多元素分析結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法快速判別寧夏和青海枸杞

連思雨,謝瑜杰,張紫娟,范春林,王明林，陳輝*

1(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京,100176) 2(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安,271018)

隨著人們生活質(zhì)量提升，枸杞等藥食兼用的特色高值農(nóng)產(chǎn)品開始進入大眾視野。枸杞中含有豐富的多糖、氨基酸、黃酮類化合物、甜菜堿、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分[1-2]，具有提高機體免疫力、改善視力、調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓、延緩衰老、抗癌抑制腫瘤等效用[3-5]，已經(jīng)成為生活中常用的養(yǎng)生滋補佳品。但隨著科研深入，人們已經(jīng)不滿足單純對枸杞的營養(yǎng)成分、藥理作用[6]進行研究，更傾向于枸杞產(chǎn)地、來源等真實性信息探究，這也是消費者直接關(guān)心的問題。

目前常用的食品產(chǎn)地溯源的方法有穩(wěn)定性同位素技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)及礦物元素分析技術(shù)等。穩(wěn)定性同位素技術(shù)在谷物溯源時使用較多，CHUNG等[7]和RASHMI等[8]曾應(yīng)用穩(wěn)定性同位素技術(shù)分別對來自不同地域的水稻以及小麥進行溯源。近紅外光譜技術(shù)在魚類和肉類中應(yīng)用廣泛[9]，OTTAVIAN等[10]利用近紅外光譜技術(shù)對野生和飼養(yǎng)的海鱸魚進行區(qū)分；孫淑敏[11]和史巖等[12]利用近紅外光譜技術(shù)對肉類進行溯源。礦物元素溯源技術(shù)較為常用，在肉類[13]、魚類[14]、酒類[15]及谷物類[16]均有應(yīng)用。比較國內(nèi)外溯源技術(shù)發(fā)現(xiàn)，礦物元素分析技術(shù)通過元素差異鑒別食品產(chǎn)地，操作簡單且更加快速準(zhǔn)確，是食品產(chǎn)地溯源的關(guān)鍵[17-18]。

枸杞原本為野生資源，從20世紀60年代開始廣泛種植，如今枸杞在我國主要有寧夏、青海、甘肅、內(nèi)蒙及新疆等幾大產(chǎn)區(qū)。目前寧夏枸杞、中寧枸杞已經(jīng)注冊為地理標(biāo)識，價格昂貴[19]但深受大眾喜愛；青海地區(qū)由于其地理位置優(yōu)越，污染較少，已經(jīng)發(fā)展為我國枸杞的第2大產(chǎn)區(qū)，種植面積達到了43.9萬畝，成為后起之秀[20]，但在價格和影響力方面仍不及寧夏枸杞。由于兩大產(chǎn)區(qū)的枸杞相似性很高，不法商販為了謀取利益，經(jīng)常利用消費者心理虛構(gòu)產(chǎn)地，導(dǎo)致枸杞市場混亂。因此，關(guān)于寧夏和青海兩大產(chǎn)區(qū)的枸杞鑒別技術(shù)亟待發(fā)展。

本文應(yīng)用電感耦合等離子體-質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)測定了寧夏地區(qū)和青海地區(qū)共180種枸杞中44種元素含量，首次通過測定元素含量結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，包括偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)和反向傳輸人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(back propogation artificial neural network, BP-ANN)，建立了寧夏和青海枸杞產(chǎn)地的溯源模型，并考察模型的特異性和靈敏度，為枸杞溯源及產(chǎn)地鑒別提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器于設(shè)備

超微量天平,梅特勒-托列多儀器上海有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng),美國Millproe公司；Agilent 7700x電感耦合等離子-質(zhì)譜儀,美國Agilent Technologies；CEM MARS 6 微波消解儀,美國CEM公司。

1.2 試劑和材料

濃HNO3、H2O2，均為MOS級，北京化學(xué)試劑廠；超純水(18.2 MΩ·cm)：由Milli-Q超純水系統(tǒng)所制，用于定容樣品溶液和配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；稀土元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 μg/mL)、多元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 μg/mL)、內(nèi)標(biāo)液(100 μg/mL)、調(diào)諧液(10 μg/L), 美國Agilent Technologies；Rh單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL), 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)胡蘿卜(GSBW10047)。

