關(guān)鍵詞:人工濕地;氮同位素;微生物群落;氮代謝;功能基因《2022中國生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》顯示湖泊(水庫)等重要水域的氮含量超標(biāo)。水體中氮含量過高,將不利于水生態(tài)健康發(fā)展,所以亟需對(duì)受污染水體進(jìn)行高效脫氮,提高水質(zhì)。包頭南海湖是我國西北部寒旱區(qū)的代表性湖泊之一,近年自然環(huán)境和人為活動(dòng)常導(dǎo)致污染加重,對(duì)南海湖進(jìn)行全年水質(zhì)監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示TN和NH;-N濃度分別高達(dá)5.95mg·L-1和2.39mg·L-1,并且隨季節(jié)變化幅度較大,夏秋季濃度較高。
人工濕地(CWs)是天然濕地的工程模擬,具有良好的水體生態(tài)修復(fù)能力,是一種成本低、生態(tài)友好型水處理技術(shù)。目前,CWs在廢水的二級(jí)和三級(jí)處理中得到廣泛應(yīng)用,主要包括工業(yè)廢水、河湖水和農(nóng)業(yè)廢水。其中人工濕地系統(tǒng)的氮素去除性能受到多種因素的影響,如植物及基質(zhì)類型、微生物群落結(jié)構(gòu)等。植物在脫氮過程中起著至關(guān)重要的作用,同時(shí)對(duì)人工濕地系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)也有較大影響,是影響工藝運(yùn)行的重要因素之一。而基質(zhì)不僅是濕地植物生長(zhǎng)的介質(zhì),又是微生物附著的載體,其本身還可吸附污染物,成為保障人工濕地系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效脫氮的關(guān)鍵。由于組成有差異,各類型人工濕地各組分對(duì)人工濕地的氮去除貢獻(xiàn)度尚不明晰。
近年來,新興的穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,氮穩(wěn)定同位素已被用于生物氮循環(huán)的示蹤研究。基于此,本研究采集南海湖原水,通過對(duì)比不同基質(zhì)組成的有植物、無植物人工濕地系統(tǒng),通過探究其對(duì)氮素的去除效果優(yōu)選人工濕地組成。并通過向最優(yōu)組中投加N同位素進(jìn)行氮示蹤,實(shí)現(xiàn)對(duì)人工濕地脫氮效果的準(zhǔn)確定量及各組分氮的去除貢獻(xiàn)率量化;利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落多樣性進(jìn)行探究,研究人工濕地中微生物對(duì)反硝化過程的影響,旨在闡明人工濕地對(duì)地表水體氮素削減機(jī)制,為人工濕地設(shè)計(jì)及功能的優(yōu)化提供理論支撐。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)裝置與運(yùn)行
由于垂直下行流人工濕地占地面積小,滲透速率快且在脫氮方面優(yōu)勢(shì)顯著,因此本實(shí)驗(yàn)采用白色聚乙烯圓柱桶裝置構(gòu)建高為0.6m,內(nèi)徑15cm,體積為3.38L規(guī)模的垂直流人工濕地系統(tǒng)(圖1)。水樣取自包頭南海湖。在基質(zhì)選擇上,查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)和實(shí)際應(yīng)用案例,并考慮實(shí)用性和使用壽命等因素,選用了3種材料,分別為陶粒(粒徑2~4mm)、煤渣(粒徑2~5mm)和沸石(粒徑3~5mm),這些基質(zhì)具有儲(chǔ)量多,成本低,且吸附能力強(qiáng),對(duì)環(huán)境無害等優(yōu)點(diǎn),滿足實(shí)驗(yàn)需求。基質(zhì)層上表面覆蓋防止基質(zhì)流失和便于植物定植的生態(tài)席墊(厚度為5mm)。為模擬流態(tài)水動(dòng)力環(huán)境,在盛放試驗(yàn)用水的塑料桶內(nèi)安裝同一規(guī)格的微型蠕動(dòng)水泵(流量為10L·h-1)。
實(shí)驗(yàn)所選用的基質(zhì)煤渣購置于網(wǎng)絡(luò)商家,沸石購置于河南同德環(huán)??萍加邢薰荆樟Y徶糜陟柫x市水處理藥劑公司??紤]到南海濕地中水生植物大部分是蘆葦,且蘆葦有較高的脫氮效率,因此選用蘆葦作為實(shí)驗(yàn)植物。
