擬南芥中異源過(guò)表達(dá)CsLOX6和CsHPL2基因提高植株耐鹽性和耐旱性

摘要：探究CsLOX6基因和CsHPL2基因?qū)M南芥（Arabidopsis thaliana）生長(zhǎng)以及對(duì)干旱和鹽脅迫抗性的影響，以野生型擬南芥（WT）、轉(zhuǎn)基因型擬南芥（OE-CsLOX6、OE-CsHPL2）、突變體型擬南芥（TB-Atlox5）為材料，通過(guò)表型觀(guān)察、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析等方法評(píng)估4種擬南芥的耐旱性、耐鹽性。結(jié)果表明，OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長(zhǎng)均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長(zhǎng)明顯低于其他基因型植株。OE-CsLOX6、OE-CsHPL2和WT的代謝物含量存在較大差異，OE-CsLOX6和WT有64個(gè)差異代謝物，其中有6個(gè)上調(diào)，58個(gè)下調(diào)；OE-CsHPL2和WT有63個(gè)差異代謝物，其中有9個(gè)上調(diào)，54個(gè)下調(diào)。過(guò)表達(dá)CsLOX6基因和CsHPL2基因可以提高擬南芥對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的抗性。在鹽脅迫和干旱脅迫下，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2的丙二醛含量要顯著低于野生型植株，膜質(zhì)過(guò)氧化程度低，SOD、POD和CAT活性要明顯高于野生型，提高了植株的抗氧化能力，葉片長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型植株。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；異源過(guò)表達(dá)；CsLOX6基因；CsHPL2基因；耐鹽性；耐旱性；脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S642.2 RF58snVPgIRUvMo8rYGR6Wb6UgLlQLpyvCKz6OzHkYY=文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）10-0165-11

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.030 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： To explore the effects of CsLOX6 gene and CsHPL2 gene on the growth of Arabidopsis thaliana and its resistance to drought and salt stress， wild-type Arabidopsis thaliana （WT）， transgenic Arabidopsis thaliana （OE-CsLOX6， OE-CsHPL2）， and mutant Arabidopsis thaliana （TB-Atlox5） were used as materials， and the drought and salt tolerance of the four Arabidopsis thaliana species were evaluated through phenotype observation， transcriptome， and metabolomics analysis. The results showed that the aboveground fresh weight and root length of OE-CsLOX6 were significantly higher than those of other genotypes， and the underground fresh weight was significantly higher than that of other genotypes；the aboveground fresh weight， underground fresh weight， and root length of OE-CsHPL2 plants were significantly lower than those of other genotypes. There were significant differences in the metabolite content between OE-CsLOX6， OE-CsHPL2， and WT. OE-CsLOX6 and WT had 64 differential metabolites， of which 6 were upregulated and 58 were downregulated；OE-CsHPL2 and WT had 63 differential metabolites， of which 9 were upregulated and 54 were downregulated. Overexpression of CsLOX6 gene and CsHPL2 gene could enhance the resistance of Arabidopsis thaliana to salt stress and drought stress. Under salt stress and drought stress， compared with wild-type plants， the malondialdehyde content of OE-CsLOX6 and OE-CsHPL2 was significantly lower， and the degree of membrane peroxidation was lower，the activities of SOD， POD， and CAT enzymes were significantly higher than those of the wild type， which improved the antioxidant capacity of the plants and resulted in significantly better leaf growth compared to the wild type plants.

