阿耶波多氏芽孢桿菌對鹽脅迫下綠豆的促生效果

摘要：測定了從紅樹林分離出來的耐鹽內(nèi)生細(xì)菌阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）對植物的促生特性，研究了鹽脅迫下其定殖前后對綠豆［Vigna radiata （Linn.） Wilczek］生長的影響。結(jié)果表明，阿耶波多氏芽孢桿菌對NaCl的最高耐受濃度為110 g/L，最高耐受pH為10.0，產(chǎn)IAA能力為（154.474±1.526）μg/mL、ACC脫氨酶活性為（0.125 6±0.051 2） U/mg、溶有機(jī)磷和無機(jī)磷能力分別為1.89±0.03和2.27±0.01；基因組DNA里擴(kuò)增出appA和phoD兩個(gè)基因，這是該菌具溶磷能力的分子機(jī)理。阿耶波多氏芽孢桿菌在綠豆根、莖、葉3個(gè)部位的定殖率分別為68.27 %、63.48%、50.00%，定殖組的綠豆幼苗葉綠素含量和SOD活性高于對照組，說明阿耶波多氏芽孢桿菌的定殖有助于綠豆幼苗抗氧化能力的提高，從而提高綠豆的耐鹽性。

關(guān)鍵詞：阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）；植物促生菌；綠豆［Vigna radiata （Linn.） Wilczek］；耐鹽性

中圖分類號(hào)：S551+.9；S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）10-0008-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.002 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： The characteristics of promoting plant growth of salt-tolerant endophytic bacterium Bacillus aryabhattai isolated from mangrove were determined， and the effects of its colonization into mung bean ［Vigna radiata （Linn.） Wilczek］ under salt stress were studied. The results showed that the highest NaCl tolerant concentration of B. aryabhattai was 110 g/L， the highest pH tolerant value was 10.0， the IAA production capacity was （154.474±1.526） μg/mL， the ACC deaminase activity was （0.125 6±0.051 2） U/mg， and the capacities of dissolving organic phosphorus and inorganic phosphorus were 1.89±0.03 and 2.27±0.01， respectively. Two genes， appA and phoD， were amplified in the genomic DNA， which was the molecular mechanism of the phosphorus-solubilizing ability of the bacteria. The colonization rates of B. aryabhattai in roots， stems and leaves were 68.27%， 63.48% and 50.00%， respectively. The chlorophyll content and superoxide dismutase （SOD） activity of mung bean seedlings in the colonization group were higher than those in the control group， indicating that the colonization of B. aryabhattai contributed to the improvement of the antioxidant capacity of mung bean seedlings， thus effectively increasing the salt tolerance of mung bean.

Key words： Bacillus aryabhattai； plant growth-promoting bacteria； mung bean ［Vigna radiata （Linn.） Wilczek］； salt tolerance

鹽脅迫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對植物有害的脅迫。當(dāng)植物暴露在極端鹽水條件下時(shí)，其新陳代謝會(huì)受損，對植物生長和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)均產(chǎn)生不利影響［1］。全球大約有50%的耕地受到鹽脅迫的影響［2］。鹽脅迫以多種方式影響植物，如水分脅迫、離子毒性、營養(yǎng)破壞、膜破壞、代謝循環(huán)改變、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分裂和遺傳毒性［3］。在不改變土壤特性的情況下，微生物（生物增強(qiáng)）是一種環(huán)境可持續(xù)的土壤去污解決方案。許多微生物可以吸收和沉淀土壤中的NaCl，對水體凈化有一定作用，但在實(shí)際應(yīng)用中存在缺少高抗鹽性的微生物菌種和含鹽土壤營養(yǎng)物質(zhì)缺乏不利于微生物生長這兩個(gè)關(guān)鍵問題，雖然營養(yǎng)物質(zhì)的短缺可以通過添加營養(yǎng)物質(zhì)和改善生長環(huán)境來解決，但選育高耐鹽性微生物才是真正解決提高鹽堿地利用的關(guān)鍵所在［4］。

