大麻二酚聯(lián)合米諾環(huán)素對牙周炎治療作用的實驗研究

[摘要] 目的 通過體內外實驗探索大麻二酚（CBD） 聯(lián)合米諾環(huán)素（MINO） 對小鼠實驗性牙周炎的治療作用。方法 絲線結扎法建立小鼠牙周炎模型，口腔局部分別給予CBD、MINO及二者聯(lián)用， 通過定量反轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 檢測牙周炎小鼠用藥后外周血炎癥因子變化，Micro CT、免疫印跡（WB） 及蘇木精-伊紅（HE） 染色分析局部位點炎癥改善情況；牙齦卟啉單胞菌抑菌實驗檢測聯(lián)用藥物體外抗菌性能；體外誘導巨噬細胞及牙齦成纖維細胞炎癥，通過qRT-PCR檢測炎癥相關mRNA表達，劃痕實驗探索藥物對細胞遷移的影響，并通過酶聯(lián)免疫吸附（ELISA） 測定探究藥物對于膠原生成的作用。結果 聯(lián)用CBD與MINO后，與單獨用藥相比，小鼠全身炎癥指標下降，局部附著喪失減輕、組織炎癥水平降低、牙周軟硬組織破壞得到改善；體外抑菌實驗結果表明聯(lián)用藥物表現(xiàn)出良好的抗菌性能；體外細胞實驗證明聯(lián)用藥物降低巨噬細胞多種炎癥因子的表達水平，促進炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細胞增殖、遷移，提升膠原形成功能。結論 相較單一用藥方式法，局部應用CBD聯(lián)合MINO對小鼠實驗性牙周炎有著顯著療效。

[關鍵詞] 牙周炎； 大麻二酚； 米諾環(huán)素； 抗生素

[中圖分類號] R781.4+2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/gjkq.2024078

牙周炎以牙菌斑為始動因子，以逐漸加重、感染性牙周軟硬組織破壞為特點[1]，是造成成年人失牙的重要因素[2-4]，與全身健康聯(lián)系緊密[5-9]。因而，尋找牙周炎治療更高效的方案并探究其內在機制迫在眉睫。大麻二酚（cannabidiol，CBD）是植物大麻葉提取物中唯一安全、非精神作用類成分，可與體內多種受體發(fā)生結合，在抗腫瘤、免疫調節(jié)、止痛、神經保護、抗抑郁焦慮等多方面具有良好的藥用價值[10]。CBD強效的抗炎特性已在不同組織器官中得到驗證，可影響多種疾病的發(fā)展進程，包括風濕性關節(jié)炎、潰瘍性結腸炎、銀屑病、糖尿病等[11-15]。本課題組前期研究[16]發(fā)現(xiàn)：局部外用CBD可明顯減輕口腔潰瘍的炎癥程度，緩解潰瘍疼痛，促進潰瘍愈合。

米諾環(huán)素（minocycline，MINO） 是第2代四環(huán)素類抗生素，對需氧和厭氧革蘭陰性細菌均有抑菌效果[17]。前期研究[18]表明：MINO對牙菌斑生物膜中細菌的抑制效果明顯優(yōu)于多種其他抗生素。此外，MINO還具有抑制細胞凋亡和自噬、神經保護、抗抑郁、抗血管生成和腫瘤轉移等非抗生素性質[19-22]。然而，MINO作為目前牙周炎治療的常規(guī)藥物，缺陷也日漸凸顯——其治療周期較長，在長期的較高濃度用藥過程中很容易出現(xiàn)耐藥菌株所導致的療效下降問題，如若繼續(xù)應用則可能導致口腔菌群及腸道菌群紊亂，產生多種不良反應[23]。

本研究擬探索MINO與CBD聯(lián)用是否能在降低傳統(tǒng)MINO用量的同時，對于牙周炎相關細胞同時保有抗菌、抗炎、保護膠原組織和促進愈合等綜合性作用，為牙周炎治療提供新的思路。

鑒于CBD的安全性及多領域的生物學作用，聯(lián)合MINO廣譜抗菌作用及其非抗生素性質，本研究擬用牙周局部給藥方式[24-25]，探究聯(lián)用CBD與MINO對牙周炎的療效。針對這一目標，本研究采用機械結扎法[26-27]構建小鼠牙周炎模型，聯(lián)用藥物開展了一系列體內外實驗，現(xiàn)將結果匯報如下。