Key words： Arabidopsis thaliana； heterologous overexpression； CsLOX6 gene； CsHPL2 gene； salt tolerance； drought tolerance； stress

植物揮發(fā)性物質(zhì)（Volatiles compounds，VOCs）來(lái)自一系列營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、脂肪酸、類(lèi)胡蘿卜素等，由初生代謝物和次生代謝物產(chǎn)生，通常是低分子的親脂性化合物。氧脂素是脂肪酸氧化LOX-HPL途徑的氧合衍生物，在許多情況下參與植物防御反應(yīng)或作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。有研究表明，青草味的C6醛類(lèi)香氣和花香味的C9醛類(lèi)香氣是構(gòu)成黃瓜果實(shí)香氣揮發(fā)物的主要成分［1］，約占總揮發(fā)性物質(zhì)的70%～95%。黃瓜中脂肪酸的氧化有兩條途徑，一條是生成茉莉酸的途徑［2］，另一條為體內(nèi)僅存的短鏈醛類(lèi)物質(zhì)合成途徑：LOX-HPL途徑［3］，即體內(nèi)游離的α-亞麻酸和亞油酸在LOX酶的作用下加上分子氧轉(zhuǎn)變成13-或9-氫過(guò)氧化物亞麻酸（HPOT）和氫過(guò)氧化物亞油酸（HPOD），然后通過(guò)脂氫過(guò)氧化物裂解酶（HPL）、烯醛異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化成短鏈C6、C9醛類(lèi)物質(zhì)，從而形成令人倍感清新的芳香氣味［4，5］，如圖1所示［6］。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在6個(gè)AtLOX基因，南瓜中存在18個(gè)CmLOX基因，黃瓜中存在23個(gè)CsLOX基因［7］，表明在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要不同脂氧合酶基因的調(diào)控。利用擬南芥6個(gè)突變亞型的每種突變體系，發(fā)現(xiàn)LOX2參與植物揮發(fā)性物質(zhì)的合成，與受傷的組織相比，在完好的組織中LOX2的活性被抑制，受傷時(shí)被激活［8］。擬南芥中4種13-LOXs都有助于受損葉片中茉莉酸鹽的合成，其中LOX6對(duì)合成茉莉酸鹽的相對(duì)貢獻(xiàn)更高，合成的強(qiáng)度隨離葉尖創(chuàng)口距離增加而增加，LOX6產(chǎn)物可能發(fā)揮著信號(hào)作用［9，10］。超表達(dá)番茄LOX基因可以提高番茄植株的茉莉酸含量，并且提高植株對(duì)病原菌、昆蟲(chóng)、高溫和機(jī)械損傷的抵抗能力［11］。沉默番茄果實(shí)和葉片的LOXC基因，綠葉揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著降低［12］。將柿子的DkLOX3基因轉(zhuǎn)入番茄和擬南芥中，發(fā)現(xiàn)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的耐干旱和耐鹽能力有所增強(qiáng)［13］。

Matsui等［14］首先從辣椒中克隆得到HPL的cDNA全長(zhǎng)序列后，人們相繼從擬南芥、黃瓜、甜瓜、紫花苜蓿和馬鈴薯等多種植物中獲得了HPL的cDNA，并且發(fā)現(xiàn)除黃瓜HPL基因和甜瓜HPL基因的編碼產(chǎn)物同時(shí)具有9-HPL、13-HPL 催化功能外，其他已經(jīng)克隆出HPL基因的編碼產(chǎn)物只具有13-HPL功能［15］。劉苗苗等［16］發(fā)現(xiàn)13-CsHPL基因在受到非生物脅迫，如干旱、NaCl、甲基紫精、H2O2、損傷與外源激素MeJA、SA和灰霉侵染處理后其表達(dá)水平均顯著升高。Halitschke等［17］發(fā)現(xiàn)HPL表達(dá)水平較低的轉(zhuǎn)基因煙草在受到草食動(dòng)物攻擊后，相關(guān)防御基因的表達(dá)量降低。在缺少HPL基因的馬鈴薯植株中發(fā)現(xiàn)蚜蟲(chóng)的繁殖能力增加了2倍，表明HPL衍生物對(duì)蚜蟲(chóng)性能有負(fù)面影響［18］。