內(nèi)生細(xì)菌是一種獨(dú)特的微生物，可以潛伏或主動(dòng)定殖在植物內(nèi)部組織中，而不會(huì)對宿主造成實(shí)質(zhì)性傷害。某些內(nèi)生細(xì)菌可以在正常或不利條件下促進(jìn)植物生長和健康，被認(rèn)為是植物促生菌（Plant growth-promoting bacteria，PGPB），這些有益微生物在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中的應(yīng)用是不可或缺的組成部分，可以通過處理作物種子或噴灑在植物葉面來提高作物在各種非生物脅迫下的生產(chǎn)力［5］，也可以通過幾種協(xié)同機(jī)制提高植物耐鹽力［6］。第一種是通過引起滲透物質(zhì)積累和植物生長調(diào)節(jié)劑信號(hào)，如吲哚-3-乙酸（IAA）和赤霉素（GA3），或通過提高1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶的活性和形成生物膜等緩解滲透脅迫［7-10］。第二種是通過實(shí)現(xiàn)離子穩(wěn)態(tài)和改善養(yǎng)分的吸收減少離子脅迫和營養(yǎng)缺乏［11］，如磷增溶、鐵固定。第三種是通過增加光合作用的潛力減少氧化應(yīng)激［12］。植物促生菌可以通過維持兼容活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平的細(xì)胞功能改善植物在非生物脅迫情況下的性能。正因?yàn)橹参锷L促進(jìn)菌對寄主植物生長和健康的有益作用，所以多種內(nèi)生細(xì)菌作為生物接種劑應(yīng)用于促進(jìn)植物在鹽堿、重金屬污染地的生長發(fā)育。

本研究從紅樹林的秋茄（Kandelia obovata）和木欖（Bruguiera gymnorhiza）中共同分離出了耐鹽內(nèi)生細(xì)菌阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai），并對其促進(jìn)植物生長性能進(jìn)行體外試驗(yàn)，評價(jià)其對綠豆［Vigna radiata （Linn.） Wilczek］在鹽脅迫下生長的影響，以期開發(fā)一些有價(jià)值的內(nèi)生細(xì)菌作為生物接種劑提高農(nóng)作物的生物量產(chǎn)量，還可為提高鹽堿地的利用率提供潛在的機(jī)會(huì)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為從紅樹林的秋茄和木欖中分離出的內(nèi)生細(xì)菌阿耶波多氏芽孢桿菌。供試植物為從超市購買的普通綠豆。

1.2 方法

1.2.1 阿耶波多氏芽孢桿菌的耐鹽堿能力分析 挑取活化的阿耶波多氏芽孢桿菌的單菌落，在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，菌液按1%（OD500 nm約為1.2）的濃度分別轉(zhuǎn)接到不同鹽堿濃度的液體LB培養(yǎng)基，設(shè)置NaCl濃度為0、10、30、50、70、90、110、120、130 g/L；堿的處理為pH從7.0開始，處理以0.5等差值遞增，直至pH為10.5。所有處理的培養(yǎng)條件都為30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，3次重復(fù)。

1.2.2 阿耶波多氏芽孢桿菌促生生理分析 采用比色法［13］測定IAA活性，分析菌株阿耶波多氏芽孢桿菌產(chǎn)IAA的能力；參考王玉琴等［14］的方法測定阿耶波多氏芽孢桿菌溶有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力，計(jì)算式為SI=D/d，其中，SI為溶磷能力，D為溶磷圈直徑，d為菌落直徑；采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（Microorganism ACCD ELISA KIT YJ009852，上海源桔生物科技中心）方法測定阿耶波多氏芽孢桿菌ACC脫氨酶活性；采用CAS檢測平板法［15］分析阿耶波多氏芽孢桿菌分泌鐵載體的能力。

1.2.3 阿耶波多氏芽孢桿菌溶磷能力相關(guān)基因擴(kuò)增 以阿耶波多氏芽孢桿菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增與溶磷能力有關(guān)的基因appA和phoD［16，17］。引物序列見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送往北京擎科生物科技股份有限公司福州分公司進(jìn)行測序。

1.2.4 鹽脅迫下阿耶波多氏芽孢桿菌定殖前后綠豆促生生理分析 綠豆分為試驗(yàn)組和對照組2組，試驗(yàn)組用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h的阿耶波多氏芽孢桿菌菌液浸泡，對照組用無菌去離子水浸泡，均浸泡24 h，浸泡好后的綠豆種植于無菌沙土花盆中，每盆保證10株生長一致的綠豆幼苗。等綠豆發(fā)芽后，地上部分長到5 cm長度后，配制0、3、5、7、9、11 g/L的NaCl溶液，每天澆入花盆中50 mL，連續(xù)10 d，10 d后正常澆水處理。所有處理3次重復(fù)。