2018年在寧夏玉門、瓜州、惠農(nóng)等地區(qū)收集地理信息可靠的枸杞樣品99個，在青海都蘭縣、諾木紅等地區(qū)收集地理信息可靠的枸杞樣品81個。

1.3 溶液配制及樣品前處理

標(biāo)液制備：將稀土元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液和多元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋至適當(dāng)濃度；內(nèi)標(biāo)液：將100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液用10% HNO3(體積分數(shù))稀釋成1 mg/L，Rh標(biāo)準(zhǔn)液用于稀土元素分析；調(diào)諧液：將10 μg/L調(diào)諧液用10% HNO3稀釋成1 μg/L。

取適量枸杞放入烘箱，在65 ℃條件下烘烤48 h，冷卻后研磨至粉末狀態(tài)，過60目篩，裝入100 mL樣品瓶貼簽備用。

用超微量天平稱取0.2 g粉末狀樣品，精確至0.000 1 g，放入潔凈干燥的聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL濃HNO3，室溫下放置過夜，次日加入2 mL H2O2，室溫下反應(yīng)20 min，將聚四氟乙烯消解罐加蓋后放入微波消解儀按照表1設(shè)定好的程序進行消解。

表1 微波消解工作參數(shù)

消解完成后，冷卻至室溫后打開消解罐，用超純水洗滌消解罐3次，定容至50 mL，混勻。

1.4 ICP-MS測定條件

ICP-MS測定的參數(shù)均由儀器自動調(diào)諧給出，每次測定前均進行調(diào)諧，根據(jù)儀器的狀態(tài)對參數(shù)進行調(diào)整，以滿足靈敏度、氧化物、穩(wěn)定性等各項指標(biāo)。射頻功率1 550 W，射頻電壓1.66 V，載氣流量1.00 L/min，蠕動泵采集樣品時轉(zhuǎn)速0.1 r/s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

在與測定實驗樣品相同的儀器條件下連續(xù)測定試劑空白6次，以試劑空白檢出限的3倍為定量限(limit of quantitation, LOQ)濃度，10倍為檢出限(limit of detection, LOD)濃度。應(yīng)用安捷倫Mass hunter軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有元素含量統(tǒng)一濃度后(μg/kg)直接導(dǎo)入Mass Profiler Professional軟件應(yīng)用單邊方差分析(P<0.05)，并應(yīng)用該軟進行PLS-DA和BP-ANN分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 元素含量分析

對寧夏和青海2個地區(qū)枸杞的稀土元素和礦物元素含量進行統(tǒng)計，結(jié)果見表2，枸杞中元素含量存在明顯差異。從表2可以看出，在稀土元素中，除寧夏地區(qū)La的平均含量>1 mg/kg，兩地其余稀土元素含量均處于較低水平，寧夏地區(qū)枸杞樣品稀土元素的平均含量均高于青海地區(qū)；微量元素測定結(jié)果顯示，兩地區(qū)K、Na、Mg 3種元素含量較高，寧夏地區(qū)其平均含量分別為15 697、5 867、1 057 mg/kg，青海地區(qū)平均含量分別為15 361、3 969、809 mg/kg；其次是寧夏地區(qū)Al、Ca、Fe、Sb、Zn、Mn、Cu、Sr、Cr、Rb、Ba 11種元素和青海地區(qū)Al、Ca、Fe、Sb、Zn、Mn、Cu、Sr、Rb 9種元素，這些元素的平均含量均高于1 mg/kg；兩地其余元素均處于較低水平，對比發(fā)現(xiàn)，Sb在寧夏地區(qū)枸杞中含量僅為27.963 mg/kg，而青海地區(qū)高達71 094 mg/kg，是青海地區(qū)唯一高于寧夏地區(qū)的元素。

表2 寧夏和青海地區(qū)枸杞元素含量 單位：mg/kg

將兩地枸杞樣品平均值進行統(tǒng)計分析，所測44種元素中Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se 9種元素存在顯著性差異(P<0.05)。這些結(jié)果可能與枸杞生長的地理環(huán)境、氣候條件息息相關(guān)。

2.2 模型的靈敏度和特異性

對于只含有2類樣品判別的模型，可以采用靈敏度和特異性這2個參數(shù)對其進行評價。靈敏度是指在模型中某類樣品被識別為該類樣品的百分比，特異性是指其他類樣品不被判別為該類樣品的百分比。對于該類模型，存在4種情況，即真陽性(true positive, TP)，真陰性(true negative, TN)，假陽性(false positive, FP)和假陰性(false negative, FN)，用TP/(TP+FN)×100來表示模型靈敏度，用TN/(TN+FP)×100來表示模型特異性[21]。