1 材料和方法

1.1 材料

CBD （云南漢盟制藥有限公司，中國）、MINO（Sigma公司，美國）、SPF級C57BL雄性小鼠（12周齡）、ATCC 33277牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis， P. gingivalis） 菌株、RAW264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系（mousemononuclear macrophages cell，百特生物公司，中國）、蘇木精- 伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE） 染液試劑盒（碧云天公司，中國）、5×蛋白上樣緩沖液（碧云天公司，中國）、蛋白濃度測定試劑盒（凱基生物公司，中國）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基粉末（默克生物公司，中國）、Dulbecco’s改良高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eaglemedium，DMEM）（HyClone公司，美國）、分散酶（Sigma公司，美國）、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（云克隆公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 栓絲法構建小鼠牙周炎模型、給藥及取材

對50只6～8周齡C57BL雄性小鼠（20～30 g） 進行為期1周的檢疫，將動物置于塑料籠中正常喂養(yǎng)5 d適應動物實驗中心環(huán)境。隨機將小鼠分為5組，每組各10只。將6-0手術用無菌絲線穿過小鼠上頜第一磨牙及第二磨牙之間，并于第一磨牙遠中頰側打結， 建立小鼠牙周炎模型。對照處理組（Sham） 在造模后隨即剪斷并移除絲線。實驗組分別給予10 mg/mL的CBD、1 mg/mL的MINO及10 mg/mL的CBD+1 mg/mL的MINO口腔噴劑，對照組則給予等量（每次噴劑用量均為1 mL） 輔料口腔噴劑（Vehicle），從造模后7 d開始，連續(xù)7 d每天給予口腔噴劑1次，給藥7 d后（即造模后14 d） 取材檢測。

分組如下：1） 對照處理組（Sham） +溶劑（Vehicle），記為Control組；2） 牙周炎+溶劑（Vehicle），記為Ligatured 組； 3） 牙周炎+ CBD（10 mg/mL溶于溶劑），記為CBD組；4） 牙周炎+MINO（1 mg/mL溶于溶劑），記為MINO組；5） 牙周炎+CBD（10 mg/mL）+MINO（1 mg/mL），記為DUAL組。

1.2.2 Micro CT 掃描和分析

將小鼠上頜骨組織放入19 mm樣本管， 置于μCT 80 系統(tǒng)（ScancoMedical公司，瑞士），設置5 μm精度，按500 proj/180°分辨率逐層掃描（55 kV、114 mA、500 ms）。三維重建后測量絲線穿入位置即第一、第二磨牙最大近遠中徑界面的鄰接點至牙槽嵴頂（alveolarbone crest，ABC） 的距離，以模擬牙周炎的牙槽嵴吸收。圈定上頜第一磨牙及第二磨牙之間評分ABC的位置，骨小梁分析的參數(shù)為骨體積分數(shù)（bone volume fraction，BV/TV）（%）。

1.2.3 外周血RNA提取、逆轉錄及定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerasechain reaction，qRT-PCR） 實驗

提取小鼠外周血RNA，進行逆轉錄（Takara公司，日本），反應完成后獲得20 μL cDNA樣本，稀釋5倍后用于下一步實驗或凍存于-20 ℃冰箱備用。配制qRTPCR體系，以cDNA作為擴增模板，每樣本設3個復孔進行反應，采用2-ΔΔCt 法定量計算。

1.2.4 石蠟切片制取及染色

配制20% 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 脫鈣液，將掃描完畢的上頜骨樣本浸泡于脫鈣液中4周。脫水、透明、浸蠟和包埋，獲得組織蠟塊。理想切片位置為：上頜第一磨牙與第二磨牙間ABC最大近遠中徑截面。將切片在45 ℃水浴鍋中充分鋪展，再用黏附性載玻片撈片，充分干燥4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ炃衅撓炛了?，蘇木精染細胞核、伊紅染細胞質，脫水封片后使用顯微鏡觀察切片，鏡下進行圖像處理和比較。

1.2.5 蛋白免疫印跡（western blot，WB） 實驗

提取小鼠牙齦組織蛋白，分裝后保存于-80 ℃冰箱，需避免反復凍融；配制1×電泳緩沖液、配制轉膜緩沖液； 制備聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel，PAGE） 凝膠和電泳；轉膜、封閉、抗體孵育；遵照化學發(fā)光試劑盒的說明，按1∶1比例配制化學發(fā)光底物（electrochemiluminescence，ECL） 顯影液。同顯影液于室溫避光孵育2 min。調整曝光時間，觀察各條帶結果并拍照。

