十堰市白菜黑斑病病原真菌的分離與鑒定

摘要：對湖北省十堰市當(dāng)?shù)匕撞耍˙rassica pekinensis）品種的黑斑病進行病原真菌鑒定和病害分析，并提出相應(yīng)的預(yù)防措施。采用組織分離法從病葉中分離得到病原真菌，并利用rDNA ITS和Alt-α1基因序列比對進行分析鑒定。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)1個新的鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌，推測其是導(dǎo)致十堰市當(dāng)?shù)匕撞撕诎卟〉闹虏≌婢?。此外，確認(rèn)ITS序列和Alt-α1基因序列的聯(lián)合分析，能夠區(qū)分3種常見的鏈格孢屬真菌Alternaria brassicicola、Alternaria japonica、Alternaria brassicae。

關(guān)鍵詞：白菜（Brassica pekinensis）； rDNA ITS； 黑斑?。?病原真菌； 分離與鑒定； 湖北省十堰市

中圖分類號：S436.341 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）10-0059-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.010 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： The pathogenic fungi of the black spot of Brassica pekinensis in Shiyan City， Hubei Province were identified and analyzed， and the corresponding preventive measures were proposed. The pathogenic fungi were isolated from diseased leaves by tissue separation and identified by rDNA ITS and Alt-α1 gene sequence alignment. The results showed that a new Alternaria sp. fungus was found， which was presumed to be the pathogenic fungus causing the local cabbage black spot disease in Shiyan City. In addition， it was confirmed that the joint analysis of ITS sequence and Alt-α1 gene sequence could distinguish three common Alternaria fungi： Alternaria Brassicola， Alternaria japonica and Alternaria brassicae.

Key words： Chinese cabbage（Brassica pekinensis）； 1aN1DYI66gaxTNrQX3725LDXbxAewuRaXN6cui97QIc=rDNA ITS； black leaf spot disease； pathogenic fungi； separation and identification； Shiyan City， Hubei Province

白菜（Brassica pekinensis）屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種的白菜亞種，原產(chǎn)中國北方，俗稱大白菜，營養(yǎng)豐富，是中國餐桌常見的傳統(tǒng)蔬菜［1］。在白菜生產(chǎn)過程中，葉片時常發(fā)生黑斑病（Black spot disease），多侵染外葉或外層葉球，嚴(yán)重時造成白菜死苗、腐爛，導(dǎo)致白菜產(chǎn)量和品質(zhì)下降、不耐存，該病害在各地均有發(fā)生［2，3］。這源于白菜連年種植、管理不當(dāng)、引種等原因造成［4］。同時，白菜黑斑病在常溫下傳播速度快、距離遠(yuǎn)［2］，傳播距離達(dá)3 km［5］，促使白菜黑斑病成為了中國蔬菜生產(chǎn)的主要病害之一。有研究報道指出，引發(fā)白菜類黑斑病的病原真菌主要包括蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae）、甘藍(lán)鏈格孢（Alternaria brassicicola）、蘿卜鏈格孢（Alternaria japonica）3種［3，6，7］，其他鏈格孢菌致病的報道相對較少。

鑒定鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌的方法主要包括：①傳統(tǒng)分類，依據(jù)分生孢子和喙的形態(tài)差異進行鑒別；②核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列比對分析［8］；③可溶性蛋白凝膠電泳分析［9］；④RAPD（隨機擴增多態(tài)性DNA）指紋分析［10］和RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）分析［11］。本研究對十堰市大白菜黑斑病的病菌進行了分離和鑒定，以期為大白菜黑斑病的綜合防治提供理論依據(jù)和技術(shù)改良途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

采用白菜葉片樣品，于2022年12月采集自湖北省十堰市柳陂鎮(zhèn)蔬菜基地。

1.2 方法

1.2.1 癥狀的觀察和取樣 觀察并描述感病葉片組織表面的病斑形態(tài)、顏色、大小及危害程度等，并對感病葉片組織拍照記錄。

1.2.2 真菌的分離和培養(yǎng) 利用組織分離法分離白菜感病葉片的病原真菌。切取感病邊界處的葉片組織2～5 mm的小塊，置于75%乙醇中潤洗1次，然后將感病組織轉(zhuǎn)移至50%的84消毒液溶液中浸泡5～10 min，期間充分顛倒搖勻，用無菌水漂洗3～5次；在無菌條件下，將組織移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基，Cat#P8931，Solarbio）上培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d后，對菌落進行觀察、描述和拍照。

