荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞作為巨大普里斯特氏茵載體的研究

關(guān)鍵詞：荔枝剪枝堆肥；蚯蚓糞；載體；巨大普里斯特氏菌；有效活菌數(shù)

微生物肥料在農(nóng)作物的增產(chǎn)增收、抗病提質(zhì)以及培肥地力方面，具有積極的促進(jìn)作用。微生物肥料一般由載體和功能微生物組成，良好的載體能夠促進(jìn)功能微生物的存活，提升微生物肥料產(chǎn)品的質(zhì)量。目前，草炭是微生物肥料中最常用且最理想的載體。但草炭資源的過(guò)度開(kāi)發(fā)容易破壞生態(tài)環(huán)境，且成本較高。因此，尋找廉價(jià)、易得、資源豐富的物料替代草炭作為微生物肥料載體，是微生物肥料生產(chǎn)中較為突出的問(wèn)題。

堆肥是以作物秸稈、園林樹(shù)枝、落葉等農(nóng)業(yè)廢棄物為主要原料，經(jīng)高溫堆腐而成的有機(jī)物料。堆肥來(lái)源廣泛，成本較低，且肥效長(zhǎng)、保水保肥能力強(qiáng)。蚯蚓糞也稱蚯蚓堆肥，是通過(guò)蚯蚓食用禽畜糞便、堆肥等有機(jī)物料后排出的團(tuán)粒物質(zhì)。研究表明，蚯蚓糞中全氮含量為0.32%～2.13%，全磷含量為0.72%-1.72%，全鉀含量為0.40%～2.01%，有機(jī)質(zhì)含量為20.00%～39.20%，同時(shí)還含有Mg、Mn、Cu等中微量元素，以及維生素、糖、氨基酸等多種能促進(jìn)作物生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。堆肥和蚯蚓糞養(yǎng)分全面、豐富，且安全性高，可作為功能微生物載體。陳波利用雞糞和蚯蚓糞作為櫻桃生物有機(jī)肥的載體．其功能菌釋放率和存活率與草炭相當(dāng)。選用蚯蚓糞：平菇菇渣（v：y）=4：1作為彎曲芽孢桿菌載體，其微生物培養(yǎng)時(shí)間至80d時(shí)，有效活菌數(shù)遠(yuǎn)高于初始接種的活菌數(shù)?；ㄉ鷼ざ逊驶|(zhì)中的有效活菌數(shù)與草炭基質(zhì)相持平，可作為載體基質(zhì)進(jìn)一步制備專用復(fù)合菌肥。

目前，多數(shù)研究關(guān)注的是堆肥替代草炭的可行性，而利用蚯蚓糞或堆肥和蚯蚓糞復(fù)配作為微生物載體的研究較少。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓堆肥可提高常規(guī)堆肥的產(chǎn)品質(zhì)量，且常規(guī)堆肥產(chǎn)品中添加20%～30%的蚯蚓糞，可提高功能微生物的存活率。巨大普里斯特氏菌（Prie.stia megatenum）也被稱為巨大芽孢桿菌（Bacillu.s megatherium），是一種內(nèi)生菌，在土壤中廣泛分布，具有良好的促生長(zhǎng)和增產(chǎn)效果，同時(shí)還能改善作物品質(zhì)。因此，本研究以荔枝剪枝堆肥、蚯蚓糞以及草炭為試驗(yàn)材料，以巨大普里斯特氏菌為目標(biāo)功能菌，設(shè)置不同的混合載體配比，并進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化混合載體含水量、溫度和接種濃度等影響因子，探討荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞替代草炭作為巨大普里斯特氏菌載體的可行性以及最適條件，以期為荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞作為吸附載體及生產(chǎn)高質(zhì)量微生物肥料提供應(yīng)用技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試載體為荔枝剪枝堆肥、蚯蚓糞和草炭，其中荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所循環(huán)農(nóng)業(yè)研究室提供，草炭購(gòu)買于儋州大成金泉農(nóng)業(yè)用品門市。上述3種載體材料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)0.5mm篩，并調(diào)節(jié)pH為7.0～7.5，之后高溫高壓滅菌，備用。供試菌種為巨大普里斯特氏菌，由本團(tuán)隊(duì)自主分離，采用LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌液培養(yǎng)。載體基本性質(zhì)見(jiàn)表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1載體不同配比對(duì)巨大普里斯特氏菌的影響