脂肪酸的氧化需要借助脂氧合酶（LOX）、脂氫過(guò)氧化物裂解酶（HPL）的活性，在遭受逆境時(shí)，植株體內(nèi)脂肪酸衍生物含量會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速升高（如短鏈揮發(fā)物質(zhì)醛醇等是主要的衍生物），相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)也不斷發(fā)生來(lái)抵抗脅迫對(duì)自身的損害。外施LOX-HPL途徑產(chǎn)物后，植物抵御逆境的能力得到提升，研究人員猜測(cè)這些組分可能直接參與逆境反應(yīng)，也可能作為植株自身或相鄰植株間傳遞信息的信號(hào)分子發(fā)生作用。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果在黃瓜的LOX-HPL氧化途徑上篩選出CsLOX6基因和CsHPL2基因。在擬南芥上分別異源過(guò)表達(dá)這2個(gè)基因，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和突變體植株進(jìn)行表型觀(guān)察和抗脅迫研究，探究這2個(gè)基因在抗逆過(guò)程及信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥材料為哥倫比亞Col-0（WT），轉(zhuǎn)基因型擬南芥材料為實(shí)驗(yàn)室前期過(guò)表達(dá)所得的轉(zhuǎn)基因植株（OE-CsLOX6、OE-CsHPL2），突變體型擬南芥材料（TB-Atlox5）購(gòu)于A(yíng)rashare（Non-profit Arabidopsis Share Center），檢索網(wǎng)站為www. Ara share.cn。

1.2 方法

1.2.1 代謝組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)定 代謝組和轉(zhuǎn)錄組材料為野生型哥倫比亞Col-0和過(guò)表達(dá)得到的轉(zhuǎn)基因植株，保證相同的生長(zhǎng)條件，待植株長(zhǎng)至4周大小時(shí)，取葉片送至歐易生物科技有限公司進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)定。

1.2.2 生根分析 種植4種基因型（野生型1種、轉(zhuǎn)基因型2種、突變體型1種）擬南芥，從中各選取長(zhǎng)勢(shì)、大小一致的植株，從穴盤(pán)中將擬南芥的根部取出（為減少對(duì)根部傷害可攜帶較多營(yíng)養(yǎng)土），置于去離子水中輕柔洗凈，重復(fù)多次，盡量避免對(duì)根部的損傷，洗凈后統(tǒng)一置于吸水紙上吸除多余水分，留待后續(xù)的干、鮮重稱(chēng)量以及根長(zhǎng)分析。

1.2.3 葉綠素含量的測(cè)定 取0.1 g擬南芥葉片，剪碎后放入50 mL離心管中，加入20 mL 95%的乙醇，避光放置40 h，充分提取葉綠素。用95%的乙醇調(diào)零，在波長(zhǎng)655、649、470 nm下測(cè)定吸光度。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）分析 用Trizol法提取總RNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈，作為qPCR的模板。qRT-PCR反應(yīng)體系如表1所示，每個(gè)cDNA樣品進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。體系配置好后加入96孔板中，采用iQ?5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)（95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s），71個(gè)循環(huán)（95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s）。以黃瓜的持家基因Actin作為內(nèi)標(biāo)，目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算參照2-ΔΔCT法。

1.2.5 干旱和鹽處理 采用生長(zhǎng)箱培養(yǎng)擬南芥，待長(zhǎng)到一定大小時(shí)定植到穴盤(pán)（規(guī)格為6 cm × 6 cm × 5.5 cm）。穴盤(pán)的每行種植不同的基因型（共4個(gè)），每個(gè)基因型取正常生長(zhǎng)的擬南芥定植于穴盤(pán)中，每穴5株，保證相同的生長(zhǎng)條件，待植株長(zhǎng)至一定大小時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行處理，每個(gè)處理20株，3次重復(fù)。

