正交試驗(yàn)優(yōu)化桂附顆粒殼聚糖除雜工藝

【摘要】目的：采用正交試驗(yàn)優(yōu)化桂附顆粒殼聚糖除雜工藝。方法：以肉桂酸保留率和雜質(zhì)去除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，絮凝除雜溫度、殼聚糖加入量、藥材-藥液比為影響因素，正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝。結(jié)果：最佳條件為絮凝溫度60℃，藥材-藥液比1∶[KG-*3/5]7，殼聚糖加入比例1.4g/L，肉桂酸保留率為90.88%和雜質(zhì)去除率14.94%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單可行，能保證藥液中肉桂酸高保留率及雜質(zhì)較高去除率。

【關(guān)鍵詞】桂附顆粒；殼聚糖；除雜工藝；正交試驗(yàn)

【中圖分類號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2024）18-0040-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418009

Abstract：ObjectiveTodeveloporthogonalteststooptimizeguifugranuleflocculation.Methodsusingcinnamicacidretentionrateandimpurityremovalrateasevaluationindexes，chitosandosage，flocculatingtemperatureandratioofcrudedrugtoliquiddrugasinfluencingfactors，Tooptimizethetechnology，orthogonaltestswereconducted.Resultstheoptimumconditionswereasfollows：Chitosan1.4g/L，flocculationtemperature60°C，ratioofmedicinalmaterialstomedicinalsolution1∶[KG-*3/5]7，cinnamicacidretentionrate90.88%andextractremovalrate14.94%.Conclusionthemethodissimpleandfeasible，whichcanensurethehighretentionrateofcomponentsandimprovetheliquidmedicine.

Keywords：GuifuGranule;Chitosan;ImpurityRemovalProcess;OrthogonalTest

桂附顆粒由桂枝、生姜、白附片、白芍、炙甘草、大棗組成，源于《傷寒雜病論·辨太陽(yáng)病》：“太陽(yáng)病，發(fā)汗，遂漏不止，其人惡風(fēng)，小便難，四肢微急，難以屈伸者，桂枝加附子湯主之。”桂附顆粒是我院名老中醫(yī)的常用處方轉(zhuǎn)化而來，有臨床使用歷史，作為醫(yī)院協(xié)定處方，效果顯著。可調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、扶陽(yáng)固表、祛風(fēng)溫經(jīng)、助陽(yáng)化濕。主要用于治療因營(yíng)衛(wèi)不和、發(fā)汗過多而致汗證、陽(yáng)虛感冒、產(chǎn)后汗出、漏汗、遺精、陽(yáng)虛氣血運(yùn)行不暢寒濕痹痛等。臨床采用傳統(tǒng)湯劑方法煎煮，患者使用、攜帶不方便，儲(chǔ)存條件要求高。因此將該方劑開發(fā)為顆粒劑，具有“三效”“五便”“三小”優(yōu)點(diǎn)，既能如湯劑快速發(fā)揮作用，又易攜帶和使用［1-2］。但是此方中藥味出膏率高，日處方量浸膏約20g，如不除雜直接制備顆粒，將導(dǎo)致日服用劑量過大，故進(jìn)行除雜工藝試驗(yàn)以降低患者服用量。本課題組擬采用正交法優(yōu)化桂附顆粒殼聚糖除雜工藝，優(yōu)選出最佳純化工藝條件，為桂附顆粒研制奠定基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器萬分之一分析天平（上海安亭電子儀器廠）；Agilent1260Infinity高效液相色譜儀（配置四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測(cè)器）;十萬分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；GZX-3-BS-Ⅱ/H型烘箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2試藥肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)110786-201604）從中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院采購(gòu)。桂枝、生姜、白附片、白芍、大棗等5味藥材均購(gòu)自四川天植股份有限公司；殼聚糖（批號(hào)20210928，湖南新綠方藥業(yè)有限公司），炙甘草藥材從成都康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司采購(gòu)；藥材皆滿足《中國(guó)藥典》2020年版（一部）項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。試劑使用色譜甲醇、色譜乙腈、超純水，其他試劑則是AR級(jí)。

2方法與結(jié)果

2.1水提液制備將桂附顆粒處方，加10倍水浸泡40min后，煎煮提取兩次每次1.5h，收集兩次濾液，濃縮至藥材-藥液比為1∶5、1∶6、1∶7，即得。

2.2殼聚糖溶液制備取10mL冰醋酸加入純水中制成1L1%冰醋酸溶液；再稱取殼聚糖10g，加入1L1%冰醋酸溶液中，溶脹24h，即得0.01g/mL殼聚糖溶液［3］。

2.3殼聚糖純化工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以肉桂酸保留率、雜質(zhì)去除率為評(píng)估指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出藥液濃度、殼聚糖加入量、溫度為考察因素，各因數(shù)皆設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行試驗(yàn)［4］。取“2.1”項(xiàng)下各水平梯度濃度的溶液，置于不同水平的溫度中水浴加熱，并加入不同比例1%殼聚糖溶液，攪拌20min后，保溫1h，靜置過夜，管式離心收集上清液定容至規(guī)定刻度備用。因素水平見表1。