1.1.1人工濕地系統(tǒng)氮素去除效果分析
每組人工濕地只填充兩種基質(zhì),并各設(shè)一組無植物人工濕地,探究植物對(duì)脫氮的影響。因此共設(shè)6組實(shí)驗(yàn),分為有植物實(shí)驗(yàn)組陶粒+煤渣(TMZ)、陶粒+沸石(TFZ)、沸石+煤渣(FMZ),和無植物對(duì)照組(陶粒+煤渣(TM)、陶粒+沸石(TF)、沸石+煤渣(FM)。各類基質(zhì)填充厚度為15cm,總厚度均為30cm,水力停留時(shí)間為24h。實(shí)驗(yàn)期間,每5d在出水口取100mL水樣過0.45um濾膜后,立即進(jìn)行NH4-N、N02-N、N03-N和TN濃度的測(cè)定。
1.1.2N示蹤對(duì)人工濕地系統(tǒng)各組分的N03去除量化
選用氮去除效果最佳的人工濕地繼續(xù)開展各組分的N03去除量化研究。準(zhǔn)確稱量N同位素標(biāo)記的硝酸鉀447.06mg(N為64mg)加入蓄水箱中,實(shí)驗(yàn)進(jìn)水體積為2.5L,攪拌均勻后加入實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)。設(shè)置系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)間為15d,分別在第5、10、15天對(duì)人工濕地植物、上層基質(zhì)、下層基質(zhì)和出水口進(jìn)行破壞性采樣。植物樣品放入冰箱0℃冷藏保存,水樣和基質(zhì)樣品放人冰箱-20℃冷凍保存,所有樣品于實(shí)驗(yàn)第16天用冰袋泡沫箱保存送往科學(xué)指南針天津辦事處進(jìn)行氮同位素含量檢測(cè)。
1.2分析方法
TN和NH-N分別采用過硫酸鉀紫外分光光度法和納氏試劑分光光度法測(cè)定;N02-N和N03-N測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法。
1.3高通量測(cè)序
為探究反應(yīng)系統(tǒng)中微生物群落變化,分別采集系統(tǒng)中上、下兩層基質(zhì)及植物根部樣品。有植物人工濕地系統(tǒng),基質(zhì)樣品煤渣、陶粒依次標(biāo)號(hào)為A、B;植物根部樣品分別為C。無植物人工濕地系統(tǒng),基質(zhì)樣品煤渣、陶粒依次標(biāo)號(hào)為A、B。進(jìn)行2次重復(fù)采樣,共采集10個(gè)樣品,將離心、抽濾后的樣品放置于-80℃條件下干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行16SrDNA高通量測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)選擇通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG -3')和806R(5'-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3')對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因中的V3-V4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件參數(shù)為:95℃預(yù)變性溫度下保持3min;95℃變性溫度下保持30s,55℃退火溫度下保持30s,72℃延伸溫度下保持45s,進(jìn)行27次循環(huán)擴(kuò)增;72℃下終止延伸10min,10℃至反應(yīng)結(jié)束,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用美國AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)定量分析,之后構(gòu)建MiSeq文庫,利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,將所得序列通過OTUs(運(yùn)算分類單位)以97%的相似度進(jìn)行聚類,本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序工作由測(cè)序公司完成。
1.4數(shù)據(jù)分析與計(jì)算
為量化人工濕地中各組分N去除,需對(duì)人工濕地各組分樣品中N含量進(jìn)行計(jì)算。
2結(jié)果與討論
2.1人工濕地系統(tǒng)對(duì)TN的去除