干旱處理：對(duì)18 d苗齡的擬南芥進(jìn)行處理，連續(xù)10 d不澆水，對(duì)照正常澆水，拍照留存并測(cè)定丙二醛含量。

鹽處理：對(duì)8 d苗齡的擬南芥進(jìn)行處理，每2 d澆1次400 mmol/L的NaCl，用水作為對(duì)照，持續(xù)18 d，拍照留存并測(cè)定丙二醛含量。

1.2.6 丙二醛含量的測(cè)定 丙二醛含量可反映植物脂類(lèi)過(guò)氧化程度和遭受逆境傷害的程度，丙二醛含量的測(cè)定參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［19］。

1.2.7 抗氧化酶活性的測(cè)定 采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒測(cè)定SOD、POD、CAT活性，測(cè)定步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析，采用Graphpad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型擬南芥生理指標(biāo)的比較

為了比較不同基因型擬南芥的生理指標(biāo)，將轉(zhuǎn)基因型、野生型和突變體型擬南芥種子播種于培養(yǎng)基上，長(zhǎng)至一定大小移栽入穴盤(pán)，每個(gè)穴盤(pán)為1個(gè)重復(fù)，植株間混合取樣，至少設(shè)置3個(gè)重復(fù)。由圖2可知，在擬南芥定植后的生長(zhǎng)過(guò)程中OE-CsLOX6的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其他基因型植株，生長(zhǎng)旺盛，其他基因型長(zhǎng)勢(shì)無(wú)明顯差別。進(jìn)一步測(cè)定擬南芥的生理指標(biāo)（圖3、表2），OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長(zhǎng)均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；TB-Atlox5的地上部鮮重和地下部鮮重均顯著高于WT，但根長(zhǎng)顯著低于WT；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長(zhǎng)明顯低于其他基因型植株。葉片的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量在不同基因型植株間無(wú)顯著差異。

2.2 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的代謝組分析

2.2.1 轉(zhuǎn)基因植株代謝物變化 為了全面分析CsLOX6基因和CsHPL2基因?qū)M南芥葉片代謝水平的影響，選取WT、OE-CsLOX6、OE-CsHPL2，利用GC-MS對(duì)樣品進(jìn)行代謝組分析。采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法篩選組間差異代謝產(chǎn)物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為OPLS-DA模型第一主成分的VIP>1，P<0.05。OE-CsLOX6、OE-CsHPL2與WT的代謝物含量存在較大差異（圖4、表3、表4）。OE-CsLOX6和WT有64個(gè)差異代謝物，其中有6個(gè)上調(diào)，58個(gè)下調(diào)，6個(gè)上調(diào)的代謝物是辛酸、尿嘧啶、月桂酸、亞精胺、精胺、褐煤酸；58個(gè)下調(diào)的代謝物主要是氨基酸和碳水化合物，如L-丙氨酸、戊氨酸、甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸鹽、β-丙氨酸、高絲氨酸、甲硫氨酸、焦谷氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、2，6-二氨基庚二酸、谷氨酰胺、糖二酸、葡糖酮、果糖、D-塔格糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、乙基葡萄糖苷、麥芽三糖、葡糖酸、己糖二酸、蔗果三糖等。OE-CsHPL2和WT有63種差異代謝物，其中有9個(gè)上調(diào)，54個(gè)下調(diào)，9個(gè)上調(diào)的代謝物是辛酸、月桂酸、褐煤酸、尿嘧啶、胸腺嘧啶、喃葡萄糖、亞精胺、甘露糖基甘油酸、三糖；54個(gè)下調(diào)的代謝物主要是氨基酸和碳水化合物，如L-丙氨酸、戊氨酸、甘氨酸、乙酰絲氨酸、天冬氨酸鹽、丙氨酸、高絲氨酸、焦谷氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、谷氨酰胺/葡萄糖-6-磷酸、糖二酸、葡糖酮、乙酰氨基己糖、乳糖醛酸、果糖、D-塔格糖、葡糖酸、己糖二酸等。