1.2.3 白菜病原真菌的DNA提取與PCR擴增 利用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒［B518229，生工生物工程（上海）股份有限公司］抽提分離菌絲的基因組DNA。用于擴增真菌rDNA IST2區(qū)段的PCR引物ITS2-F2（5′-GCGATACTTGGTGTGAAT-3′）和ITS2-R2（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）；用于擴增真菌rDNA IST1-2區(qū)段（包含ITS1和ITS2區(qū)段）的PCR引物ITS-u1（5′-GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS-u4（5′-RGTTTCTTTTCCTC CGCTTA-3′）。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；52 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸420 s；降溫到25 ℃后反應(yīng)結(jié)束。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目的大小區(qū)段的DNA片段利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收［B518131，生工生物工程（上海）股份有限公司］。由奧科鼎盛生物科技有限公司（武漢）測序。測序序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行BLAST同源序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜黑斑病發(fā)病癥狀的觀察和描述

根據(jù)白菜黑斑病癥狀，十堰市白菜發(fā)病葉片的病斑呈黃褐色，呈不規(guī)則圓形。如圖1所示，在病情嚴(yán)重時，有多個病斑相互融合，可形成較大的病斑，導(dǎo)致葉片上發(fā)病組織萎蔫干枯，并在發(fā)病處腐爛，甚至脫落。

2.2 白菜黑斑病病原真菌的分離培養(yǎng)

將帶有病斑的葉片組織切碎，利用50%的84消毒液進行表面消毒后，將碎片組織用鑷子擺放在鋪有PDA培養(yǎng)基（Cat#P8931，Solarbio）的平皿上，密封后置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d，得到如圖2所示的菌落。病原微生物純培養(yǎng)菌落大多呈白色，少數(shù)呈灰色，均為不規(guī)則圓形。

2.3 白菜黑斑病病原真菌的rDNA ITS和Alt-α1基因片段擴增

用鑷子分別夾取2簇白色菌絲和1簇灰色菌絲，命名為白色菌落1（White #1）、白色菌落2（White #2）、灰色菌落1（Gray #1）。利用真菌基因組DNA抽提試劑盒［B518229，生工生物工程（上海）股份有限公司］抽提菌絲中的基因組DNA，進一步將DNA進行ITS2和ITS區(qū)段擴增，引物位點和ITS區(qū)段模式如圖3A所示。并對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測（圖3B），觀察到ITS2和ITS區(qū)段引物均能擴增出特異條帶，利用膠回收試劑盒對750 bp附近特異ITS條帶回收，并測序。

同時還擴增了白色菌落1（White #1）、白色菌落2（White #2）和灰色菌落1（Gray #1）DNA樣品中的Alt-α1基因片段，并繪制了擴增引物位點和Alt-α1基因片段模式（圖4A），PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖4B所示，進一步通過膠回收試劑盒回收750 bp附近特異條帶后測序。

2.4 病原真菌的序列比對分析

通過比對病原真菌rDNA ITS序列的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來自白色菌落1、白色菌落2和灰色菌落1編號樣品的ITS2序列結(jié)果一致，另外ITS的測序序列結(jié)果也一致，說明白色菌落1、白色菌落2和灰色菌落1這3株真菌在ITS序列上沒有區(qū)別，推測這3株真菌可能是同一種。同時，針對獲得的ITS2序列和ITS序列結(jié)果比對分析，發(fā)現(xiàn)ITS序列完全包含ITS2序列的序列信息，從而用ITS序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對分析。由表1可知，病原真菌屬于鏈格孢屬（Alternaria sp.），但不能對Alternaria alternata、Alternaria alstroemeriae、Alternaria gaisen或Alternaria longipes進一步區(qū)分，而Alternaria tenuissima和Alternaria angustiovoidea是Alternaria alternata的異名，屬于同一種鏈格孢真菌［12］。將獲得的Alt-α1基因進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)不能區(qū)分Alternaria alternata和Alternaria arborescens；結(jié)合ITS和Alt-α1基因片段的比對結(jié)果，推測從十堰市白菜中分離得到的病原真菌是Alternaria alternata（鏈格孢）。