2.4肉桂酸保留率測(cè)定

2.4.1色譜條件采用HPLC測(cè)定，在30℃柱溫下，色譜柱：ZORBAXSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：285nm；乙腈∶0.1%磷酸=30∶70；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL［5］。

2.4.2對(duì)照品溶液制備取肉桂酸對(duì)照品，精密稱取13.52mg（濃度為98.8%）到50mL量瓶中，甲醇定容后，再取0.4mL母液至25mL量瓶中，加甲醇至刻度線，即得（4.27μg/mL）［6］。

2.4.3供試品溶液制備精密吸取“2.1”待測(cè)液5mL，置于磨口三角瓶中，精密加入10mL甲醇，精密稱重，超聲30min，放冷后精密稱重，以甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，用微孔濾頭濾過即得。同“2.4.1”法測(cè)定肉桂酸含有量，計(jì)算保留率，公式：肉桂酸保留率=（樣品中肉桂酸含有量/原藥液中肉桂酸含有量）×100%。

2.4.4缺桂枝陰性對(duì)照溶液制備取缺桂枝的桂附顆粒處方，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備，濃縮，再按照“2.4.3”項(xiàng)制備陰性對(duì)照。

2.4.5專屬性考察將上述對(duì)照品溶液、缺肉桂酸陰性溶液、沉淀處理前供試品溶液和沉淀處理后供試品溶液，以2.4.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣，結(jié)果如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性樣品色譜圖中在與肉桂酸對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處沒有色譜峰，說明其他成分對(duì)肉桂酸的測(cè)定無干擾，供試品色譜圖中肉桂酸色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于1.5，符合要求，表明以本法測(cè)定桂附顆粒中肉桂酸的含量具有專屬性。

2.4.6線性關(guān)系考察分別精密量取0.2672mg/mL的肉桂酸對(duì)照品貯備液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL至25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至不同濃度的對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣10μL，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得回歸方程為：Y＝75.867X+2.9059（R2=0.9999）。見表2，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，肉桂酸在0.0107～0.0855μg的數(shù)值內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，符合要求。

2.4.7精密度考察精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以保留時(shí)間及肉桂酸峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示肉桂酸保留時(shí)間的RSD為0.1%，峰面積的RSD為0.1%，說明儀器的精密度良好。

2.4.8重復(fù)性考察取供試品6份按“2.4.3”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，色譜條件同“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定供試品溶液中肉桂酸的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同一批號(hào)樣品制備的6份供試品溶液，肉桂酸含量平均值為5.2μg/g，RSD為0，表明該分析方法的重復(fù)性良好。

2.4.9穩(wěn)定性考察取對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在1.5h、7.5h、14h、20h、26h、32h分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖。取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液，在4h、6.5h、14.5h、20.5h、26.5h、32.5h分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖。結(jié)果顯示32h內(nèi)，肉桂酸對(duì)照品峰面積的RSD<2%，供試液中肉桂酸含量的RSD<2%，說明肉桂酸對(duì)照品溶液和桂附顆粒供試品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.10加樣回收率試驗(yàn)精密稱取10.07mg的肉桂酸對(duì)照品，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度線，制成每1mL含0.3980mg的溶液。精密量取3mL至100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，制成每1mL含0.01194mg的溶液。再精密量取5mL至10mL量瓶中，加水稀釋至刻度線，制成每1mL含5.969μg的準(zhǔn)確度對(duì)照品溶液。

取供試品約5mL，精密稱定，平行6份，分別精密加入上述準(zhǔn)確度對(duì)照品溶液5mL，加水至刻度線，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，肉桂酸的加樣回收率范圍為96.67%～100.00%，平均加樣回收率為98.34%，RSD為1.9%，準(zhǔn)確度較高。

2.4.10穩(wěn)定性考察取對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在1.5h、7.5h、14h、20h、26h、32h分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖。取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液，在4h、6.5h、14.5h、20.5h、26.5h、32.5h分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖。結(jié)果顯示32h內(nèi)，肉桂酸對(duì)照品峰面積的RSD<2%，供試液中肉桂酸含量的RSD<2%，說明肉桂酸對(duì)照品溶液和桂附顆粒供試品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5雜質(zhì)去除率測(cè)定精密量取“2.1”項(xiàng)下各濃度原液及“2.3”項(xiàng)下與之對(duì)應(yīng)的10mL殼聚糖操作后溶液，分別水浴蒸干后，放置于烘箱中105℃干燥3h，精密稱重。公式：雜質(zhì)去除率（%）=（殼聚糖操作前干膏重-殼聚糖操作后干膏重）/殼聚糖操作前干膏重×100%