各人工濕地系統(tǒng)中TN的起始濃度均為4.59mg·L-1,6組人工濕地出水中TN濃度隨時(shí)間變化如圖2所示。6組人工濕地對(duì)TN的去除效果存在著顯著差別,含植物的人工濕地在兩個(gè)周期中TN的含量均有顯著降低;未種植植物的人工濕地中TN含量則表現(xiàn)為先升高后降低。經(jīng)過各組人工濕地系統(tǒng)的凈化后,TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中的TN濃度分別下降至(2.70±0.12)、(3.71±0.11)、(3.09±0.12)、(3.47±0.14)、(3.07±0.13)、(3.27±0.11)mg·L-1。有植物組中陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)TN的去除效果最好,去除率為41.18%+2.61%,無植物組中是陶粒+沸石人工濕地系統(tǒng)對(duì)TN的去除效果最好,去除率為28.76%±2.40%。有植物的人工濕地系統(tǒng)比無植物的人工濕地系統(tǒng)具有更高的TN去除率,說明植物對(duì)TN的去除性能影響較大。一方面由于人工濕地系統(tǒng)上層基質(zhì)中存在植物的一些細(xì)小根系,植物根系本身可以吸附一些氮素污染,同時(shí)也可以附著微生物并提供氧氣,有利于微生物的生長(zhǎng),從而增強(qiáng)微生物對(duì)氮素的去除;另一方面植物可促進(jìn)基質(zhì)的氮吸附作用,植物的根系可以改善基質(zhì)的孔隙結(jié)構(gòu),幫助基質(zhì)緩解堵塞,更利于基質(zhì)對(duì)南海原水中氮素的吸收。因此植物的加入提高了人工濕地整體的氮去除性能。
2.2人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除
6組人工濕地出水中NH4-N濃度隨時(shí)間變化如圖3所示。各人工濕地均能高效凈化南海湖的含氮污染物。各人工濕地系統(tǒng)出水中NH4-N都有下降的趨勢(shì),整個(gè)過程有植物組NH;-N的濃度低于無植物組。實(shí)驗(yàn)29d后,TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中的NH4-N濃度從初始的2.28mg·L-1分別下降到(1.13±0.06)、(1.20±0.07)、(1.27±0.06)、(1.58±0.05)、(1.32±0.08)、(1.38±0.07)mg·L-1。結(jié)果顯示,有植物組中陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除效果最好,去除率為50.44%+2.63%,而無植物組中沸石+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除效果最好,去除率為42.11%±3.51%;同時(shí)在陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)中植物的作用在NH4-N的去除中體現(xiàn)最明顯。植物對(duì)NH4-N的去除作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面,一方面,植物可以直接吸收NH4N。另一方面,植物也有分泌氧氣的作用,可以將空氣中的氧氣傳遞至根部區(qū)域,南海湖原水在人工濕地中,表層溶解氧充足,在好氧的環(huán)境中,硝化反應(yīng)條件適宜,將NH4-N轉(zhuǎn)化為N02-N和N03-N。此外,通過無植物組的人工濕地出水中NH4-N的29d變化結(jié)果可知,基質(zhì)對(duì)NH4-N的吸附作用也是一種重要的氮去除方式。因此在本研究中,NH4-N的去除主要依賴于基質(zhì)的吸附、植物的吸收與硝化反應(yīng)。
2.3人工濕地系統(tǒng)對(duì)N03-N的去除