圖5顯示差異代謝物在野生型和轉(zhuǎn)基因型植株中的大致變化。差異表達(dá)程度極顯著的代謝物數(shù)量較少，在有顯著差異的代謝物中，下調(diào)表達(dá)占大多數(shù)。為了更直觀(guān)地展示不同樣本之間的關(guān)系及代謝物在不同樣本之間的表達(dá)差異，對(duì)所有顯著差異的代謝物進(jìn)行層次聚類(lèi)（Hierarchical clustering），如圖6所示，在未受脅迫處理時(shí)，與野生型植株相比，OE-CsLOX6和OE-CsHPL2中多數(shù)代謝物含量有所降低。

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株代謝通路變化 通過(guò)對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，有助于理解在差異樣品中代謝途徑變化機(jī)制。利用差異代謝物的KEGG ID進(jìn)行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)背景相比在顯著性差異表達(dá)代謝物中顯著富集的pathway條目，其計(jì)算公式如下。

式中，P為該代謝通路的超幾何檢驗(yàn)；i為求和指標(biāo)；N為代謝物總數(shù)；n為N中差異表達(dá)代謝物的數(shù)量；M為某特定pathway的代謝物數(shù)量；m為注釋為某特定pathway的差異代謝物數(shù)量。以P≤0.05為闕值，滿(mǎn)足此條件的pathway為在差異代謝物中顯著富集的pathway。P越小，表示該代謝通路的差異性越顯著。

由圖7可知，CsLOX6基因過(guò)表達(dá)會(huì)使擬南芥體內(nèi)代謝物發(fā)生顯著變化，植株中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷胱甘肽代謝、氨基酸生物合成、β-丙氨酸代謝、甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝、氨?；?tRNA生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等途徑發(fā)生變化。而CsHPL2基因過(guò)表達(dá)會(huì)引起擬南芥植株中嘧啶代謝、谷胱甘肽代謝、精氨酸生物合成、嘌呤代謝、β-丙氨酸代謝、賴(lài)氨酸生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸生物合成、甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝、賴(lài)氨酸降解等途徑發(fā)生變化。由此可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)CsLOX6基因、CsHPL2基因的植株有相似的代謝通路，除影響一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外，主要與谷胱甘肽代謝和氨基酸的合成代謝等有關(guān)。

2.3 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)錄組分析

2.3.1 不同基因型植株差異基因表達(dá)分析 為了深入分析轉(zhuǎn)基因型和野生型擬南芥在轉(zhuǎn)錄水平的差異，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組比較野生型和轉(zhuǎn)基因型植株葉片中的轉(zhuǎn)錄變化，利用DESeq軟件，以Fold Change ≥ 2和P≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在野生型和轉(zhuǎn)基因型植株中篩選差異基因。結(jié)果（表5、圖8）表明，在OE-CsLOX6和WT中共發(fā)現(xiàn)280個(gè)差異基因，其中顯著上調(diào)的差異基因有112個(gè)，顯著下調(diào)的差異基因有168個(gè)。112個(gè)顯著上調(diào)的差異基因中，有22個(gè)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，其中乙烯相關(guān)11個(gè)、生長(zhǎng)素相關(guān)3個(gè)、脫落酸相關(guān)4個(gè)、茉莉酸相關(guān)4個(gè)，根據(jù)激素?cái)?shù)量，受影響最顯著的是乙烯，其次是脫落酸、茉莉酸、生長(zhǎng)素；有7個(gè)基因與脂類(lèi)代謝途徑相關(guān)；14個(gè)基因與細(xì)胞壁生長(zhǎng)相關(guān)；12個(gè)基因與非生物脅迫（干旱、鹽）相關(guān)。