1.2.6 抗菌藥敏實驗

1） 不同濃度CBD及MINO溶液的配制及最佳組合濃度探索。將CBD及MINO分別溶解于二甲基亞礬（dimethyl sulfoxide，DMSO） 溶液中，配制成20 g/L儲存溶液，再將其稀釋為對應組合濃度梯度溶液備用。2） 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC） 測定。將處于對數(shù)生長期菌懸液[每毫升1.5×108菌落形成單位（colony forming units，CFU） ]加入96孔板中（每孔100 μL），分別加入不同濃度的CBD及MINO溶液100 μL和溶劑100 μL。培養(yǎng)48 h后，黑色背景下肉眼觀察菌液無渾濁出現(xiàn)的最低藥物濃度組合為兩藥聯(lián)用的MIC。3） 細菌生長曲線測定。取相應濃度的CBD+MINO溶液和對數(shù)生長期菌懸液（1.5×103 CFU/mL） 各2.5 mL混合均勻，將CBD+MINO終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC作為實驗組；將DMSO溶液與對數(shù)生長期菌懸液（1.5×108 CFU/mL） 各2.5 mL混合均勻后作為對照組。于培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24 h后，加入細菌懸液，通過酶標儀檢測于600 nm波長下各小孔吸光度（光密度值），并繪制生長曲線。

1.2.7 細胞炎癥誘導及劃痕實驗

將6孔板中各孔原液吸凈丟棄，更換為含1 μg/mL P. gingivalis來源脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 的無雙抗培養(yǎng)基，本實驗LPS處理時間節(jié)點設置為6 h，而后加入各組藥物處理12 h，在收樣前30 min加入腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），使其在溶液中濃度為2 mg/mL。將牙齦成纖維細胞以每孔6×104個細胞的密度接種于6孔板中，誘導炎癥，更換為無血清且含1%雙抗的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用20 μL槍尖垂直于孔板劃痕，采圖后計算劃痕面積。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均已重復3次。采用單因素方差分析確定各變量的顯著性影響，然后進行Tukey’s多重比較檢驗。

2 結果

2.1 CBD與MINO聯(lián)用有效減輕小鼠牙槽骨破壞

通過對上頜第一、二磨牙舌側面的Micro CT掃描重建，觀察到牙周炎造模后，牙槽骨的破壞尤為顯著（圖1A）。其中，Control組從上頜第一磨牙釉牙骨質界（enamel cementum junction，CEJ） 起、到小鼠上頜第一、二磨牙間ABC止的距離（CEJ-ABC） 遠大于所有給藥組小鼠，提示第一磨牙栓絲建模造成嚴重的牙槽骨吸收；而CBD+MINO處理組小鼠的牙槽骨吸收略低于CBD/MINO單獨處理組（Plt;0.05），為所有實驗組中最低的，提示CBD+MINO的口腔局部應用有效減輕小鼠患牙周圍牙槽骨的炎性破壞（圖1B）。

此外，本實驗還通過ImageJ定量比較了各組小鼠上頜第一、二磨牙牙根近遠中軸面所圍成的橫截面積差異，溶劑組小鼠牙槽骨破壞面積最大，而這一指標在CBD+MINO組顯著降低，且低于傳統(tǒng)單獨應用MINO組（圖1C）。同時對各骨小梁參數(shù)進行了定量分析（圖1D），結果趨勢符合上述觀察。各組間BV/TV的分析結果與CEJ-ABC距離變化趨勢意義一致，結果表明牙周炎栓絲模型的建立對于患牙牙周骨小梁分數(shù)具有負面影響，而應用CBD+MINO對這一現(xiàn)象有所逆轉。造模后7 d給予CBD+MINO聯(lián)合噴劑后，相較于對照組及單獨應用其中一種藥物而言，小鼠牙周硬組織破壞的進展減慢、破壞程度減輕。