2.3 主成分分析

所有枸杞樣品中的元素含量統(tǒng)一為質(zhì)量分數(shù)后(μg/kg)直接導(dǎo)入軟件，Mass Profiler Professional (MPP，version B. 15.0)進行分析。應(yīng)用MPP對寧夏和青海枸杞中44種元素含量進行統(tǒng)計分析，以寧夏枸杞樣品為中心，按照不同樣品間元素含量倍數(shù)2倍對元素進行過濾，將具有顯著差異的9種元素(Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se)進行主成分分析(principal component analysis, PCA)。圖1給出了99個寧夏枸杞和81個青海枸杞樣品在前2個主成分的得分分布圖，除個別樣品外，青海和寧夏枸杞樣品基本可以分開。寧夏枸杞位于第1主成分的負半軸，青海枸杞位于第1主成分的正半軸，前2個主成分可以解釋64.2%的變量，這表明，寧夏和青海枸杞中元素含量存在著一定的差異，基于多種元素對寧夏和青海枸杞進行判別是可行的。

寧夏(■);青海(▲)

2.4 模型建立與預(yù)測

2.4.1 PLS-DA模型

基于前述9種元素，應(yīng)用PLS-DA算法建立青海和寧夏枸杞的判別模型，采用多重交叉檢驗的方式進行模型驗證，重復(fù)10次。在模型確認和模型訓(xùn)練中寧夏枸杞樣品判別的靈敏度均為100%，而青海枸杞則均有2個樣品被判別為寧夏枸杞，模型的特異性為97.5%。為了進一步驗證模型的可靠性，分別從青海和寧夏枸杞中隨機選出75%的樣品建立模型，剩余25%的樣品則用于對模型進行確認。結(jié)果表明，應(yīng)用75%的枸杞樣品建模時，74個寧夏枸杞和61個青海枸杞均分別有1個樣品被誤判，模型的識別靈敏度和特異性分別為98.6%和98.4%，見表3。應(yīng)用該模型對剩余25%的枸杞樣品進行判別，25個寧夏枸杞和20個青海枸杞均能被準(zhǔn)確預(yù)測，模型預(yù)測的準(zhǔn)確率為100%。

表3 PLS-DA和BP-ANN模型靈敏度和特異性比較 單位：%

2.4.2 BP-ANN模型

基于前述9種元素，應(yīng)用BP-ANN算法建立青海和寧夏枸杞的判別模型，采用分層人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，輸入層含有7個神經(jīng)元，隱層含有3層,每層含15個隱含節(jié)點，輸出層為2個節(jié)點；迭代層數(shù)為100；驗證類型為留一法。在模型確認和模型訓(xùn)練中青海和寧夏枸杞樣品判別的靈敏度和特異性均為100%，即在該模型中青海和寧夏枸杞均能完全區(qū)分。

與PLS-DA模型類似，采用75%的樣品建模，25%的樣品預(yù)測的方式對BP-ANN方法建立的青海和寧夏枸杞判別模型的可靠性進行驗證。結(jié)果表明，應(yīng)用75%的枸杞樣品建模時，74個寧夏枸杞和61個青海枸杞均能準(zhǔn)確分類，模型的靈敏度和特異性均為100%，應(yīng)用該模型對剩余25%的枸杞樣品進行判別，25個寧夏枸杞和20個青海枸杞均能被準(zhǔn)確預(yù)測，模型預(yù)測的準(zhǔn)確率為100%，見表3。

這表明，相比于PLS-DA模型，基于多種微量元素建立的寧夏和青海枸杞BP-ANN模型具有較強的判別能力。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用微波消解結(jié)合ICP-MS測定了來自寧夏和青海共180個枸杞樣品中44種微量元素含量。結(jié)果顯示，2個地區(qū)枸杞中Sb、La、Tb、Lu、Al、Sc、V、Cr、Se 9種微量元素存在顯著差異，對9種差異性成分進行PCA分析識別，前2個主成分可以解釋64.2%的變量，基本可以區(qū)分寧夏和青海2個地區(qū)的枸杞樣品。利用PLS-DA算法和BP-ANN算法建模，發(fā)現(xiàn)BP-ANN模型的靈敏度和特異性均為100%，優(yōu)于PLS-DA模型?？偠灾疚氖状谓⒌幕诙嘣胤治?、結(jié)合模式識別快速判別寧夏和青海枸杞的溯源技術(shù)，可以快速實現(xiàn)兩地枸杞的判別。