在OE-CsHPL2和WT中共發(fā)現(xiàn)616個(gè)差異基因，其中顯著上調(diào)的差異基因有259個(gè)，顯著下調(diào)的差異基因有357個(gè)。OE-CsLOX6和WT組、OE-CsHPL2和WT組之間的共有及特有的差異基因如圖8所示，2組共有的差異基因有170個(gè)。259個(gè)顯著上調(diào)的差異基因中，有45個(gè)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，其中乙烯相關(guān)16個(gè)，生長(zhǎng)素相關(guān)8個(gè)，脫落酸相關(guān)12個(gè)，茉莉酸相關(guān)9個(gè)，根據(jù)激素?cái)?shù)量，受影響最顯著的是乙烯，其次是脫落酸、茉莉酸、生長(zhǎng)素；有7個(gè)基因與脂類(lèi)代謝途徑相關(guān)；30個(gè)基因與細(xì)胞壁生長(zhǎng)相關(guān)；16個(gè)基因與非生物脅迫（干旱、鹽）相關(guān)。

2.3.2 不同基因型植株差異基因GO富集分析 為了進(jìn)一步了解差異基因的功能，對(duì)得到的差異基因進(jìn)行GO富集分析，對(duì)功能進(jìn)行描述。在OE-CsLOX6和WT中發(fā)現(xiàn)280個(gè)差異基因，其功能主要與乙烯信號(hào)通路、茉莉酸響應(yīng)、機(jī)械損傷、花粉發(fā)育、滲透響應(yīng)、脂質(zhì)分解、Karrikins信號(hào)通路、脫落酸信號(hào)通路、氨基酸代謝、細(xì)胞壁等有關(guān)（圖9a）。在OE-CsHPL2和WT中有616個(gè)差異基因，其功能主要與機(jī)械損傷、茉莉酸響應(yīng)、乙烯信號(hào)通路、Karrikins信號(hào)通路、脅迫應(yīng)激反應(yīng)（溫度、滲透、鹽脅迫）、脫落酸信號(hào)通路、氧化還原酶、細(xì)胞壁等有關(guān)（圖9b）。

2.3.3 不同基因型對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)相關(guān)基因的響應(yīng) LOX和HPL都是脂類(lèi)氧化途徑的關(guān)鍵酶，在芳香物質(zhì)的合成消耗中扮演重要角色，乙烯、生長(zhǎng)素在植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由表6可知，2組的差異基因與脂肪酸代謝、激素代謝（激素合成、運(yùn)輸及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）、環(huán)境適應(yīng)有關(guān)，其中激素主要為乙烯，環(huán)境適應(yīng)主要為鹽和干旱。基因過(guò)表達(dá)會(huì)影響轉(zhuǎn)基因型植株體內(nèi)脂肪酸和激素的代謝過(guò)程，在正常生長(zhǎng)時(shí)，有些與環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的基因就已經(jīng)發(fā)生顯著變化，這些基因可能在脅迫過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.4 干旱和鹽脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)擬南芥的影響

為了驗(yàn)證不同基因型擬南芥對(duì)非生物脅迫的抵抗能力，本研究進(jìn)行了干旱和鹽脅迫處理，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)CsLOX6和CsHPL2是否能促進(jìn)擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性，如圖10所示。

擬南芥幼苗生長(zhǎng)的影響

2.4.1 過(guò)表達(dá)CsLOX6和CsHPL2對(duì)擬南芥細(xì)胞膜損傷的影響 植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度?？赏ㄟ^(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。由圖11、圖12可知，在正常生長(zhǎng)條件下，不同基因型植株的丙二醛含量表現(xiàn)出明顯差異，TB-Atlox5的丙二醛含量最高，WT次之，OE-CsLOX6和OE-CsHPL2的含量較低。在鹽脅迫下，擬南芥生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，TB-Atlox5的丙二醛含量明顯高于其他基因型植株，受到的膜損傷最大，WT次之，OE-CsLOX6和OE-CsHPL2受到的膜損傷較小。在干旱脅迫下，WT的葉片受損嚴(yán)重，葉片卷曲且長(zhǎng)勢(shì)較弱，OE-CsLOX6的長(zhǎng)勢(shì)要優(yōu)于其他基因型植株。