6組人工濕地出水中N03-N濃度隨時(shí)間變化如圖4所示。各人工濕地系統(tǒng)中N03-N的起始濃度平均為2.59mg·L-1,經(jīng)各組人工濕地系統(tǒng)的凈化后,TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中N03-N的濃度分別為(1.53±0.06)、(1.84±0.05)、(1.76±0.05)、(2.07±0.07)、(2.09+0.08)、(1.83±0.06)mg·L-1之間。并且運(yùn)行29d后,有植物組陶粒+煤渣人工濕地系統(tǒng)對(duì)N03-N的去除效果最好,去除率為40.93%+2.32%,而無植物組中陶粒+沸石人工濕地系統(tǒng)對(duì)NH4-N的去除效果最好,去除率為29.34%±2.33%。3種有植物的人工濕地對(duì)N03-N的去除率均高于無植物的,即植物在人工濕地系統(tǒng)中對(duì)N03-N的去除起到重要作用。植物在N03-N去除過程中主要表現(xiàn)為植物的直接吸收。含植物的人工濕地,特別是具有發(fā)達(dá)根系的植物,可以吸收水中更多的N03-N以供其生長(zhǎng)發(fā)育。此外,人工濕地植物根部可以富集微生物,具有根際效應(yīng),能夠產(chǎn)生氧氣和分泌物,并被微生物用于生長(zhǎng)繁殖。植物可以通過影響微生物的活性而對(duì)人工濕地中氮污染物的去除效果產(chǎn)生影響。在有植物的人工濕地系統(tǒng)中,特別是在植物根系中,有較多的微生物和較強(qiáng)的生物活性;而不含栽種植物的人工濕地系統(tǒng)因?yàn)橹参锏娜笔В环矫?,基質(zhì)缺乏反硝化所需的微生物、酶等;另一方面,基質(zhì)中缺乏有氧與無氧的過渡環(huán)境,導(dǎo)致底物中N03-N的持續(xù)積累,致使底物中N03-N的濃度非但沒有下降,反而升高。
2.4人工濕地系統(tǒng)對(duì)N02-N的去除
6組人工濕地出水中N02-N濃度隨時(shí)間變化如圖5所示。各人工濕地系統(tǒng)對(duì)N02-N的去除均表現(xiàn)出了較好的效果。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí),人工濕地系統(tǒng)進(jìn)水的N02-N初始濃度為0.15~0.16mg·L-1,人工濕地系統(tǒng)運(yùn)行29d后,TMZ、FMZ、TFZ、TM、FM、TF水體中N02-N的濃度分別降低到(0.039±0.003)、(0.053±0.004)、(0.041±0.003)、(0.061±0.004)、(0.064±0.005)、(0.058±0.003)mg·L-1,去除率均達(dá)到58%以上,最高可達(dá)76.31%。從圖5中可以看出,相較于其他氮素指標(biāo)的去除,有植物的陶粒+煤渣組并未在N02-N的去除方面與無植物組拉開差距,這可能是因?yàn)镹02-N在人工濕地環(huán)境中的轉(zhuǎn)化和去除過程相對(duì)復(fù)雜。N02-N屬于一種相對(duì)不穩(wěn)定的化合物,容易轉(zhuǎn)化為其他更穩(wěn)定的形態(tài),如N03-N或NH4N。這些轉(zhuǎn)化過程可能受到人工濕地環(huán)境中多方面因素的影響,包括pH值、溫度、基質(zhì)孔隙大小、微生物活性等。因此,植物的存在可能對(duì)這些轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生一定的影響,但這種影響比較微弱。此外,在0~9d的時(shí)間內(nèi),與陶粒+煤渣組相比,陶粒+沸石、沸石+煤渣基質(zhì)的有植物組N02-N的去除效果對(duì)比無植物組有顯著差異。說明含有沸石的基質(zhì)組合更能促進(jìn)人工濕地N02-N的去除,由于沸石的表面結(jié)構(gòu)較粗糙且多孔,在水中有利于離子的吸附與交換且不改變晶體結(jié)構(gòu)。同時(shí)具有更大比表面積,為微生物提供了更多的依附場(chǎng)所和活動(dòng)空間。但是隨著吸附的污染物越多,基質(zhì)出現(xiàn)明顯堵塞,去除率下降,導(dǎo)致出水N02-N濃度逐漸趨于穩(wěn)定。
2.5N同位素在人工濕地中的絕對(duì)豐度質(zhì)量
為進(jìn)一步研究人工濕地系統(tǒng)中各組分對(duì)N03-N的去除貢獻(xiàn)度,采用陶粒+煤渣組人工濕地進(jìn)行氮同位素標(biāo)記定量實(shí)驗(yàn),選擇煤渣作為上層基質(zhì),陶粒作為下層基質(zhì)。基質(zhì)和植物中氮含量、原子百分比(AT%)和同位素N的絕對(duì)豐度分別列于表1。其中,氮含量指的是基質(zhì)和植物中氮元素占整體物質(zhì)含量的百分比。由表1可知,植物根際的氮含量為0.57%,上層基質(zhì)和下層基質(zhì)氮含量分別為0.18%和0.13%,植物根際氮含量遠(yuǎn)高于基質(zhì)。原因是基質(zhì)本身只通過吸附作用去除氮,而植物能利用基質(zhì)中的氮元素合成自身的物質(zhì);此外,基質(zhì)本體含量高也致使其氮含量占比低于植物。