2.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以肉桂酸保留率及雜質(zhì)去除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采取綜合加權(quán)評(píng)分的方法對(duì)結(jié)果分析測(cè)算。賦予肉桂酸保留率權(quán)重系數(shù)0.6、雜質(zhì)去除率權(quán)重系數(shù)0.4，計(jì)算方式：綜合評(píng)分=（肉桂酸保留率/肉桂酸保留率最大值）×0.6+（雜質(zhì)去除率/雜質(zhì)去除率最大值）×0.4［7］。見表3、表4。

由表2和表3結(jié)果可知，考察指標(biāo)為肉桂酸保留率及雜質(zhì)去除率兩因素的綜合評(píng)分，因素A、B、C均無顯著影響（P＞0.05），從表2中可知：A3＞A1＞A2，B2＞B1＞B3，C2＞C1＞C3，D1＞D3＞D2，結(jié)合極差分析，確定最優(yōu)殼聚糖除雜工藝是A3B2C2D1，即攪拌時(shí)間20min，生藥∶[KG-*3/5]藥液濃度為1∶[KG-*3/5]7，絮凝溫度60℃，殼聚糖加入量為1.4g/L。

2.7最優(yōu)殼聚糖除雜工藝驗(yàn)證以篩選出的最優(yōu)工藝條件，進(jìn)行3次連續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5，可見該除雜工藝可行。

3討論

3.1指標(biāo)成分選擇參考《中國(guó)藥典》2020年版一部“桂枝茯苓丸”〔含量測(cè)定〕桂枝的含量測(cè)定方法，方中桂枝為君藥，其主要活性成分為肉桂酸、桂皮醛，根據(jù)藥理學(xué)的研究［8］，肉桂酸具有消炎解熱、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，經(jīng)供試品前處理考察及分析方法驗(yàn)證，建立了以高效液相色譜法測(cè)定桂附顆粒肉桂酸的含量測(cè)定方法，其中桂皮醛并不穩(wěn)定，為揮發(fā)性成分，且易氧化分解，該處方采用傳統(tǒng)水提煎煮，導(dǎo)致提取液中桂皮醛含量低，不宜作為指標(biāo)性成分。以肉桂酸作為該方劑的指標(biāo)成分，更為適宜。

3.2除雜方法選擇在除雜預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)醇沉法、靜置法、離心法和殼聚糖法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示靜置法和離心法的純化效果甚微，故不采用。殼聚糖為天然高分子化合物，是一種毒害性極低、可生物降解和生物相容性好的絮凝劑［9］，通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：殼聚糖的加入量對(duì)絮凝作用是一個(gè)先增大后減小的趨勢(shì)，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)殼聚糖加入量在1.2～1.6g/L范圍內(nèi)。

醇沉法選取60%、70%、80%3個(gè)水平的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行試驗(yàn)。與殼聚糖法相比較，在相同雜質(zhì)去除率時(shí)，醇沉法的肉桂酸保留率低于殼聚糖法；同時(shí)乙醇沉淀法工藝存在后處理時(shí)間長(zhǎng)、安全水平低、液體溶劑殘留大［10］、產(chǎn)品穩(wěn)定性差等難題，且整個(gè)工藝成本較高［11-12］。從經(jīng)濟(jì)效益和生產(chǎn)安全考慮，不采用此法，最終選用殼聚糖對(duì)桂附顆粒進(jìn)行絮凝純化。從驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，采用殼聚糖除雜工藝對(duì)肉桂酸含量的保留率能達(dá)到90.88%，雜質(zhì)去除率達(dá)到14.94%，大大降低雜質(zhì)量的同時(shí)，能夠極大程度地保留有效成分，降低病人每日服用量，對(duì)下一步制粒工藝奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜合上述試驗(yàn)，以肉桂酸保留率及雜質(zhì)去除率綜合評(píng)分為篩選指標(biāo)，在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法優(yōu)選除雜工藝，得到殼聚糖除雜最佳條件為絮凝溫度60℃，藥材-藥液比1∶[KG-*3/5]7，殼聚糖加入比例1.4g/L，該方法簡(jiǎn)單可行，能保證藥液中肉桂酸高保留率及雜質(zhì)較高去除率。

桂附顆粒為中藥復(fù)方制劑，其有效成分具有多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，使用液相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)質(zhì)量控制靈敏、直觀［13］。本項(xiàng)目以桂附顆粒的君藥有效成分肉桂酸保留率和雜質(zhì)去除率作為殼聚糖除雜工藝效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)性，在盡可能保留藥效成分的基礎(chǔ)上，減少藥液中的雜質(zhì)量以降低患者每日服藥量，提升中藥制劑臨床效果和穩(wěn)定性，從而減輕患者的使用難度，增加患者依從性，為大生產(chǎn)中除雜提供了數(shù)據(jù)支持和參考。

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（收稿日期：2023-12-22編輯：陶希睿）

基金項(xiàng)目：2022年瀘州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022-SYF-92）。

作者簡(jiǎn)介：許曾（1991—），女，漢族，本科，主管中藥師，研究方向?yàn)樵簝?nèi)制劑研發(fā)。E-mail：971586709@qq.com