血漿無細胞線粒體外線粒體DNA與牙周炎臨床指標的相關(guān)性研究

[關(guān)鍵詞] 牙周炎； 無細胞DNA； 線粒體DNA； 橫斷面研究； 牙周臨床指標

[中圖分類號] R781.4 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/gjkq.2024044

牙周炎是一種由菌斑微生物引起的慢性感染性疾病[1]，臨床表現(xiàn)為附著喪失、牙周袋形成與牙槽骨吸收。牙周炎的發(fā)生發(fā)展受到微生物、宿主免疫炎癥反應(yīng)以及全身因素的影響，表達出較大的個體差異，尋找相關(guān)血漿的標志物一直是牙周病學(xué)研究的重點。

近年來無細胞線粒體DNA （cell-free mitochondrialDNA，cf-mtDNA） 在代謝疾病[2]、自身免疫病[3]、創(chuàng)傷[4-5]、神經(jīng)退行性疾病[6]以及癌癥[7-8]中廣受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)cf-mtDNA受到年齡[9]、心理壓力[10]、劇烈運動[11]、晝夜節(jié)律[12]等因素的影響。在氧化應(yīng)激、微生物刺激、組織損傷或是生理狀態(tài)下，細胞可以主動或被動釋放cf-mtDNA。cf-mtDNA可存在于多種結(jié)構(gòu)中，血漿中cf-mtDNA多數(shù)存在于完整線粒體內(nèi)[13-15]，也可以在完整線粒體外以被或不被膜包裹的形式存在[11]：如胞外微囊泡或者外泌體[16-17]， 不被膜包裹的cf-mtDNA可以通過完全游離的形式存在，也可以通過與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在[18]。

線粒體膜內(nèi)的cf-mtDNA通常不促炎[11]，甚至在被呼吸功能受損的細胞內(nèi)化后可能恢復(fù)其線粒體功能[19]。被膜結(jié)構(gòu)包裹的，如外泌體和微顆粒中的線粒體外cf-mtDNA，在被受體內(nèi)化后可以產(chǎn)生促炎的作用[20]，而不被膜包裹的線粒體外cfmtDNA，如完全游離的cf-mtDNA和與蛋白復(fù)合物結(jié)合的cf-mtDNA，則可以直接激活細胞膜上的Toll樣受體9 （toll-like receptor 9，TLR9） 產(chǎn)生促炎作用[21]。本文通過二次離心法分離出cf-mtDNA中存在于線粒體外的部分，即包含在較小的微囊泡（microvesicle）、外泌體（exosome） 以及形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的cf-mtDNA。它們可以通過內(nèi)化或直接與膜受體結(jié)合產(chǎn)生促炎作用，將其稱為無細胞線粒體外線粒體DNA （cell-free extra-mitochondrialmitochondria DNA，cf-exmtDNA）。

目前對于牙周炎與體液cf-exmtDNA水平的相關(guān)性尚無定論。在動物模型中發(fā)現(xiàn)，牙周炎可以通過活性氧（reactive oxygen species，ROS） /線粒體通透性轉(zhuǎn)換（mitochondrial permeability transitionpore，mPTP） 通路，介導(dǎo)線粒體DNA （mitochondrialDNA，mtDNA） 逃逸，使得小鼠血液cf-exmtDNA水平升高[22]。也有研究發(fā)現(xiàn)牙周炎時線粒體的生物合成功能下降[23]，使得細胞內(nèi)線粒體數(shù)量以及mtDNA的拷貝數(shù)減少[24]。臨床研究方面僅有關(guān)于唾液的研究報道。Kone?ná等[25]發(fā)現(xiàn)：牙周探診出血者初次離心（1 600 g） 上清中唾液cf-mtDNA含量顯著高于牙周探診不出血者，但在二次離心后（16 000 g） 上清中未觀察到明顯差異。目前尚無關(guān)于血漿和齦溝液中cf-exmtDNA與牙周炎相關(guān)性的研究報道。本文旨在研究全身健康者血漿中cf-exmtDNA與牙周炎臨床指標的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