2.4.2 過(guò)表達(dá)CsLOX6和CsHPL2對(duì)擬南芥抗氧化酶活性的影響 SOD、POD、CAT在清除活性氧、緩解逆境脅迫方面發(fā)揮重要作用。不同基因型擬南芥抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果（圖13）顯示，在正常條件下，不同基因型擬南芥的SOD活性和POD活性均差異不顯著，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2的CAT活性差異不顯著，但均顯著高于野生型和突變體型。鹽脅迫下，所有株系的抗氧化酶活性與對(duì)照相比均明顯上升，OE-CsLOX6上升最明顯；OE-CsHPL2的SOD活性和CAT活性均顯著高于WT，OE-CsHPL2的POD活性與WT無(wú)顯著差異；TB-Atlox5的SOD活性和CAT活性顯著高于WT，TB-Atlox5的POD活性顯著低于WT。干旱脅迫下，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2和TB-Atlox5的酶活性均顯著高于WT；OE-CsLOX6的酶活性最高，OE-CsLOX6的SOD活性和POD活性顯著高于TB-Atlox5；OE-CsHPL2與TB-Atlox5的酶活性無(wú)顯著差異。

3 討論

對(duì)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因型植株、突變體型植株和野生型植株進(jìn)行代謝組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)比較分析，過(guò)表達(dá)CsLOX6基因、CsHPL2基因的植株有相似的代謝通路，與植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂肪酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、抵御逆境有著密切關(guān)系。有機(jī)酸和氨基酸的積累對(duì)植物有重要影響，可以提高植物對(duì)干旱脅迫的耐受性［20］。氨基酸通過(guò)一些代謝途徑比如脫氨基、脫羧基可以轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛲任镔|(zhì)，如丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸是丙酮酸的中間產(chǎn)物，組氨酸、精氨酸、脯氨酸等是α-酮戊二酸的中間產(chǎn)物，苯丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸是延胡索酸的中間產(chǎn)物。氨基酸是三羧酸循環(huán)中多種物質(zhì)的前體，轉(zhuǎn)基因型擬南芥與野生型相比，多數(shù)代謝物含量有所降低。β氧化是脂肪酸在一系列酶的作用下，生成含有兩個(gè)碳原子的乙酰輔酶A，是脂肪酸分解的主要方式，在此過(guò)程中游離出的乙酰CoA會(huì)經(jīng)三羧酸循環(huán)而氧化［21］。Karrikins與植物激素獨(dú)腳金內(nèi)酯在結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳導(dǎo)通路等方面具有非常高的相似性，除促進(jìn)種子萌發(fā)外，還具有調(diào)控植物光形態(tài)建成、葉片發(fā)生過(guò)程等生物學(xué)功能［22］。很多基因響應(yīng)了Karrikins信號(hào)通路，可能與轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛有關(guān)。過(guò)表達(dá)脂氧合酶基因和脂氫過(guò)氧化物酶基因與體內(nèi)各代謝途徑的關(guān)系還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