采用95 %乙醇法［18］測定綠豆幼苗葉綠素含量；采用硫代巴比妥酸法19］測定綠豆幼苗丙二醛含量；采用NBT光還原法［20］測定綠豆幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.2.5 阿耶波多氏芽孢桿菌定殖綠豆規(guī)律分析 參考陳惠靜等［19］的方法，分別分離試驗(yàn)組和對照組的綠豆幼苗內(nèi)生細(xì)菌，提取內(nèi)生細(xì)菌的基因組DNA，擴(kuò)增16S rDNA序列，選用Hinf Ⅰ、Hae Ⅲ、Pst Ⅰ和Taq Ⅰ這4種限制性內(nèi)切酶消化16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并比對阿耶波多氏芽孢桿菌16S rDNA序列，統(tǒng)計(jì)綠豆幼苗不同組織菌株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿耶波多氏芽孢桿菌最高耐鹽堿度分析

由圖1可知，經(jīng)過48 h的培養(yǎng)，在NaCl濃度高于120 g/L和pH高于10.5的LB液體培養(yǎng)基中未見混濁，推斷阿耶波多氏芽孢桿菌對NaCl的最高耐受濃度為110 g/L，對pH的最高耐受值為10.0。

2.2 阿耶波多氏芽孢桿菌促生特性分析

阿耶波多氏芽孢桿菌產(chǎn)IAA定性分析如圖2a所示，白瓷板上液體呈現(xiàn)粉色，表明菌株具有分泌IAA能力。對產(chǎn)IAA能力的定量分析表明，IAA產(chǎn)量為（154.474±1.526）μg/mL，說明該菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA能力。阿耶波多氏芽孢桿菌溶有機(jī)磷和溶無機(jī)磷現(xiàn)象見圖2b和圖2c，觀察到培養(yǎng)基上菌株周圍均出現(xiàn)明顯的透明圈，表明菌株具有溶有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力，通過測量與計(jì)算得出，溶無機(jī)磷能力為2.27±0.01，溶有機(jī)磷能力為1.89±0.03。雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定結(jié)果顯示阿耶波多氏芽孢桿菌ACC脫氨酶活性為（0.125 6±0.051 2）U/mg。阿耶波多氏芽孢桿菌在培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基發(fā)生明顯變色（圖2d、圖2e和圖2f），說明該菌具有產(chǎn)鐵載體的能力，通過定量分析可知，該菌產(chǎn)鐵載體單位為81.430%±0.814%。綜上所述可知，該菌具有所測試的所有植物促生特性，從而最大限度地發(fā)揮內(nèi)生細(xì)菌對植物生長的促進(jìn)作用。

2.3 阿耶波多氏芽孢桿菌溶磷能力相關(guān)基因擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)［17，18］設(shè)計(jì)了堿性磷酸酶和植酸酶基因的PCR引物，提取阿耶波多氏芽孢桿菌基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。其中，appA基因的擴(kuò)增長度為841 bp，phoD基因的擴(kuò)增長度為339 bp，推斷阿耶波多氏芽孢桿菌具有溶磷能力的原因可能與這兩個(gè)基因相關(guān)。

2.4 鹽脅迫下阿耶波多氏芽孢桿菌定殖前后綠豆促生生理分析

通過檢測阿耶波多氏芽孢桿菌定殖前后綠豆幼苗葉片的葉綠素含量、丙二醛含量和SOD活性3個(gè)生長生理指標(biāo)（圖4）可知，對照組和試驗(yàn)組葉綠素含量均隨NaCl濃度的增加先上升后降低，且均在NaCl濃度為5 g/L時(shí)葉綠素含量最高，試驗(yàn)組的葉綠素含量均高于對照組；菌定殖前后綠豆幼苗葉片丙二醛含量整體呈隨NaCl濃度升高而降低的趨勢，除5 g/L和11 g/L的NaCl兩個(gè)處理的丙二醛含量定殖組與對照組差異顯著外，其他處理組二者間差異均不顯著；SOD活性隨NaCl濃度升高而升高，但除5 g/L和7 g/L的NaCl兩個(gè)處理組菌定殖前后差異顯著外，其他處理組二者間差異均不顯著。

2.5 阿耶波多氏芽孢桿菌定殖綠豆規(guī)律分析

分離綠豆幼苗的不同組織內(nèi)生細(xì)菌，通過酶切分型圖譜（圖5）分析其在綠豆中的定殖率。結(jié)果（表2）表明，定殖組的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量明顯高于對照組，阿耶波多氏芽孢桿菌在綠豆根、莖、葉3個(gè)部位的定殖率分別達(dá)68.27%、63.48%和50.00%，且定殖率表現(xiàn)為根>莖>葉，推測內(nèi)生細(xì)菌對綠豆植株提高耐鹽能力起到至關(guān)重要的作用。當(dāng)定殖率大于50%時(shí)，說明該內(nèi)生菌為優(yōu)勢菌種。