2.2 CBD 與MINO 聯(lián)用降低牙周炎小鼠局部和全身炎癥水平

造模后14 d收取小鼠牙周組織樣本進行HE組織染色。機械栓絲法造模后給藥7 d，僅栓絲組可見患牙近遠中牙槽嵴處骨質破壞嚴重，主要表現(xiàn)為圖2A中標注所示ABC向根方退縮、以及G所示的齦乳頭處炎癥細胞大量浸潤。而CBD組與聯(lián)用組ABC高度保留較好，齦乳頭處炎癥細胞浸潤較少，僅可見少許淋巴細胞，且CBD+MINO組淋巴細胞浸潤程度進一步降低。進一步收集局部牙齦組織行免疫印跡實驗，其結果可證實，CBD+MINO的組合在減輕局部炎癥狀態(tài)上的效果優(yōu)于單獨使用CBD或MINO （圖2B）?？紤]到牙周炎的持續(xù)狀態(tài)在人體能夠引發(fā)全身性的低度炎癥改變，本實驗取小鼠外周血檢測了各組小鼠血清中基因的轉錄水平表達。結果顯示：與單獨用藥相比，聯(lián)用CBD+MINO可抑制全身白細胞介素（interleukin，IL） -1β及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF） -α炎癥因子的表達（圖2C）。

2.3 CBD與MINO聯(lián)用抑制P. gingivalis 增殖

回顧文獻發(fā)現(xiàn)：目前暫無CBD與MINO聯(lián)合抗菌用藥的濃度探究，因此本實驗通過設計2種藥物連續(xù)濃度梯度并進行組合，以探究最適宜的用藥濃度。選擇P. gingivalis作為牙周炎致病菌代表菌種，分別施以不同濃度梯度的組合藥物，將微生物懸液吸光度作成熱圖形式，藍色越深代表組合藥物對于該種微生物抑制作用越強。如圖3A所示，可以初步將1 μg/mL CBD+0.06 μg/mL MINO作為聯(lián)合用藥MIC。

組合藥物對和P. gingivalis生長曲線的影響見圖3B。與對照組相比，各濃度組合藥物實驗組對其生長均有不同程度的抑制，且該抑制作用呈濃度依賴性。1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC組細菌生長呈緩慢增長趨勢，而MIC組細菌的增長幾乎完全受到抑制，證明實驗所得出組合藥物MIC濃度可靠。值得一提的是，常用于抑菌的MINO濃度一般為0.1～1 μg/mL。本實驗顯示：CBD+MINO組合中MINO有效濃度可進一步降低至0.06 μg/mL，降低抗生素用量對減小細菌耐藥風險具有重要意義。

2.4 CBD 與MINO 聯(lián)用降低巨噬細胞炎癥因子分泌

炎癥誘導的RAW264.7給予不同藥物處理后進行qRT-PCR實驗，結果顯示：給予CBD+MINO處理后，RAW264.7 中pro-IL-1β、IL-1β、TNF- α 和Irf-1基因轉錄水平均發(fā)生顯著下調，且聯(lián)用藥物組pro-IL-1β、IL-1β、TNF-α下調程度均大于單獨使用MINO （Plt;0.05），進一步驗證了CBD與MINO聯(lián)用對小鼠巨噬細胞中炎癥相關通路基因的抑制作用（圖4A）。

同時提取不同組藥物處理的炎癥巨噬細胞裂解液蛋白， 進行WB實驗， 結果如圖4B所示，CBD+MINO處理后巨噬細胞分泌IL-1β蛋白水平較其他組有所下降，提示在體外抗炎作用方面，聯(lián)用CBD及MINO達到了比單用CBD更強的抗炎作用。

2.5 CBD 與MINO 聯(lián)用促進炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細胞遷移

劃痕實驗結果顯示：CBD與MINO單獨使用和聯(lián)用均能改善炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細胞遷移（圖5A）。 24 h時間點，與對照組毫無遷移跡象相比，CBD+MINO組已能觀察到細胞遷移，即兩藥聯(lián)用在早期就能促進炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblast， HGF） 的遷移。48 h時間點，與對照組相比，定量、定性結果均顯示：CBD聯(lián)用MINO能顯著改善炎癥下HGF的遷移能力（圖5B，Plt;0.001）。

2.6 CBD 與MINO 聯(lián)用提高人牙齦成纖維細胞膠原生成

qRT-PCR結果顯示：與對照組相比，炎癥狀態(tài)下各組HGF細胞產生膠原能力減弱，而CBD與MINO聯(lián)用處理組可顯著提升炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細胞產生膠原能力，從而基本恢復HGF正常生理功能，ELISA定量進一步驗證了該結果，且與單獨應用MINO組相比差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001）（圖6A、B）。

