基于GC-MS分析避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油成分及抗氧化、抗菌活性

【摘要】目的：對避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油成分及其體外抗氧化、抗菌活性進行分析研究。方法：通過GC-MS、NIST標準譜庫和文獻檢索篩選避疫驅(qū)蚊香囊的揮發(fā)油成分，以DPPH、ABTS自由基評價其抗氧化活性，并以3種常見致病菌評價其抗菌活性。結(jié)果：GC-MS共鑒定出香囊揮發(fā)油中48個化合物（含量≥0.2%、匹配度＞800），主要化合物為單萜類（41.28%）和倍半萜類（25.33%），含量較高的是α-Asarone（16.44%），Eucalyptol（10.72%），Patchoulialcohol（9.44%）；香囊揮發(fā)油對自由基ABTS清除能力較強［IC50=（180.5±0.9）μg/mL］，并對枯草桿菌（MIC=100μg/mL）有較好的抗菌活性。結(jié)論：本研究明確了避疫驅(qū)蚊香囊的揮發(fā)油成分及體外抗氧化、抗菌活性，為進一步研究該香囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】避疫驅(qū)蚊香囊;揮發(fā)油;GC-MS;抗氧化;抗菌

【中圖分類號】R284.1

【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2024）18-0035-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418008

Abstract：ObjectiveToanalyzethevolatileoilcompositions，antioxidantandantibacterialactivitiesinvitroofthesachetforepidemicandmosquitoprevention.MethodsThevolatileoilcompositionsofsachetforepidemicandmosquitopreventionwereanalyzedbyGC-MS，NISTlibraryandliteraturesearch.TheantioxidantactivitywasevaluatedusingDPPHandABTSradicals，andtheantibacterialactivitywasevaluatedagainstthreecommonpathogenicbacteria.ResultsGC-MSidentifiedatotalof48compoundsinthevolatileoilofthesachetforepidemicandmosquitoprevention（content≥0.2%andmatchingdegree＞800），withthemajorcompositionsbeingmonoterpenes（41.28%）andsesquiterpenes（25.33%）.Thehighestcontentswereα-Asarone（16.44%），Eucalyptol（10.72%），andPatchoulialcohol（9.44%）.ThevolatileoilexhibitedstrongABTSradical-scavengingactivity（IC50=180.5±0.9μg/mL）andshowedfineantibacterialactivityagainstBacillussubtilis（MIC=100μg/mL）.ConclusionThisstudyelucidatedthevolatileoilcompositions，antioxidant，andantibacterialactivitiesinvitroofthesachetforepidemicandmosquitoprevention，whichprovidingascientificbasisforfurtherresearchonitsmedicinalefficacy.

Keywords：SachetforEpidemicandMosquitoPrevention;VolatileOil;GC-MS;Antioxidant;Antimicrobial

中藥香囊在我國日久歲深，源遠流長，因其佩戴方便、安全可靠、無創(chuàng)傷、小兒依從性好，可用于避疫驅(qū)蚊、預(yù)防和輔助治療細菌感染等，千百年來被歷代醫(yī)家所采用。中藥香囊源自中醫(yī)外治療法里的“衣冠療法”，常選用芳香開竅的中草藥研制成粉、佩于腰際，通過呼吸道或皮膚吸收形成高濃度的小環(huán)境而發(fā)揮其防病治病作用，是中醫(yī)外治領(lǐng)域一種古老的治療方法［1］，療效上達巔頂，下及涌泉，民間有“戴個香草袋，不怕五蟲害”的說法。

避疫驅(qū)蚊香囊是中藥香囊的一種，組方精妙，由七味芳香中藥艾葉150g、石菖蒲150g、紫蘇100g、佩蘭100g、白芷100g、藿香100g、薄荷100g干燥后粉碎、過篩、罐裝、封口制成。其中，艾葉、白芷、石菖蒲、紫蘇、藿香性溫，佩蘭性平，可芳香溫化濕邪、化濁行氣，而薄荷性涼，可芳香涼化熱邪、清熱解毒，諸藥合用可發(fā)揮化濁除濕、驅(qū)蟲辟邪、清心安神的作用。有研究［2-10］表明，艾葉、石菖蒲、紫蘇、白芷、藿香、薄荷揮發(fā)油具有抗菌作用，紫蘇、佩蘭、白芷、薄荷揮發(fā)油具有抗炎作用，艾葉、石菖蒲、紫蘇、白芷、薄荷揮發(fā)油具有抗氧化作用等。目前，對中藥香囊解熱、抗炎、抗菌、消毒等作用機制偶有報道［11］，避疫驅(qū)蚊香囊組方成分復(fù)雜，對其缺乏深入的研究，且物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，本研究對避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油成分及其體外抗氧化、抗菌活性進行分析研究，以期為闡明避疫驅(qū)蚊香囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1中藥材避疫驅(qū)蚊香囊由通化師范學院醫(yī)藥學院自制，所用藥材艾葉、石菖蒲、紫蘇、佩蘭、白芷、藿香、薄荷均由河北祥瑞中藥飲片有限公司提供。