i5N同位素的絕對(duì)豐度是指一種物質(zhì)中N同位素的凈含量,它是根據(jù)含氮量和原子百分比進(jìn)行計(jì)算的。根據(jù)AT%數(shù)值及N03-N濃度,計(jì)算出實(shí)驗(yàn)原水N的絕對(duì)豐度,見圖6。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),原水中的N的絕對(duì)豐度是0.396mg·L-1,經(jīng)過5d的處理后,N的絕對(duì)豐度降至0.230mg·L-1;15d后降到0.134mg·L-1,此時(shí)人工濕地對(duì)N的去除率達(dá)到了66.16%.也再次反映出該人工濕地良好的氮去除效果。植物和基質(zhì)中N的絕對(duì)豐度如表1所示:在上層基質(zhì)中,單位質(zhì)量的基質(zhì)中N濃度最高,其絕對(duì)豐度可達(dá)8.64x10-3mg·g-1,單位質(zhì)量基質(zhì)的吸附量也最大;下層基質(zhì)中,N的含量最小,絕對(duì)豐度為6.31x10-3mg·g-1,它的吸附能力是最小的。植物中N的絕對(duì)豐度達(dá)到55.29mg·g-1,明顯高于基質(zhì),說明單位質(zhì)量植物對(duì)氮的吸收量較大。
2.6人工濕地各組分N03-N去除的貢獻(xiàn)率
人工濕地各組分N去除總量變化如表2所示,在15d后,有植物組植物、上層基質(zhì)、下次基質(zhì)以及微生物的N去除總量分別為13.49、12.51、11.04、11.59mg;而無植物各組分的N去除總量分別為11.76、9.01、15.64mg。從整個(gè)過程來看,植物的N去除總量在0~5、10~15d變化較小,而在5~10d變化較大,即對(duì)N的吸收速率呈現(xiàn)出先緩后快再緩的趨勢(shì)。由于初期是植物對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)階段,故N的吸收在初期并不顯著,適應(yīng)后則會(huì)加速對(duì)N03-N的吸收。在初期,上層基質(zhì)對(duì)N03-N的吸收發(fā)揮更重要作用。試驗(yàn)中后期,由于土壤養(yǎng)分、環(huán)境等因素的影響,植物對(duì)N的積累速度減慢,但此時(shí)的微生物已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境并逐漸發(fā)揮作用,加快對(duì)N的吸收。此外,對(duì)比有植物和無植物組發(fā)現(xiàn),有植物組微生物中N去除總量低于無植物組,這是由于無植物組對(duì)N03-N有去除作用的只有基質(zhì)與微生物,而有植物組中植物也能吸收氮,從而為人工濕地系統(tǒng)氮素去除貢獻(xiàn)一定比例,使得微生物對(duì)N03-N去除的量減少;同時(shí)植物根系有泌氧功能,一定程度制約微生物對(duì)氮的反硝化。因此無植物組微生物的脫氮效果好于有植物組。
同時(shí)以各組分N同位素的去除總量為依據(jù),可以得出有植物人工濕地植物、基質(zhì)和微生物組分在15d后對(duì)N03-N去除的貢獻(xiàn)率。植物的吸收和基質(zhì)的吸附對(duì)人工濕地系統(tǒng)N03-N去除的貢獻(xiàn)率分別為27.74%和48.43%,微生物對(duì)N03-N的去除貢獻(xiàn)率占23.83%。但從表2可以看出,實(shí)驗(yàn)的中后期植物與基質(zhì)對(duì)N的吸收變得緩慢,而微生物則加快了對(duì)N03-N的去除,說明在人工濕地穩(wěn)定運(yùn)行后微生物將會(huì)對(duì)人工濕地N03-N的去除起主導(dǎo)作用。
2.7植物對(duì)微生物多樣性的影響
5組樣品的微生物多樣性指數(shù)如表3所示,通過物種多樣性指數(shù)(Simpson)與豐富度指數(shù)(Chao、Ace)變化情況可知,5組樣品中的多樣性及豐富度均有較大的差異,有植物組的豐富度較無植物組有顯著提升。植物的加入使人工濕地中的微生物數(shù)量得到了增加,從而提高了人工濕地的氮凈化性能。植物能向基質(zhì)中輸送氧氣,維持底物中微生物的活力和多樣性;植物的生長(zhǎng)和代謝,凋落物和植物根系分泌物等也可以為微生物的繁殖和發(fā)育提供能量,豐富的微生物群落物種多樣性強(qiáng)化了人工濕地系統(tǒng)去除氮素的能力。
2.8植物對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響