樣本量的計算：本試驗主要目的是探究18～45歲人群中牙周炎癥指標與血漿cf-exmtDNA的相關(guān)性，為單組設(shè)計的橫斷面研究，選用直線相關(guān)分析公式（雙側(cè)）[26]計算樣本量。公式如下：

從2022年4—12月于北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科及北京市中關(guān)村醫(yī)院口腔科就診的患者，及北京大學(xué)口腔醫(yī)院在讀醫(yī)學(xué)生中選擇受試者，共納入受試者78人。所有受試者要求無全身系統(tǒng)性疾病，無吸煙史，無服用吡格列酮、環(huán)孢素、二甲雙胍史，3個月內(nèi)未服用抗生素，體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI） lt;28.0 kg/m²，女性未處于妊娠期或哺乳期；口內(nèi)無種植修復(fù)體，無正畸治療史，3個月內(nèi)未接受過牙周治療。本研究經(jīng)北京大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會批準（編號：PKUSSIRB-202165082），每位受試者均在完全理解研究設(shè)計后簽署知情同意書。

1.2 基本信息與病史

采集所有樣本的基本信息和病史，包括以下4個部分。1） 一般資料：姓名、年齡、性別、民族。2） 口腔衛(wèi)生習(xí)慣：刷牙頻率和方式，是否使用牙線，上一次洗牙的時間。3） 口腔病史：既往口腔治療史，是否有正畸史和牙周炎家族史。4）體格檢查：身高、體重、BMI和空腹血糖（fastingblood glucose，F(xiàn)BG）。FBG檢測方法：每名受試者晨起空腹采肘部靜脈血2 mL，2 h內(nèi)于檢驗科檢測，統(tǒng)一采用己糖激酶法。

1.3 牙周臨床檢查

牙周檢查主要由1位來自北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科的?？漆t(yī)師完成。研究開始前完成主要檢查者與參考檢查者（1位牙周科資深主任醫(yī)師） 之間的一致性檢驗。探診深度（probing depth，PD）、出血指數(shù)（bleeding index，BI） 的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)分別為0.88 和0.85。使用標準Williams牙周探針（Hu-Friedy公司，美國） 和尖探針對口內(nèi)每顆天然牙進行檢查（阻生的第三磨牙或者其他原因待拔的牙齒除外），記錄牙周檢查表，具體包括：口內(nèi)余留牙的牙位以及修復(fù)情況，每顆余留牙6個位點的PD、臨床附著水平（clinical attachment level，CAL）、頰舌側(cè)菌斑指數(shù)（plaque index，PLI） 和BI。

按照2018年牙周炎新分類標準[27]、牙周健康標準[28]進行分組，對所有受試者均拍攝全景片，對于判斷為Ⅲ、Ⅳ期牙周炎患者加拍重點牙根尖片明確診斷。分組標準具體如下。1） 牙周健康組：不存在2個或2個以上不相鄰牙的鄰面檢測到附著喪失，或不存在2個或2個以上的牙齒有頰舌側(cè)附著喪失≥3 mm；PD≤3 mm，探診出血lt;10%，無影像學(xué)骨缺損。2） 牙齦炎組：不存在2個或2個以上不相鄰牙的鄰面檢測到附著喪失，或不存在2個或2個以上的牙齒有頰舌側(cè)附著喪失≥3 mm，探診出血≥10%， 無影像學(xué)骨缺損。3） 牙周炎組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期牙周炎）：存在超過2個不相鄰牙的鄰面附著喪失≥3 mm或鄰面PD≥5 mm，鄰面最大影像學(xué)骨缺損（骨嵴頂距釉牙骨質(zhì)界的距離/根長） ≥15%。

1.4 血漿cf-exmtDNA的檢測前處理

采血方法：統(tǒng)一于上午8—10時于采血室抽取靜脈血6 mL，其中4 mL置于乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA） 抗凝采血管中，用于后續(xù)血漿cf-exmtDNA的提??；另外2 mL置于常規(guī)采血管中用于檢測FBG。囑受試者提前8 h禁食，提前10 min禁止劇烈運動。EDTA抗凝血置于4 ℃暫存，4 h內(nèi)進行離心操作。