將荔枝剪枝堆肥、蚯蚓糞和草炭按一定質(zhì)量比配制成6個(gè)混合載體，具體配比見(jiàn)表2，以草炭作為對(duì)照（CK），共計(jì)7個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。各處理基本性質(zhì)見(jiàn)表3。取上述各處理混合載體200g，分別與100mL濃度為10cfu·mL-1的巨大普里斯特氏菌菌液進(jìn)行混合，30℃恒溫培養(yǎng)，分別于第1、10、30天和第60天時(shí)測(cè)定混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)。綜合分析后，選取最適合作為巨大普里斯特氏菌存活的混合載體，并進(jìn)行下一步含水量、溫度和接種濃度的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.2含水量對(duì)混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)含水量處理，分別為20%、30%、40%，每個(gè)處理4次重復(fù)。先在每個(gè)處理中加入等量的濃度為10 cfu·mL-1的巨大普里斯特氏菌菌液，再使用蒸餾水調(diào)節(jié)混合載體含水量至各處理所需含水量，充分混勻后取200g裝入封口瓶，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別于第1、10、30天和第60天取樣，測(cè)定混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)。

1.2.3溫度對(duì)混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)溫度處理，分別為20、30、40、50℃，每個(gè)處理4次重復(fù)。制備混合載體，確保其含水量為30%，巨大普里斯特氏菌菌液接種濃度為10 cfu．mL-1，之后取200g裝入封口瓶，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將其置于各溫度處理的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別于第1、10、30天和第60天取樣，測(cè)定混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)。

1.2.4接種濃度對(duì)混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)的影響

由于巨大普里斯特氏菌發(fā)酵過(guò)程中，在達(dá)到活菌數(shù)10 cfu·mL-1時(shí)開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)曲線平臺(tái)期，此時(shí)菌的濃度高、活性強(qiáng)，因此本試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)接菌濃度，分別為10、10、10 cfu·mL-1，每個(gè)處理4次重復(fù)。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)制備混合載體，確保各混合載體含水量為30%，之后取200g裝入封口瓶，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別于第1、10、30天和第60天取樣，測(cè)定混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1載體不同配比對(duì)巨大普里斯特氏菌有效活茵數(shù)的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理有效活菌數(shù)整體呈先降低后升高的趨勢(shì)（圖1）。接種第1天，CK和ST3的有效活菌數(shù)均顯著高于其他處理。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ST2、ST5的有效活菌數(shù)逐漸升高，至第60天時(shí)，ST2、ST3、ST5處理間的有效活菌數(shù)均無(wú)顯著差異，分別為2.52x108、2.29x108、1.84x 108 cfu·g-1，顯著高于ST1和ST4。由于ST3載體配制中草炭的添加量較多，因此將ST2、ST5作為巨大普里斯特氏菌的適宜載體進(jìn)行下一步條件的優(yōu)化。

2.2含水量對(duì)混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各含水量處理下的ST2、ST5有效活菌數(shù)整體呈先降低后升高的趨勢(shì)（圖2、圖3）。對(duì)于ST2來(lái)說(shuō)，除第10天以外，30%含水量處理下的有效活菌數(shù)在第1、30天和60天時(shí)均顯著高于其他兩個(gè)含水量處理，培養(yǎng)第60天時(shí)達(dá)到最大值2.46x108 cfu·g-1，比20%和40%處理分別提高了9.97%和5.76%，對(duì)于ST5來(lái)說(shuō)，30%含水量處理下的有效活菌數(shù)在第30、60天時(shí)顯著高于其他兩個(gè)含水量處理，并在第60天時(shí)達(dá)到最大值1.8lx108 cfu·g-1，比20%和40%處理分別提高了16.36%和5.34%。因此，載體ST2、ST5在含水量為30%時(shí)更適宜巨大普里斯特氏菌的存活。

2.3溫度對(duì)混合載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)的影響

由圖4、圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，20、30℃和40℃處理下ST2、ST5的有效活菌數(shù)整體呈先降低后升高的趨勢(shì)，而50℃處理下兩種載體的有效活菌數(shù)均持續(xù)下降。除第1天以外，30℃和40℃處理在其他3個(gè)培養(yǎng)時(shí)間的兩種載體的有效活菌數(shù)均顯著高于20℃和50℃，表明低溫和高溫均不利于巨大普里斯特氏菌的定殖，其最適溫度為30～40℃。

2.4接種濃度對(duì)混合載體中巨大普里斯特氏茵有效活茵數(shù)的影響

如圖6和圖7所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，接種濃度為10 cfu·mL-1的ST2、ST5有效活菌數(shù)整體上呈下降的趨勢(shì)，而接種濃度為107、108 cfu·mL-1的ST2、ST5有效活菌數(shù)整體上呈先降低后升高的趨勢(shì)。此外，在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，載體中的有效活菌數(shù)均隨著接種濃度的升高而顯著升高，表明在當(dāng)前試驗(yàn)條件下，ST2和ST5適合作為較高濃度的巨大普里斯特氏菌的載體。