轉(zhuǎn)基因植株在耐鹽和耐旱方面表現(xiàn)出較好的耐受力，OE-CsLOX6的表現(xiàn)更好，而TB-Atlox5和WT表現(xiàn)較差。過(guò)表達(dá)13-脂氧合酶基因TomloxD的番茄植株中脂氧合酶活性和內(nèi)源激素茉莉酸含量增加，提高了對(duì)病原菌和高溫的耐受性［23］。陳璐等［24］對(duì)野生型、 AtLOX1的突變體型擬南芥施用0.3 mol/L的甘露醇模擬干旱，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能顯著提高擬南芥AtLOX1基因的表達(dá)并促進(jìn)種子的萌發(fā)。在擬南芥中過(guò)表達(dá)辣椒CaLOX1去探究CaLOX1在滲透、干旱和高鹽度條件下的功能，干旱和高鹽度處理辣椒葉片后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，H2O2積累更少，ABA相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)水平升高，同時(shí)，種子萌發(fā)和幼苗的發(fā)育對(duì)逆境的耐受性也更強(qiáng)，表明CaLOX1通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)氧化活性、過(guò)氧化氫含量、脫落酸含量等代謝途徑來(lái)緩解脅迫對(duì)植株的傷害［25］，轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛含量低，受到的脅迫損傷小，體內(nèi)酶促清除系統(tǒng)被激活，表明過(guò)表達(dá)CsLOX6基因和CsHPL2基因能在一定程度上降低膜損傷，提高植株在逆境脅迫下的耐受力，而TB-Atlox5在干旱脅迫下表現(xiàn)出比野生型植株更強(qiáng)的耐受性，與OE-CsHPL2的表現(xiàn)相似，由于擬南芥含有多個(gè)脂氧合酶基因，因此推測(cè)Atlox5缺失后引起其他同源基因表達(dá)量的變化，發(fā)揮了Atlox5原有的功能。目前對(duì)于脂氧合酶基因的研究大多側(cè)重在產(chǎn)生茉莉酸的LOX-AOS通路上，而脂氫過(guò)氧化物裂解酶基因的研究集中在增加植物的揮發(fā)性氣體方面，如花卉類(lèi)［26］、生菜［27］、瓜類(lèi)［16］等對(duì)氣味、品質(zhì)要求較高的植物。

在擬南芥定植后的生長(zhǎng)過(guò)程中OE-CsLOX6的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其他基因型植株，生長(zhǎng)旺盛，其他基因型長(zhǎng)勢(shì)無(wú)明顯差別。進(jìn)一步測(cè)定擬南芥的生理指標(biāo)，OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長(zhǎng)均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；TB-Atlox5的地上部鮮重和地下部鮮重均顯著高于WT，但根長(zhǎng)顯著低于WT；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長(zhǎng)明顯低于其他基因型植株。葉片的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量在不同基因型植株間無(wú)顯著差異。

4 小結(jié)

在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)CsLOX6基因和CsHPL2基因?qū)χ仓晟L(zhǎng)以及對(duì)干旱和鹽脅迫抗性具有明顯影響。OE-CsLOX6的地上部鮮重和根長(zhǎng)均顯著高于其他基因型植株，地下部鮮重明顯高于其他基因型植株；OE-CsHPL2的地上部鮮重、地下部鮮重和根長(zhǎng)明顯低于其他基因型植株。OE-CsLOX6、OE-CsHPL2與WT的代謝物含量存在較大差異，OE-CsLOX6和WT有64個(gè)差異代謝物，其中有6個(gè)上調(diào)，58個(gè)下調(diào)；OE-CsHPL2和WT有63個(gè)差異代謝物，其中有9個(gè)上調(diào)，54個(gè)下調(diào)。過(guò)表達(dá)CsLOX6基因和CsHPL2基因可以提高擬南芥對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的抗性。在鹽脅迫和干旱脅迫下，OE-CsLOX6、OE-CsHPL2的丙二醛含量要顯著低于野生型植株，膜質(zhì)過(guò)氧化程度低，SOD、POD和CAT活性要明顯高于野生型，提高了植株的抗氧化能力，葉片長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型植株。

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收稿日期：2023-11-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-23-B07）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672203）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃支持項(xiàng)目（2023YFD2300703）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（BAIC-2024）

作者簡(jiǎn)介：王 聰（1995-），女，河北石家莊人，碩士，主要從事蔬菜栽培與生理研究，（電話(huà)）18803219590（電子信箱）wangcong333333@163.com；通信作者，蔣衛(wèi)杰（1965-），男，北京人，研究員，主要從事蔬菜栽培生理和無(wú)土栽培研究，（電子信箱）jiangweijie@caas.cn。