1.1.2試劑乙醚（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；無水硫酸鈉（上海百舜生物科技有限公司）；DPPH（飛凈生物科技有限公司，純度≥97%）；ABTS（SigmaA1888，純度≥98%）；Trolox（安徽酷爾生物工程有限公司，純度≥98%）；二甲基亞砜（沈陽華東試劑廠，分析純）。

1.1.3標準菌株ATCC0157大腸埃希菌、CMCC63501枯草桿菌、ATCC13048產(chǎn)氣桿菌由通化師范學院微生物實驗室提供。氯霉素、硫酸鏈霉素購自上海麥克林生化科技股份有限公司。MH培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基購自北京鼎國生物科技有限公司。

1.1.4設(shè)備氣質(zhì)聯(lián)用儀（ThermoTSQ8000EVO，美國賽默飛公司）；Secura613-1CN型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；揮發(fā)油提取器（上海滬實實驗室設(shè)備有限公司）；DZTW型電子調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；ReadMax1900Plus型光吸收全波長酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；SK200型光學顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團公司）；SW-CJ-2FD潔凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-75SII（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.2方法

1.2.1避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油提取及處理水蒸氣蒸餾法提取避疫驅(qū)蚊香囊的揮發(fā)油，取香囊各藥材適當粉碎置于5L圓底燒瓶中，添加6倍藥材量的蒸餾水連續(xù)提取5h，得到具有芳香氣味的黃綠色透明油狀液體，經(jīng)無水硫酸鈉脫水干燥，密封保存，備用。

1.2.2避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油的GC-MS分析氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS）系統(tǒng)（ThermoTSQ8000EVO）分析避疫驅(qū)蚊香囊的揮發(fā)油成分，揮發(fā)油用乙醚稀釋至濃度為0.1mg/mL，并通過0.22μm的過濾器。

氣相色譜條件：色譜柱為石英毛細管柱TG-5（30m×0.25mm×0.25μm），載氣為氦氣，流速為1.0mL/min，使用如下柱溫程序60℃保持5min，以2℃/min升至150℃，再以10℃/min升至200℃，最后以20℃/min升至250℃保持5min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70eV，傳輸線溫度為280℃，離子源溫度300℃，進樣口溫度為280℃；掃描質(zhì)量范圍為50～550amu；溶劑延遲時間為3.0min。

1.2.3抗氧化活性測定根據(jù)文獻［12］的方法測定DPPH、ABTS清除活性。

DPPH測定：將100μL香囊的揮發(fā)油和100μLDPPH甲醇溶液（50μm）在微孔板中混合，在室溫下在黑暗中靜置30min。在515nm處記錄樣品的吸光度。丁基化羥基甲苯（BHT），L-抗壞血酸和6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）被用作陽性參考。計算半數(shù)最大抑制濃度（IC50）值。

ABTS測定：將190μL稀釋的ABTS溶液和10μL在DMSO中的香囊揮發(fā)油在微孔板中混合，在黑暗中孵育20min。在734nm處記錄樣品的吸光度。以BHT、L-抗壞血酸和Trolox為陽性參考，計算IC50值。

1.2.4抗菌活性測定根據(jù)文獻的方法［13］測定抗菌活性。以4%的Tween80作溶劑制備濃度為128mg/mL的香囊揮發(fā)油母液，用MH肉湯培養(yǎng)基為稀釋劑以二倍稀釋法制備不同濃度的供試品溶液。在96孔板的每個孔中填充100μL的供試品溶液和100μL的工作菌液（菌落計數(shù)為5×108CFU/mL），37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察孔中的變化。第1個干凈透明孔對應(yīng)的濃度確定為最小抑菌濃度（MIC）。在此基礎(chǔ)上，將澄清的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到MH培養(yǎng)基上，于37℃再恒溫培養(yǎng)24h。若沒有觀察到菌落生長，則認為此時的濃度為最低殺菌濃度（MBC）。以氯霉素和硫酸鏈霉素作為陽性對照。

1.3統(tǒng)計學方法所有實驗平行測定3次，利用SPSS22.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油的GC-MS圖譜取以乙醚溶解的避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油，按“1.2.2”項下實驗條件進樣1μL，得到揮發(fā)油的總離子流圖。如圖1所示。

2.2避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油的GC-MS鑒別結(jié)果采用Xcalibur軟件（版本2.2.42，ThermoFisherScientific，USA）記錄和分析數(shù)據(jù)。通過檢索標準質(zhì)譜圖庫NIST，以匹配度為基礎(chǔ)（SI＞800）結(jié)合相關(guān)文獻［14-19］進行篩選。用離子流色譜峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。共鑒定出48個化合物（占比87.58%），并對峰進行了藥材歸屬。結(jié)果見表1。