參考Hummel等[29]和Roch等[14]的分離方法分離cf-exmtDNA。該方法去除了血漿中細胞外的完整線粒體，保留了本研究所關(guān)注的cf-exmtDNA。方法如下：EDTA抗凝血液于室溫下初次離心（1 200 g，10 min），取600 μL上清置于1.5 mL EP管中，暫存于4 ℃等待二次離心，剩余上清（血漿） 分裝后凍存于－80 ℃。血漿二次離心：4 ℃，16 000 g，10 min，取200 μL上清于1.5 mL EP管中，用于血漿總無細胞DNA （cell-free DNA，cf-DNA） 的提取。剩余上清分裝后凍存于-80 ℃。

使用外周血DNA提取試劑盒QIAamp bloodDNA mini kit（Qiagen公司，德國）提取DNA。經(jīng)蛋白酶消化，無水乙醇沉淀，硅膠柱吸附和純化后，使用50 μL緩沖液AE洗脫DNA，存于-20 ℃待用。

1.5 血漿cf-exmtDNA的檢測

采用三步法實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR） 對提取的血漿總cf-DNA中的線粒體基因片段進行擴增，每個樣本設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，以及3個空白對照。反應(yīng)體系為20 μL： 模板2 μL，ddH₂O 6 μL，正引物和反引物各1 μL，體系終濃度為0.5 μmol/μL，SYBR green染料10 μL。變溫程序和引物序列如表1和表2所示。

標準品與標準曲線：于MeSH基因庫搜索人的mtDNA序列，選擇經(jīng)過NCBI Blastn軟件驗證沒有假基因存在的部分進行擴增。將3307—4262位的NADH脫氫酶亞基1 （NADH dehydrogenase" subunit1，ND1；堿基數(shù)為956 bp） 作為標準品的合成序列，載體為大腸桿菌pUC57質(zhì)粒，總堿基數(shù)為3616 bp （上海生工生化科技有限公司）。母液經(jīng)NanoDrop8000 （賽默飛公司，美國） 吸光度檢測，標準品質(zhì)量濃度為39.07 ng/μL，代入該片段的相對分子質(zhì)量2.376×10⁶計算母液的拷貝數(shù)。公式如下：核酸拷貝數(shù)（copies/μL） = （6.02×10²³） ×［質(zhì)量濃度（ng/μL） ×10^-9］ /片段相對分子質(zhì)量，得出母液的拷貝數(shù)為1.007 2×10¹⁰ copies/μL。母液稀釋20倍后每10 μL分裝為儲蓄液-20 ℃凍存待用。儲蓄液加ddH₂O做10倍梯度稀釋，配置基因拷貝數(shù)分別為：5.00×10⁷、5.00×10⁶、5.00×10⁵、5.00×10⁴、5.00×10³、5.00×10² copies/μL 的標準曲線。

使用ABS QuantStudio1 qPCR儀（賽默飛公司，美國） 進行擴增，而后根據(jù)標準曲線由軟件自動計算得到模板的拷貝數(shù)。標準曲線經(jīng)qPCR軟件自動計算，擴增效率為91%～105%，R2均大于0.99，滿足發(fā)表qPCR實驗證據(jù)的最低信息要求[30]，采用同一時間分裝的儲蓄液，保證不同批次間的可比性。

根據(jù)血漿洗脫體積與上樣體積的比值，計算出原血漿樣本中的cf-exmtDNA拷貝數(shù)=qPCR檢測濃度×洗脫體積（50 μL） ÷上樣體積（200 μL） =qPCR檢測拷貝數(shù)/4。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究數(shù)據(jù)由單人錄入并后期校對以保證數(shù)據(jù)真實準確，對于缺失值按照簡單刪除法處理。獲取所有研究對象血漿換算后的原液cf-exmtDNA拷貝數(shù)，與患者的基本資料以及牙周臨床檢查資料進行整合，使用IBM SPSS 27.0 Mac版進行統(tǒng)計分析。