3 討論

作為最常見的口腔慢性感染性疾病，牙周炎嚴重影響患者口腔及全身健康。位于牙周袋內的牙菌斑生物膜是牙周炎致病因素中最重要的一環(huán)，研究[2-4]顯示：定植于牙周袋內的微生物群落所包含細菌種屬數(shù)已逾百種，由革蘭陽性和革蘭陰性細菌共同構成[28-29]，而臨床通常采用的齦上/齦下潔刮治的治療方式常常未能深入到根分叉病變部位和牙周袋內底部[30]，無法有效地控制細菌感染及繼發(fā)的宿主免疫反應，治療效果難以保證[31-33]。

CBD強大的生物學效應已在眾多體內外研究中得到證實，包括：抗癌、抗炎、止痛、神經保護、抗抑郁焦慮五大主要方面[10]；其中，CBD良好的抗炎、免疫調節(jié)特性已在體內多種組織器官及相關炎癥性疾病模型中得到驗證。鑒于CBD對在口腔炎癥性疾病中發(fā)揮的良好抗炎及抑菌等功效，相關組織已研制出含CBD的口腔護理產品[34]，對牙周炎、牙齦炎、口腔潰瘍等口腔問題有良好效果，并申請了相關發(fā)明專利。但目前針對CBD治療口腔疾病的組織驗證研究甚少，尤其是CBD抗菌的作用機制目前尚無研究報道，因此在推廣其臨床應用之前仍需進一步體外抗菌實驗探索。

MINO為一種新型廣譜抗生素，因滲透性好、脂溶性高的特點被用于牙周炎的治療，該藥局部用藥可變硬形成薄膜，其中一部分薄膜可與硬組織螯合之后緩慢釋放以維持局部的高濃度[35]。MINO雖作為廣譜抗生素，抑制多種細菌增殖能力早已被證實，但近期研究發(fā)現(xiàn)，其改善炎癥反應的效果非常局限[36]，牙周炎患者局部軟硬組織受細菌毒力因子刺激產生較強的破壞性炎癥反應，導致牙齦色形質改變、探診出血、牙周纖維結締組織破壞、骨組織破壞乃至牙松動甚至脫落，MINO未能從抑制炎癥方面改善牙周炎[37]，因而在抗菌治療的同時改善局部炎癥反應也是治療牙周炎的目標之一。因此，為在抗菌治療的同時加強對局部炎癥的控制，本研究在上述傳統(tǒng)MINO抗菌治療牙周炎的基礎上加以CBD進行抗炎治療。

P. gingivalis是牙周炎主要致病菌之一，直接參與牙菌斑生物膜的形成[38]。本研究篩選出了CBD及MINO的組合藥物MIC組合，并繪制不同濃度藥物組合下P. gingivalis的生長曲線，觀察到組合藥物的抑制作用有一定的濃度依賴性，該抑制作用在較通常單一使用MINO時所用濃度更低的MINO用量下，效果強于單獨應用CBD或MINO的傳統(tǒng)抗生素療法。聯(lián)合應用CBD及MINO對多種細菌具有較強的體外抑菌活性，有望成為新型的牙周炎輔助治療藥物。

本實驗選取小鼠巨噬細胞，并使用LPS對其進行炎癥誘導，這也是體外炎癥實驗常用的細胞模型。聯(lián)用藥物在體內對于炎癥狀態(tài)下巨噬細胞促炎作用具有強于單獨用藥的效果。牙齦成纖維細胞參與膠原與細胞外基質合成，因此對牙周組織愈合至關重要[39]。牙齦成纖維細胞向缺隙間處遷移并關閉創(chuàng)口是軟組織再生的第一步，其遷移速度影響牙周組織的再生和重塑過程[40]。而在本實驗中選取的MINO濃度分別為0.06 μg/mL，低于推薦的血清水平濃度，依然達到治療目的，且在MINO的有效抑菌濃度內，聯(lián)用藥物可促進炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細胞增殖和膠原合成。

綜上所述，本課題揭示了局部聯(lián)合應用CBD及MINO對牙周炎的顯著療效，明確了二者聯(lián)用在牙周炎發(fā)生過程中、通過抗菌及抗炎雙重機制保護牙周組織，為牙周炎高效治療藥物研發(fā)提供新思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（ 本文編輯 王姝 ）

[基金項目] 四川大學華西口腔醫(yī)院交叉學科創(chuàng)新項目（RD-03-202010）；四川省國際科技合作項目（2021YFH0015）