3 討論

研究證實(shí)，植物促生菌能夠在寄主植物內(nèi)部組織定殖，并與寄主植物進(jìn)一步建立有益的共生關(guān)系，從而提高寄主植物的生長和抗逆性［21-23］。這一功能確實(shí)有助于以更可持續(xù)的方式提高鹽堿地農(nóng)作物的生物量和產(chǎn)量，提高鹽堿地利用率［24］。細(xì)菌感染并在寄主植物組織中的定殖促進(jìn)了寄主植物的生長［25］。內(nèi)生細(xì)菌的定殖能力可使內(nèi)生細(xì)菌在各種生物和非生物脅迫下獲得更有利的環(huán)境，與根際細(xì)菌相比，內(nèi)生細(xì)菌具有天然土壤細(xì)菌的競爭優(yōu)勢［26］。因此，有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)生細(xì)菌能夠在寄主植物的內(nèi)部組織中定殖，是一種高效的促進(jìn)植物生長的接種劑［27］。內(nèi)生細(xì)菌對植物具有促生特性，包括IAA生產(chǎn)能力、鐵載體生產(chǎn)能力、固氮能力、氨生產(chǎn)能力、無機(jī)磷酸鹽增溶能力或ACC脫氨酶活性，從而促進(jìn)植物在正常或者逆境下的生長。本研究中的阿耶波多氏芽孢桿菌能夠產(chǎn)生IAA和鐵載體，溶解無機(jī)和有機(jī)磷酸鹽，促進(jìn)植物生長和耐鹽性，這與早期研究報(bào)道一致［28-30］；從阿耶波多氏芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增出appA和phoD基因，appA是微生物的酸性植酸酶編碼基因，phoD是微生物編碼堿性磷酸酶的關(guān)鍵基因，植酸酶和酸性植酸酶是土壤中有機(jī)磷礦化的重要酶類［31-33］。提高ACC脫氨酶活性是植物生長促進(jìn)菌的共同特征，ACC脫氨酶通過將ACC（乙烯的前體）降解為氨和α-酮丁酸鹽來降低乙烯水平，從而促進(jìn)植物生長，緩解不良環(huán)境對植物的脅迫［30，34，35］。

研究表明，每種內(nèi)生細(xì)菌都至少具有兩種或兩種以上促生特性，不同內(nèi)生細(xì)菌組合的接種劑可能具有不同的植物促生特性，這些特性可以相互補(bǔ)充，從而在寄主植物生命周期的不同時(shí)期利用各種機(jī)制增強(qiáng)其促進(jìn)植物生長的能力［28-30］。本研究中綠豆幼苗葉片丙二醛含量在菌定殖前后沒有出現(xiàn)隨NaCl濃度升高而相應(yīng)提高或降低的規(guī)律，推斷其原因是只有一種內(nèi)生細(xì)菌的侵染，在未來的研究中，應(yīng)更關(guān)注兩種或者兩種以上內(nèi)生細(xì)菌的共同侵染。

4 小結(jié)

本研究從紅樹林（秋茄和木欖）分離出內(nèi)生細(xì)菌的耐鹽阿耶波多氏芽孢桿菌，將其定殖在綠豆體內(nèi)，并對其促生特性、定殖規(guī)律和促生效果進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在促生特性方面，阿耶波多氏芽孢桿菌具有一系列的相關(guān)特性，包括IAA的產(chǎn)生、鐵載體的產(chǎn)生、磷酸鹽的溶解和ACC脫氨酶的活性，也證實(shí)了阿耶波多氏芽孢桿菌可以成功地在宿主體內(nèi)定殖。綜上所述，阿耶波多氏芽孢桿菌在綠豆的組織中具有生存潛力，可以作為內(nèi)生生物接種劑的合適菌種，以提高農(nóng)作物的抗逆性，促進(jìn)農(nóng)作物在貧瘠和鹽堿地上的生長和生物量產(chǎn)量。

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收稿日期：2024-05-20

基金項(xiàng)目：福建省自然基金面上項(xiàng)目（2020J01375）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（202311311002）；福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（S202311311071）

作者簡介：劉彩婷（2002-），女，福建福清人，在讀本科生，專業(yè)方向?yàn)樯锛夹g(shù)與生物育種，（電子信箱）1597324463@qq.com；通信作者，劉希華（1978-），男，福建閩清人，教授，主要從事抗逆境植物選育，（電子信箱）xihua7808@163.com。