3討論

3.1荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞作為巨大普里斯特氏菌載體的可行性

載體對(duì)功能微生物生存及微生物肥料質(zhì)量控制具有重要意義。目前，一些有機(jī)物料如秸稈、生物炭、菌糠、雞糞等適合功能微生物存活，可替代草炭作為功能微生物載體。本研究中，荔枝剪枝堆肥與蚯蚓糞替代60%～70%草炭時(shí)載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)最高，這可能是因?yàn)椋阂环矫胬笾糁Χ逊屎万球炯S本身自帶一定的養(yǎng)分物質(zhì)，且富含的腐殖質(zhì)等易降解有機(jī)物，可為巨大普里斯特氏菌提供一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于其保存；另一方面，荔枝剪枝堆肥、蚯蚓糞和草炭復(fù)配亦具備一定的孔隙度，通氣性能良好，有利于巨大普里斯特氏菌的存活。本研究中，荔枝剪枝堆肥與蚯蚓糞替代草炭量為60%～70%時(shí)有效活菌數(shù)最高，這與王貝貝、朱玉的完全替代草炭的研究結(jié)果不一致，這可能是由于本研究荔枝剪枝堆肥中的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量較高，而目標(biāo)功能微生物是以降解半纖維素和纖維素為主的巨大普里斯特氏菌，從而導(dǎo)致草炭替代量下降。因此，荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞替代60%～70%草炭適宜巨大普里斯特氏菌生存，可作為該功能微生物的載體。

3.2荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞作為巨大普里斯特氏菌載體的最適條件

載體含水量、溫度以及菌接種濃度直接影響功能微生物的活性。本研究中，載體ST2、ST5含水量為30%時(shí)，巨大普里斯特氏菌的有效活菌數(shù)最高（圖2、圖3）。載體ST2、ST5含水量為20%或40%時(shí)，其有效活菌數(shù)均保持較低的水平，這可能是由于20%的載體水分含量不能滿足巨大普里斯特氏菌生存所需的水分，而40%的載體水分含量較高，過(guò)多的水分易導(dǎo)致載體內(nèi)通氣性能降低，從而不利于巨大普里斯特氏菌的存活。這與李敏清等的研究結(jié)果較為接近。與李敏清等、馬梅榮等的30℃最佳培養(yǎng)溫度的研究結(jié)果相似，本研究中載體ST2、ST5在30℃和40℃培養(yǎng)時(shí)較為適合巨大普里斯特氏菌的生存（圖4、圖5）。微生物都有其適宜生存的環(huán)境溫度。過(guò)低的溫度（20℃）會(huì)減緩巨大普里斯特氏菌的生長(zhǎng)速度，過(guò)高的溫度則會(huì)加速巨大普里斯特氏菌的衰老死亡。而50℃培養(yǎng)時(shí)，載體中巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)初期較高，但隨后降低，這可能與培養(yǎng)初期巨大普里斯特氏菌體內(nèi)吡啶二羧酸含量高且具較高耐熱性有關(guān)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，巨大普里斯特氏菌由芽孢形態(tài)逐漸形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，體內(nèi)的吡啶二羧酸含量就會(huì)迅速降低，其耐熱性能逐漸下降，從而導(dǎo)致巨大普里斯特氏菌有效活菌數(shù)降低。本研究中接種濃度為108cfu·mL-1時(shí)，巨大普里斯特氏菌能夠快速在載體中存活，一方面說(shuō)明該接種濃度下巨大普里斯特氏菌能夠快速利用基質(zhì)中的可利用有機(jī)物實(shí)現(xiàn)菌群的穩(wěn)定，另一方面說(shuō)明荔枝剪枝堆肥和蚯蚓糞的基本性狀已經(jīng)穩(wěn)定，且并未對(duì)巨大普里斯特氏菌產(chǎn)生抑制作用。

4結(jié)論

（1）混合載體ST2[荔枝剪枝堆肥：蚯蚓糞：草炭（質(zhì)量比）=4：2：4]和ST5[荔枝剪枝堆肥：蚯蚓糞：草炭（質(zhì)量比）=4：3：3]均適宜代替草炭作為巨大普里斯特氏菌的載體。

（2）混合載體ST2和ST5的最優(yōu)影響因子均為：含水量30%，吸附溫度30～40℃，菌液接種濃度108cfu·mL-1。