計算每位受檢者的平均菌斑指數(shù)（mean plaque index，mPLI）、平均探診深度（mean" probingdepth，mPD）、平均附著水平（mean clinicalattachment level，mCAL）、平均出血指數(shù)（meanbleeding index，mBI） 用于后續(xù)統(tǒng)計學(xué)分析中。mPLI=全口所有檢查位點的PLI總和/檢查位點總數(shù)，其他臨床指標均值同理。

對所有計量資料進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的指標用均值±標準差表示， 偏態(tài)分布指標用Mdn （Q1，Q3） 表示，Mdn為中位數(shù)，Q1為第一四分位數(shù)，Q3為第三四分位數(shù)；計數(shù)資料用頻數(shù)和（或） 百分比表示。

Lumley等[31]對非正態(tài)資料的統(tǒng)計學(xué)研究表明：在相對大的樣本中，中心極限定理對任何分布都是有效的，因此t檢驗和線性回歸在較大樣本量的非正態(tài)數(shù)據(jù)中是一種方便實用的替代方法。參考SPSS的操作指南，對于樣本量≥25的非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，依賴中心極限定理，可以采用t檢驗、Pearson相關(guān)性檢驗以及線性回歸分析。

本研究總樣本量≥25，因此對血漿cf-exmtDNA和連續(xù)變量mPD、mCAL、mBI、mPLI、年齡、FBG、BMI值進行Pearson相關(guān)性檢驗和多重線性回歸分析。牙周健康組、牙齦炎組lt;25人，因此對各牙周炎癥狀態(tài)分組行兩兩Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 整體受試者基本信息與牙周臨床檢查

本研究共納入受試者78名，包括11名牙周健康者、11名牙齦炎患者和56名牙周炎患者，整體基本情況與基線牙周指標見表3。

2.2 牙周炎癥狀態(tài)分組與血漿cf-exmtDNA

各組血漿cf-exmtDNA拷貝數(shù)（copies/μL） 水平如圖1A所示：牙周健康組18（9，54）、牙齦炎組33 （17，67）、牙周炎組34 （19，130），牙周炎組顯著高于牙周健康組（P=0.042），但牙周健康組與牙齦炎組，牙齦炎與牙周炎組間差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。

2.3 血漿cf-exmtDNA 與各臨床指標的Pearson相關(guān)性分析

相關(guān)性分析的各項統(tǒng)計結(jié)果見圖1和表4。血漿cf-exmtDNA與mPD、mCAL、mBI、年齡呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與FBG、BMI、mPLI則無明顯的線性相關(guān)關(guān)系。

2.4 血漿cf-exmtDNA和臨床指標的多重線性回歸分析

采用步進法選擇相關(guān)性分析時Plt;0.1的變量進行多重線性回歸分析。本試驗中mCAL與mPD具有強烈的共線性（r=0.835），不宜同時納入多因素分析，由于主要研究指標是mPD，在多重線性回歸分析時剔除mCAL，分別以血漿cf-exmtDNA、mPD、mBI為因變量。3個多重線性回歸模型均具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.001），結(jié)果見表5。cf-exmtDNA、mPD、mBI的多變量氣泡圖以及mPD的多重線性回歸模型的實測、預(yù)測對比見圖2。

在多重回歸分析中，血漿cf-exmtDNA水平主要取決于mPD （Plt;0.001），mPD水平主要取決于mBI （Plt;0.001） 和血漿cf-exmtDNA （P=0.002），mBI水平主要取決于mPD （Plt;0.001） 和mPLI （P=0.001）。

3"討論

近年來，關(guān)于血漿cf-mtDNA組成和來源的研究發(fā)展迅速。血漿75.7%～99.5%的cf-mtDNA位于無細胞線粒體中[14]。正常的生理狀態(tài)下，每毫升血漿中存在10⁵～10⁶個完整的無細胞線粒體，這些無細胞線粒體保持了跨膜電位[15]， 使內(nèi)部的cfmtDNA不能直接產(chǎn)生促炎效應(yīng)。近年來炎癥疾病的研究更多關(guān)注存在于線粒體外的cf-DNA，即本文的cf-exmtDNA。