為了驗證白菜類黑斑病的病原菌是否主要是蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae）、甘藍(lán)鏈格孢（Alternaria brassicicola）、蘿卜鏈格孢（Alternaria japonica）3種常見的致病真菌，將病原真菌的ITS序列與這3種主要致病鏈格孢的ITS序列進行比對，發(fā)現(xiàn)相似率依次為Alternaria brassicicola（99.6%）、Alternaria japonica（97.0%）、Alternaria brassicae（95.5%）（表2）。此外，Alt-α1基因片段的比對相似度依次為Alternaria brassicicola（88.2%）、Alternaria japonica（86.9%）、Alternaria brassicae（85.0%）。結(jié)果表明十堰市白菜黑斑病分離得到的鏈格孢屬真菌并不是常見的白菜致病真菌。

2.5 鏈格孢屬真菌的進化樹分析

將BLAST比對得到的近源鏈格孢屬真菌與引起白菜黑斑病的3種常見鏈格孢真菌（Alternaria brassicicola、Alternaria japonica、Alternaria brassicae進行建樹分析，基于ITS序列的進化關(guān)系如圖5中無根樹所示，Alternaria alternata與其他2種常見致病菌（Alternaria japonica和Alternaria brassicae）以及Alternaria arborescens的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此ITS序列可以作為區(qū)分它們的參考序列。由于Alternaria alternata與Alternaria tenuissima和Alternaria angustiovoidea屬于同種異名關(guān)系，且與Alternaria gaisen、Alternaria longipes和Alternaria alstroemeriae的親緣關(guān)系較近，因此ITS序列不能有效區(qū)分這些物種。

綜上所述，聯(lián)合ITS序列和Alt-α1基因能有效區(qū)分Alternaria alternata與其他2種常見致病菌Alternaria japonica、Alternaria brassicae，以及Alternaria arborescens和Alternaria longipes真菌。

3 討論

鏈格孢屬真菌是引起十字花科蔬菜黑斑病的重要病原菌。本研究通過對白菜感病葉片進行試驗并分離出病原真菌，基于rDNA ITS序列的比對分析，鑒定十堰市白菜黑斑病的病原真菌為鏈格孢屬真菌，但如需進一步精確區(qū)分到具體真菌物種，需要將比對分析拓展到其他序列，包括Alt-α1過敏原基因（Alt-α1）［13］、延伸因子基因（TEF）［14］、RNA聚合酶II第2大亞基基因（RPB2）［15］、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）［16］、基因組匿名區(qū)域（OPA）［17］。在本研究中，基于ITS片段和Alt-α1基因序列聯(lián)合BLAST比對分析，鑒定十堰市白菜黑斑病病原菌為Alternaria alternata（鏈格孢）。但十堰市白菜黑斑病病原菌（Alternaria alternata）有別于常見白菜黑斑病病原真菌（Alternaria brassicae、Alternaria japonica），這可能暗示著十堰市白菜黑斑病及其防治工作存在地區(qū)特異性，需要進一步研究。

此外，白菜黑斑病一般通過選用抗性品種、浸種、輪作、合理施肥、生物藥劑進行防治［6，18-21］，王云帆等［20］通過0.4 g/mL濃度的大蒜提取液能夠抑制白菜黑斑病的病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，從而達(dá)到預(yù)防的效果。杜淑濤等［21］通過拮抗細(xì)菌中芽孢細(xì)菌DL-59對白菜黑斑病具有顯著的防治作用，且該菌株為Bacillus velezensis，說明白菜黑斑病可采用農(nóng)業(yè)和生物藥劑等進行防治。為保障十堰市蔬菜市場中白菜健康且穩(wěn)定供應(yīng)，必須對鏈格孢屬真菌對白菜造成的病害進行分離和鑒定，為后續(xù)的病原真菌抗性研究和田間試驗提供參考依據(jù)，為十堰市白菜黑斑病綜合防治工作提供理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-05-22

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32200680）；湖北省教育廳項目（JYT2021009）

作者簡介：石憲銘（1996-），男，江蘇宿遷人，在讀碩士研究生，研究方向為病理學(xué)與病理生理學(xué)，（電子信箱）18360167144@163.com；并列第一作者，何亞慧（1981-），女（蒙古族），內(nèi)蒙古寧城人，農(nóng)藝師，博士，主要從事農(nóng)作物栽培技術(shù)研究，（電子信箱）179117170@qq.com；通信作者，溫毅華（1966-），男，湖北天門人，高級農(nóng)藝師，主要從事蔬菜栽培與遺傳育種研究，（電話）0719-8117598（電子信箱）447656967@qq.com；游 磊（1989-），男，湖北潛江人，副教授，主要從事藥用植物學(xué)與表觀遺傳藥理學(xué)研究，（電子信箱）youlei@hbmu.edu.cn。