2.3避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油的抗氧化活性本實驗選取自由基DPPH、ABTS探究避疫驅(qū)蚊香囊的抗氧化活性，IC50值越小，表明樣品DPPH自由基清除能力越強，即樣品抗氧化性越強。結(jié)果見表2。

2.4避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油的抗菌活性研究［19］表明，避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油中的主要化學成分α-Asarone（α-細辛醚，16.44%）具有抗菌作用；主要成分Eucalyptol（桉油精，10.72%）和Patchoulialcohol（百秋李醇，9.44%）來源廣泛，也對多種致病菌有抑制或殺滅作用［14］。本實驗選取3種常見致病菌大腸埃希菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌探究避疫驅(qū)蚊香囊的抗菌活性。結(jié)果見表3。

3討論

GC-MS結(jié)合NIST標準譜庫明確避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油成分共48個（含量≥0.2%、匹配度＞800），包括單萜類（41.28%）、倍半萜類（25.33%）、酚醚酯類（20.97%）化合物，經(jīng)查閱文獻有43個成分得到了歸屬，成分大多來自于艾葉，其次為石菖蒲。另外，該香囊揮發(fā)油含有常見的、共同的化學成分，如α-Pinene（0.50%）、β-Pinene（0.43%）、α-Terpineol（1.44%）為艾葉、石菖蒲、紫蘇、薄荷共有，Camphene（0.98%），Eugenol（0.78%），β-Caryophyllene（1.23%）為艾葉、紫蘇、薄荷共有，β-Elemene（0.23%）和Caryophylleneoxide（0.59%）為艾葉、石菖蒲、紫蘇、白芷、藿香共有。從相對含量來看，含量較高的成分有α-Asarone（16.44%，石菖蒲的主要成分），Eucalyptol（10.72%，艾葉的主要成分），Patchoulialcohol（9.44%，藿香的主要成分）。避疫驅(qū)蚊香囊揮發(fā)油成分分析的過程中，有少數(shù)成分未得到藥材歸屬，例如β-Selinene，它是該香囊成分β-Elemene和β-Caryophyllene的同分異構(gòu)體，推測其可能在熱、溶解、藥材生長環(huán)境或復(fù)雜組方環(huán)境下通過化學反應(yīng)形成，可見混合方中揮發(fā)油的成分和相對含量并不是其單味藥的簡單相加。

避疫驅(qū)蚊香囊對自由基ABTS清除能力較強［IC50=（180.5±0.9）μg/mL］而對DPPH清除能力較弱［IC50=（826.3±0.6）μg/mL］，這種差異是由于抗氧化成分對不同類型自由基的反應(yīng)機制和選擇性不同。以往的研究［2-10］表明，艾葉、薄荷揮發(fā)油有很強的ABTS自由基清除能力（IC50=42.3～96.88μg/mL），雖然石菖蒲揮發(fā)油的ABTS自由基清除能力較弱（IC50=3000.0μg/mL），但是石菖蒲中主要揮發(fā)性成分α-Asarone（α-細辛醚）可誘導紋狀體、海馬、皮質(zhì)的抗氧化物酶發(fā)揮抗氧化作用。另外，艾葉、石菖蒲、紫蘇、白芷、藿香、薄荷揮發(fā)油對DPPH清除能力均較弱（IC50＞700μg/mL）。這些單味中藥抗氧化活性的前期研究結(jié)果與避疫驅(qū)蚊香囊整體的抗氧化活性結(jié)果一致。

避疫驅(qū)蚊香囊對革蘭氏陽性菌枯草桿菌的抑菌活性相對較強，MIC值為100μg/mL，而對革蘭氏陰性菌包括大腸埃希菌、產(chǎn)氣桿菌有較弱的抗菌活性。以往的研究［2-10］表明，單味中藥艾葉、石昌蒲、藿香、薄荷的揮發(fā)油抗菌活性顯示，它們對革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更敏感，紫蘇精油對枯草芽孢桿菌的抑制能力明顯強于對大腸桿菌的抑制能力，這與避疫驅(qū)蚊香囊整體的抗菌活性結(jié)果一致。

避疫驅(qū)蚊香囊是一個含七味芳香藥材的混合香囊組方，本研究明確了避疫驅(qū)蚊香囊的揮發(fā)油成分及一定的體外抗氧化、抗菌活性，為進一步研究該香囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學依據(jù)，但該組方中復(fù)雜的相互作用和內(nèi)在機制尚需進一步研究。

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（收稿日期：2023-12-20編輯：陶希睿）

基金項目：吉林省中醫(yī)藥科技項目（No.2023091）；通化師范學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（No.202310202032）。

作者簡介：鐘愛嬌（1990—），女，漢族，碩士，助教，研究方向為中藥質(zhì)量控制與評價。E-mail：aijiao_zhong@163.com

通信作者：武子敬（1980—），女，漢族，碩士，高級實驗師，研究方向為中藥學及藥理活性研究。E-mail：fabeer@163.com