施馬倫貝格病毒實(shí)時(shí)熒光RT-RAA快檢方法的建立

摘 要： 旨在建立一種快速檢測(cè)施馬倫貝格病毒（SBV）的方法。本研究對(duì)于SBV S基因，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立SBV反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸恒溫?cái)U(kuò)增（RT-RAA）檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法在38 ℃條件下，8 min內(nèi)即可特異性檢出SBV，與口蹄疫病毒（FMDV）、小反芻獸疫病毒（PPRV）、非洲馬瘟病毒（AHSV）、塞內(nèi)卡谷病毒（SVV）、水皰性口炎病毒（VSV）無交叉反應(yīng)，其敏感性為 103拷貝/反應(yīng)，且批內(nèi)和批間重復(fù)性變異系數(shù)均小于5%。對(duì)模擬陽性和陰性綿羊樣品的檢出率為100%，與SBV 的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果一致。本研究成功建立了一種快速、敏感、特異的SBV實(shí)時(shí)熒光RT-RAA方法，為SBV防控提供新技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞： 施馬倫貝格病毒；重組酶介導(dǎo)核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3740-05

收稿日期：2023-09-04

基金項(xiàng)目：西南民族大學(xué)“雙一流”項(xiàng)目（畜禽重要病原感染與免疫機(jī)制及防治新策略研究團(tuán)隊(duì)， XM2023012）；四川省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（面上項(xiàng)目）（非核酸STING激動(dòng)劑MSA-2+Mn2+抗豬病毒感染作用及其應(yīng)用研究；22NSFSC2548）；2022年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（施馬倫貝格病毒反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸恒溫?cái)U(kuò)增快檢方法的建立與應(yīng)用，X202210656199）；西南民族大學(xué)引進(jìn)高層次人才科研啟動(dòng)金資助項(xiàng)目（宿主抗RNA病毒感染先天性免疫反應(yīng)及其調(diào)控的分子機(jī)制的研究16011211013）

作者簡(jiǎn)介：陳嘉儀（2002-），女，湖南永州人，本科，主要從事動(dòng)物病毒檢測(cè)技術(shù)研究，E-mail：549480733@qq.com

通信作者：李彥敏，長(zhǎng)期致力于主要從事動(dòng)物重大病毒感染與免疫機(jī)制及其防控新技術(shù)研究，E-mail：liyanmin@swun.edu.cn;張志東，長(zhǎng)期主要從事動(dòng)物重大病毒感染與免疫機(jī)制及其防控新技術(shù)研究，E-mail：zhangzhidong@swun.edu.cn

Development of a Real-time RT-RAA Assay for Rapid Detection of Schmallenberg

Virus

CHEN" Jiayi， HUANG" Xiaoqi， WANG" Weijie， MO" Junyu， WANG" Suyan， DANZHENnbsp; Wengmu， CHEN

Jinsong， ZHANG" Rui， ZHOU" Long， LI" Yanmin*， ZHANG" Zhidong*

（College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Southwest Minzu University， Chengdu 610041，

China）

Abstract： The aim of this study was to establish a rapid detection method of Schmallenberg virus （SBV）. A real-time reverse transcription recombinase acid amplification （RT-RAA） was developed with specific primers and probes based on of SBV S gene. The results showed that， through optimizing experimental conditions， the assay could completedetect SBV specifically within 8 minutes at 38 ℃. which can There was no cross-react with foot-and-mouth disease virus（FMDV）， smallpestedes petites ruminants disease virus（PPRV）， African horse distemper virus（AHSV）， Seneca valley virus（SVV）， or vesicular stomatitis virus（VSV）. The detection of limit（LOD）was 103 copies/reaction. At the same time， the co-efficient of variations in intra- and inter-assay were both less than 5%. The detection rate for the spinked positive samples and negative sheep samples was 100%， which was consistent with SBV RT-qPCR results. This study successfully established a fast， sensitive， and specific real-time RT-RAA assay for detection of SBV， which provided a new technical method for prevention and control of SBV infection.

Key words： Schmallenberg virus; recombinase-acid amplification; rapid detection

*Corresponding authors：" LI Yanmin， E-mail： liyanmin@swun.edu.cn; ZHANG Zhidong， E-mail： zhangzhidong@swun.edu.cn

施馬倫貝格病是由施馬倫貝格病毒（Schmallenberg virus，SBV）引起的一種新發(fā)媒介昆蟲傳染?。?］。2011年在德國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，在羊、牛等反芻動(dòng)物中流行［2-3］，給歐洲畜牧業(yè)帶來沉重打擊［4-5］。目前，該病尚未傳入我國(guó)，但隨著我國(guó)與歐盟的貿(mào)易日漸頻繁，其傳入風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。

目前，針對(duì)SBV的檢測(cè)主要包括分子生物學(xué)、血清學(xué)檢測(cè)等方法［6-10］，其中RT-qPCR在SBV早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其存在儀器復(fù)雜、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等不足，不適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速診斷［11-12］，急需建立一種敏感性高、特異性強(qiáng)的SBV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)。重組酶介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（recombinant enzyme mediated isothermal nucleic acid amplification，RAA）具有簡(jiǎn)單、節(jié)能、便攜等特點(diǎn)，是現(xiàn)場(chǎng)快速篩查病原的新型診斷技術(shù)［13］。因此，本研究針對(duì)SBV S基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針建立SBV 實(shí)時(shí)熒光RT-RAA檢測(cè)方法，以期為該疫病診斷提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SBV S質(zhì)粒、SBV RNA標(biāo)準(zhǔn)品、AHSV VP7質(zhì)粒、FMDV RNA、VSV RNA、SVV RNA、PPRV疫苗株RNA均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器