各組人工濕地系統(tǒng)中微生物門水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖7(a)所示。各組人工濕地系統(tǒng)中基質(zhì)及植物根系上的細(xì)菌共鑒定出53個(gè)菌門。其中相對(duì)豐度前10為優(yōu)勢(shì)菌門,主要包括Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteriota(放線菌門)、Bacteroidota(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Patescibacteria(髕骨菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Acidobacteriota(酸桿菌門)和Cyanobacteria(藍(lán)藻門)。Proteobacteria的豐度最高,相關(guān)研究表明,其大部分菌門均參與氮循環(huán)途徑,在生物脫氮過程中具有至關(guān)重要的作用。對(duì)比兩組人工濕地系統(tǒng),植物中的Bacteroidota數(shù)量明顯高于兩組基質(zhì),Bacteroidota為異養(yǎng)細(xì)菌,能夠分解水中的碳水化合物,利用水中的N03-N,參與反硝化作用。Firmicutes是具有脫氮功能的互養(yǎng)細(xì)菌,對(duì)比5組樣品,有植物組中Firmicutes相對(duì)豐度占比均較高,故有植物人工濕地系統(tǒng)脫氮效果更佳。
各組人工濕地系統(tǒng)中微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)組成如圖7(b)所示,各系統(tǒng)的群落組成存在一定的差異,主要表現(xiàn)在有植物的人工濕地系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌屬主要分布在P.seudomona.s( 49.08%~62.69%)、P.seudarthro-bacter(4.11%~4.93%)和Malilcia(3.25%~10.78%)菌屬;無植物系統(tǒng)主要為L(zhǎng)imnobacter (40.32%~51.58%)、Nevskia (9.23%~11.57%)和Rhodobacter(3.04%~5.45%)菌屬。此外,不同于有植物系統(tǒng),無植物系統(tǒng)兩基質(zhì)表面的微生物群落組成表現(xiàn)出明顯不同,陶粒中Saccharimonadaceae、Rhodobacter、Azoar-cus等菌屬的比例顯著提高,suiDritaiea、Rhodoferax和Sphingomonas等菌屬顯著降低。說明植物的加入使兩個(gè)基質(zhì)的微生物系統(tǒng)逐漸均質(zhì)化,使出水水質(zhì)更穩(wěn)定。植物根系和基質(zhì)附著的微生物也有明顯的不同,植物根系的優(yōu)勢(shì)菌屬豐度更大,尤其是Flavobacteri-um菌屬占比明顯高于其他兩基質(zhì)。Flavobacterium是常見的植物促生菌之一,可以溶解磷酸鹽,制造生長(zhǎng)激素,推測(cè)植物的加入提高了此類菌屬的占比,反過來又促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)氮素的循環(huán)作用,從而通過影響基質(zhì)中氮素的分布間接影響基質(zhì)所附著微生物的群落結(jié)構(gòu)。
2.9微生物氮代謝功能基因分析
通過對(duì)植物根系C、有植物組煤渣A、陶粒B和無植物組煤渣A、陶粒B’基質(zhì)樣品的微生物氮代謝基因功能的鑒定與分析,篩選出具有脫氮功能的優(yōu)勢(shì)基因。目前,國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)的氮代謝功能基因有:亞硝酸還原酶(NIR)基因nirS/nirK;硝酸還原酶(NR)基因narG/napA;一氧化氮(NO)還原酶基因norB;一氧化二氮(N20)還原酶基因nosZ;單加氧酶(AMO)基因aomA;羥胺氧化酶(HAO)基因hao;亞硝酸鹽氧化酶(NXR)基因nor等。在各系統(tǒng)中鑒定出與氮代謝相關(guān)的功能基因主要有參與反硝化過程的narG/narZ、narH/narY.nirK、nirS和參與固氮過程的nasA、nirA、nirB,如圖8所示。不論是在基質(zhì)還是植物中,nasA與nirB基因的豐度都遠(yuǎn)高于其他基因,這表明固氮過程是本實(shí)驗(yàn)人工濕地微生物氮代謝的主要途徑。