本研究發(fā)現(xiàn)：血漿cf-exmtDNA水平與年齡、mPD、mCAL、mBI存在正相關(guān)關(guān)系，牙周炎組cf-exmtDNA較健康組顯著升高。這可能與牙周炎激活POS/mPTP通路、促進中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET） 釋放，或者通過細胞外囊泡（extracelluler vesicle） 釋放mtDNA和線粒體內(nèi)容物有關(guān)。上皮細胞在ROS增加、線粒體通透性轉(zhuǎn)換等情況下，原本存在于線粒體膜內(nèi)的mtDNA逃逸至細胞質(zhì)。細胞質(zhì)中的mtDNA在創(chuàng)傷、壞死、焦亡等情況下因質(zhì)膜破裂而被動釋放，成為循環(huán)中的cf-exmtDNA。在ROS的刺激以及其他膜受體激活的情況下，中性粒細胞可以主動釋放含有mtDNA的NET[32]。此外，細胞還可以通過胞外囊泡主動釋放cf-exmtDNA和線粒體內(nèi)容物[18]。

mPD的多重回歸模型包含血漿cf-exmtDNA，表明血漿cf-exmtDNA升高對牙周組織局部有促炎作用。血漿cf-exmtDNA可被牙周組織中的中性粒細胞、樹突狀細胞、B細胞、自然殺傷細胞等細胞內(nèi)吞，激活TLR9-核因子κB、環(huán)狀單磷酸鳥苷-單磷酸腺苷合成酶/干擾素基因刺激蛋白（cyclicGMP-AMP synthetase/stimulator of interferon genes，cGAS/ STING）、核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域，富含亮氨酸重復(fù)序列和含Pyrin結(jié)構(gòu)域3 （nucleotide-bindingoligomerization domain， leucine-rich repeat andpyrin domain-containing 3，NLRP3） 等通路促進牙周炎的進展[2，33-34]。此外，mPD和血漿cf-exmtDNA均與年齡呈正相關(guān)關(guān)系，但年齡并未包含在cf-exmtDNA和mPD的多重回歸模型中，因此年齡可能在血漿cf-exmtDNA和mPD的關(guān)聯(lián)中起到了一定的交互效應(yīng)。

雖然血漿cf-exmtDNA水平與年齡、牙周炎癥指標呈正相關(guān)關(guān)系，但尚不明確其是否具有成為牙周炎易感性全身標志物的潛力。研究[10，29]表明：血漿cf-exmtDNA是一種快速變化的指標，受到晝夜節(jié)律、心理壓力、劇烈運動等的影響，可能像皮質(zhì)醇一樣會在1 d中產(chǎn)生較大的波動。其他因素如mtDNA片段長短、甲基化水平、氧化狀態(tài)、與何種蛋白質(zhì)結(jié)合，以及血漿DNA水解酶Ⅰ濃度等，也可能對cf-exmtDNA的促炎作用產(chǎn)生影響。

由于中國人群牙周炎發(fā)病率較高，納入非牙周炎者較為困難，各組樣本量存在一定差異，是本研究的局限性之一。同時，血漿cf-exmtDNA的影響因素較多。本研究控制了全身疾病、肥胖、高齡，但難以控制諸如心理壓力、運動強度等其他混雜因素。此外，確定其他體液如齦溝液的cfexmtDNA含量，有助于明確牙周炎癥狀態(tài)對牙周組織局部cf-exmtDNA的影響，但面臨一些困難：齦溝液cf-exmtDNA尚無明確和成熟的分離方式；齦溝液量比較少，需要進行1000～10000倍稀釋才能進行DNA提取，增加了測量誤差；齦溝液量受晝夜節(jié)律、雌激素影響，下午和晚間齦溝液量高于上午，女性齦溝液量高于男性[35]，這會帶來新的混雜因素等。在后續(xù)有關(guān)體液cf-exmtDNA和牙周炎的相關(guān)性研究中，選擇合理的體液采樣方法和cf-exmtDNA分離方法，控制無關(guān)變量（晝夜節(jié)律和性別等），增加其他的常見體液牙周炎癥標志物進行參照，將有助于試驗的測量和分析。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。