RT-熒光型核酸擴(kuò)增試劑（RAA法）、熒光型核酸擴(kuò)增試劑（RAA法）購(gòu)自杭州眾測(cè)生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；熒光定量PCR儀為Archimed X4（鯤鵬基因（北京）科技有限責(zé)任公司）；超微量分光光度計(jì)K5800C（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）。

1.3 引物與探針

利用GenBank中公布的SBV序列，分析對(duì)比SBV S基因保守序列，使用PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)多條引物和探針（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 核酸提取

AHSV、PPRV、SVV、VSV的核酸使用病毒 DNA/RNA 試劑盒，按說明書進(jìn)行操作，提取的核酸于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光RT-RAA反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

按照RT-熒光型核酸擴(kuò)增試劑（RAA法）配置50 μL反應(yīng)體系，3對(duì)引物進(jìn)行矩陣法組合，篩選出信號(hào)強(qiáng)、反應(yīng)快的1對(duì)組合。設(shè)定不同反應(yīng)溫度（37～42℃）和不同擴(kuò)增時(shí)間（10～35 min）進(jìn)行反應(yīng)，以確定最佳反應(yīng)條件。

1.6 敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

將SBV RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍比稀釋（106～101 copies·μL-1），進(jìn)行敏感性檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。分別以SBV、FMDV、AHSV、VSV、SVV、PPRV的核酸為模板，評(píng)估RT-RAA方法的特異性；分別取103、105、107 copies·μL-1 RNA標(biāo)準(zhǔn)品，開展組間和組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)估其重復(fù)性。

1.7 樣品檢測(cè)

鑒于國(guó)內(nèi)無SBV疫情而無法獲取陽性和疑似臨床樣品，將收集的20份健康羊陰性樣品，摻入SBV RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模擬陽性樣品，同時(shí)利用RT-RAA和RT-PCR法檢測(cè)，比較二者檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)體系的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對(duì)引物組合、反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件優(yōu)化，篩選出引物組合F3/R3起峰時(shí)間短且終點(diǎn)熒光值最高，被確定為最佳引物對(duì)；基于時(shí)間效率、熒光值、擴(kuò)增曲線等因素，確定最佳反應(yīng)體系為：A Buffer 25 μL、ddH2O 12.9 μL、10 μmol·L-1上/下游引物各2 μL、Probe 0.6 μL、核酸模板5μL 、B Buffer 2.5 μL；最佳反應(yīng)溫度為38 ℃，擴(kuò)增反應(yīng)15 min。

2.2 敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)

將RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍比稀釋（106～101 copies·μL-1），進(jìn)行敏感性檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖1A），其最低檢測(cè)下限為103拷貝/反應(yīng)（擴(kuò)增時(shí)間閾值=CT值×0.5）；而實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法為102 拷貝/反應(yīng)。特異性試驗(yàn)表明，該方法只針對(duì)SBV擴(kuò)增曲線為陽性，其余5種病毒均為陰性（圖1B）。通過對(duì)3種不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性試驗(yàn)表明，其組內(nèi)的CV值為1.5%～4.6%，組間的為2.3%～4.4%，均在5%以下。

2.3 樣本檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的RT-RAA檢測(cè)方法對(duì)20份模擬樣品（16份陽性、4份陰性）進(jìn)行檢測(cè)，并與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR相比較，結(jié)果顯示，RT-RAA檢測(cè)出陽性樣本16份，CT值在6.5～28.9內(nèi)（CT＜35判定陽性），陰性樣品4份，均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（CT≥35或無曲線擴(kuò)增判定為陰性），與RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果完全一致。

3 討 論

SBV是一種新發(fā)RNA病毒，嚴(yán)重威脅反芻動(dòng)物（牛、羊等）養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展?？焖?、特異性的SBV檢測(cè)是SBV 防治中必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)。RAA具有簡(jiǎn)單、快速、敏感性及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)［14］，已在多種生物源檢測(cè)上展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛能［15］，本研究建立的SBV實(shí)時(shí)熒光RT-RAA的快速測(cè)定方法，在恒溫38℃，8 min內(nèi)就可得出檢出結(jié)果，其敏感性103 拷貝/反應(yīng)，對(duì)用模擬陽性樣品和陰性羊樣品的檢出率與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR一致，且相比實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法具備操作快捷便利、無需復(fù)雜設(shè)備的優(yōu)勢(shì)，適用于田間樣品快檢，為SBV的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了一種新快檢方法。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功建立了施馬倫貝格病毒實(shí)時(shí)熒光RT-RAA快速檢測(cè)方法，該方法具備快捷便利、無需復(fù)雜設(shè)備、特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)。通過試驗(yàn)證明，該方法在野外、養(yǎng)殖場(chǎng)等現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中展現(xiàn)出顯著的應(yīng)用潛力。

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（編輯 范子娟）