此外,有植物人工濕地系統(tǒng)不同基質(zhì)表面微生物nirS基因豐度明顯高于無植物系統(tǒng),說明植物能有效促進(jìn)人工濕地系統(tǒng)中微生物的氮代謝,主要體現(xiàn)在反硝化過程中。而另一個(gè)反硝化過程的nirK基因,其在植物根系中的基因豐度明顯高于基質(zhì)中的。植物可以通過根系分泌多種初級(jí)代謝物,例如糖和有機(jī)酸等,并釋放到水體中,或附著在基質(zhì)表面,被微生物吸收利用,這改變了根際區(qū)域微生物的結(jié)構(gòu)與多樣性,從而促進(jìn)人工濕地的反硝化速率以及反硝化基因豐度,對(duì)氮素去除的反硝化過程中微生物的作用產(chǎn)生了不容忽視的影響。但也可以看出,無植物人工濕地基質(zhì)中nirB基因豐度大于有植物系統(tǒng),說明在人工濕地固氮過程中,植物反而產(chǎn)生了負(fù)反饋。這是由于植物可以通過光合作用產(chǎn)生氧氣,而參與固氮過程的微生物周圍氧氣濃度越高,對(duì)固氮作用的抑制程度就越大,即固氮速率與氧氣濃度成反比關(guān)系,同時(shí)也會(huì)影響基質(zhì)中固氮基因的豐度。
為了深入研究植物對(duì)人工濕地系統(tǒng)氮去除機(jī)理的影響,通過高通量技術(shù)獲得不同處理組的非冗余基因集,將全部基因片段與KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫內(nèi)氮代謝相關(guān)的酶基因信息進(jìn)行比對(duì),獲得氮循環(huán)過程中相關(guān)功能酶的豐度。在本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出的氮代謝相關(guān)功能酶的具體功能和名稱如表4所示。有植物和無植物人工濕地豐度前三的功能酶相同,為硝酸還原酶(EC:1.7.99.4)、亞硝酸鹽還原酶(EC:1.7.1.15)、谷氨酸脫氫酶(EC:1.4.1.2)。相比于無植物系統(tǒng),有植物人工濕地中顯著上調(diào)了NADP依賴型(谷氨酸脫氫酶,EC:1.4.1.4)、谷氨酸合酶(鐵氧還蛋白,EC:1.4.7.1)、固氮酶(EC:1.18.6.1)、一氧化氮還原酶(細(xì)胞色素c,EC:1.7.2.5)、氰化酶(EC:4.2.1.104)、羥胺還原酶(EC:1.7.99.1)、亞硝酸鹽還原酶(EC:1.7.2.1)、氨基甲酸激酶(EC:2.7.2.2)、一氧化二氮還原酶(EC:1.7.2.4)、鐵氧還蛋白一硝酸還原酶(EC:1.7.7.2)、亞硝酸鹽還原酶(細(xì)胞色素,氨形成,EC:1.7.2.2)豐度,表明植物的加入有促進(jìn)固氮、硝化、反硝化以及異化硝酸鹽過程的作用。同時(shí)觀察到植物根系微生物中的氮代謝相關(guān)功能酶豐度與兩基質(zhì)層幾乎一致,說明功能酶在整個(gè)有植物的濕地中分布均勻,整體氮代謝作用穩(wěn)定。
3結(jié)論
(1)凈化效果最佳的組合為陶粒+煤渣,相比無植物系統(tǒng),有植物系統(tǒng)的TN、NH;-N、N03-N和N02-N去除率分別為(41.18±2.61)%、(50.44±2.63)%、(40.93±2.32)%、(74.34±1.97)%,有植物人工濕地具有較好的氮去除效果及反硝化作用。3組有植物人工濕地系統(tǒng)對(duì)南海湖水體氮污染物的總體凈化效果排序?yàn)樘樟?煤渣gt;陶粒+沸石gt;沸石+煤渣。無植物系統(tǒng)對(duì)南海湖水體氮污染物的凈化效果依次為陶粒+沸石gt;陶粒+煤渣gt;沸石+煤渣。
(2)基質(zhì)中N絕對(duì)豐度值低于植物中的,單位質(zhì)量植物吸收氮素能力更強(qiáng)。N同位素的示蹤量化了植物、基質(zhì)和微生物對(duì)人工濕地系統(tǒng)N03-N去除的貢獻(xiàn)率分別為27.74%、48.43%和23.83%。在人工濕地建設(shè)初期,N03-N的去除主要是由上層基質(zhì)完成;穩(wěn)定運(yùn)行后,N03-N的去除主要以微生物為主。
(3)在有植物人工濕地系統(tǒng)中,參與氮循環(huán)的優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度較高,促進(jìn)系統(tǒng)的脫氮性能。此外,有植物人工濕地系統(tǒng)基質(zhì)中的nirS基因、植物根系的nirK基因豐度顯著增加,植物有效促進(jìn)了人工濕地系統(tǒng)中微生物的反硝化能力,且植物根系微生物中的氮代謝相關(guān)功能酶豐度與兩基質(zhì)層幾乎一致,即有植物的濕地中整體氮代謝效果相對(duì)穩(wěn)定。