的新動能［28 ］。但生物肥料在我國的發(fā)展還存在一些不足，主要表現(xiàn)在生物肥料貨架期短，存活效果較差［29 ］。但是到目前為止國內外關于這方面的技術研究較少。本研究通過對用糠醛渣和腐熟羊糞不同配比來調節(jié)生物有機肥料的酸堿度和水分含量來研究枯草芽孢桿菌生物肥料活菌數(shù)，pH從6.00到8.88對生物肥料中枯草芽孢桿菌活菌沒有顯著的影響，保存到180 d后，各處理的活菌數(shù)維持在10×109 cfu/g左右，遠遠大于生物有機肥標準要求的活菌數(shù)0.2億 cfu/g。酸堿度對生物肥料中絲狀真菌雜菌數(shù)的影響十分顯著（P < 0.01），雜菌數(shù)先隨著pH的升高而升高，當pH達到7.00時，雜菌數(shù)最多，達6.17×106 cfu/g；當pH大于7.00或者小于7.00時，雜菌數(shù)較少。雖然生物肥料的酸堿度對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)沒有顯著影響，但對種子發(fā)芽指數(shù)有顯著的影響，隨著pH的升高發(fā)芽指數(shù)降低，當pH為7.00時種子發(fā)芽指數(shù)為70.3%，說明生物肥料中pH過高會抑制根系的生長。

枯草芽孢桿菌生物肥料制備過程中，含水量也是一個十分重要的指標， 對生物肥料的保藏時間和質量有著十分重要的作用。菌劑含水量過高容易造成雜菌污染的現(xiàn)象，嚴重影響產(chǎn)品質量及使用［30 ］。本研究也驗證了這一結果，枯草芽孢桿菌生物肥料中水分對絲狀真菌雜菌數(shù)的影響十分顯著，雜菌數(shù)隨著水分含量的增加而增加，當水分含量達到40%、保存180 d時雜菌數(shù)最多，達3.97×107 cfu/g；當水分含量小于10%時，雜菌基本不生長。進一步說明水分增加，枯草芽孢桿菌數(shù)量減少的原因可能是雜菌抑制枯草芽孢桿菌的生長。因此，用糠醛渣和牛糞生產(chǎn)枯草芽孢桿菌生物肥料，生物肥料的pH應控制在6.00～7.00，肥料中有效活菌數(shù)達10×109 cfu/g左右，種子發(fā)芽指數(shù)大于70%。肥料的含水量控制在20%以下，生物肥料中活菌數(shù)較高，雜菌數(shù)量較少。

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