環(huán)尾狐猴弓形蟲感染診治

摘要：四川某飼養(yǎng)單位于2022年7月起陸續(xù)發(fā)現(xiàn)環(huán)尾狐猴開始出現(xiàn)精神萎靡、不好動、食欲廢絕等癥狀，且病程短、死亡率較高。通過實(shí)驗(yàn)室檢測診斷為弓形蟲感染，選擇林可霉素、螺旋霉素、磺胺類等藥物進(jìn)行防治，取得了一定的治療效果。

關(guān)鍵詞：環(huán)尾狐猴；弓形蟲；檢測；診斷；治療

環(huán)尾狐猴（Lemur catta）屬于原始靈長類，分布于非洲馬達(dá)加斯加島南部和西部的干燥森林中，生活在疏林裸巖地帶。環(huán)尾狐猴被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》CITES附錄Ⅰ中。其性情溫和，身體背部的毛呈淺灰褐色，腹部為灰白色，額部、耳背和頰部為白色，與黑色的吻部和眼圈構(gòu)成了鮮明的對比色彩，十分有趣。很多動物園和萌寵樂園都飼養(yǎng)有環(huán)尾狐猴。四川某飼養(yǎng)單位于2022年7月陸續(xù)發(fā)現(xiàn)環(huán)尾狐猴開始發(fā)病，多數(shù)出現(xiàn)精神萎靡、不好動、食欲廢絕、體溫升高或體溫變化不明顯，有些病程很短就死亡，取死亡動物組織實(shí)驗(yàn)室檢測診斷為弓形蟲感染，經(jīng)治療和預(yù)防投藥，取得一定效果。

1 發(fā)病情況

2022年7月5，飼養(yǎng)人員發(fā)現(xiàn)一亞成體環(huán)尾狐猴出現(xiàn)精神萎靡、不好動、食欲廢絕、體溫升高，血液常規(guī)和生化無明顯異常，經(jīng)治療無效死亡，取該動物血液及死亡后心、肝、脾、肺、腎做弓形體抗原核酸檢測弓形蟲陽性。7月21日、7月27日相繼又有環(huán)尾狐猴發(fā)病，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，結(jié)合臨床特征，按照弓形蟲感染進(jìn)行治療，7月21日發(fā)病的環(huán)尾狐猴，經(jīng)過長達(dá)20 d的治療，動物逐漸康復(fù)，7月27日發(fā)病個體治療無效死亡。

2 材料與方法

2.1 樣品采集及處理

血液樣本采集自發(fā)病環(huán)尾狐猴個體。在麻醉的情況下，使用含有EDTA的采血管從待測動物后肢靜脈中采集全血樣本，分裝后至4 ℃保存至血漿分離及DNA提取。收集死亡動物剖檢后心、肝、脾、肺、腎等組織樣本進(jìn)行組織病理切片及DNA提取。血液樣本DNA提取試劑盒采用QIAGEN的QIAamp DNA Blood Mini Kit；組織樣本DNA提取試劑盒采用QIAGEN的Blood & Tissue Kit；PCR預(yù)混液（包括DNA聚合酶，10×Buffer，dNTP等）購自賽默飛世爾科技公司，DL2000 DNA Marker購自Biosharp公司。

2.2 血清抗體檢測

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和改良凝集試驗(yàn)（modified agglutination test，MAT）對血漿樣本中弓形蟲抗體IgG進(jìn)行檢測。ELISA試劑盒購自北京天之泰生物科技有限公司，MAT試劑盒購自美國田納西大學(xué)研究基金會，實(shí)驗(yàn)使用96孔U型板進(jìn)行，血漿樣本按1∶25～1∶200連續(xù)稀釋。具體實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果判定參照商用試劑盒說明書進(jìn)行。當(dāng)MAT和ELISA結(jié)果均為陽性時，判斷檢測結(jié)果為陽性，反之則為陰性；當(dāng)MAT與ELISA結(jié)果不同時，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若結(jié)果仍不相同，則判斷結(jié)果為疑似陽性。

2.3 抗原核酸檢測

參照Homan等[1]報道的弓形蟲529 bp重復(fù)序列（AF146527.1），對提取的環(huán)尾狐猴組織及血液DNA進(jìn)行弓形蟲PCR檢測，使用引物對：上游引物529ToxoF（5'-CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3'）和下游引物529ToxoR（5'-CTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 ？滋L，其中包括12.5 ？滋L的PCR預(yù)混液（Dream Taq Green MM），8.5 ？滋L的雙蒸水，50 ？滋mol/L上下游引物各1 ？滋L，DNA模板2 ？滋L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 1 min，退火65 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析（120 V，35 min）。

3 結(jié)果與診斷

3.1 剖檢與病理組織切片分析

死亡動物剖檢主要病變是肺充血、出血，胸腔積液增多，多數(shù)發(fā)病急的動物組織器官剖檢無明顯肉眼所見病變。死亡動物組織切片主要表現(xiàn)為肺組織出血、淤血、充血，肝細(xì)胞水腫、變性、多灶性壞死、肝細(xì)胞膽汁淤積，心臟灶區(qū)心肌纖維波浪樣變，腸系膜淋巴結(jié)凝固性壞死，其他組織病理變化不明顯。不同死亡個體組織病變也不完全相同，多數(shù)死亡動物均有肺組織病變。

3.2 血清學(xué)檢查結(jié)果

對采集到的環(huán)尾狐猴血液樣本使用MAT和ELISA進(jìn)行弓形蟲IgG抗體檢測。結(jié)果顯示，采集環(huán)尾狐猴血液樣本為弓形蟲IgG抗體陽性，其中MAT結(jié)果效價為1∶50。

3.3 PCR檢測及陽性結(jié)果測序

對提取的組織樣本DNA及血液樣本DNA進(jìn)行弓形蟲529序列進(jìn)行PCR檢測。檢測結(jié)果顯示，環(huán)尾狐猴內(nèi)臟組織樣本均為弓形蟲PCR陽性（圖1），血液樣本弓形蟲PCR檢測結(jié)果為陰性（圖2）。將陽性樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并將獲得的序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為弓形蟲的529 bp重復(fù)序列。

3.4 診斷結(jié)果

根據(jù)病史、臨床癥狀、剖檢、病理組織切片和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，確診環(huán)尾狐猴死亡個體患有弓形蟲病。

4 治療和預(yù)防

動物發(fā)病后，通過靜脈及時補(bǔ)充電解質(zhì)和能量，早期選用磺胺類和林可霉素聯(lián)合進(jìn)行治療，病情緩解后，再用磺胺類藥物進(jìn)行鞏固治療。其中，7月21日發(fā)病的環(huán)尾狐猴完全康復(fù)，但也有動物發(fā)病急，治療效果不明顯。發(fā)病高峰期，對其他猴群交替投喂磺胺類和螺旋霉素，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生消毒，加強(qiáng)滅鼠，制止流浪貓進(jìn)入動物獸舍，整體情況得到控制，但動物體內(nèi)弓形蟲包囊殺滅和清除，存在反復(fù)感染的情況。

5 轉(zhuǎn)歸與預(yù)后

目前治療弓形蟲的藥物有限，大多藥物具有毒副作用強(qiáng)的特點(diǎn)，用藥時間過長，動物機(jī)體會受到的影響比較大，需要很長時間才能消除藥物副作用帶來的影響。發(fā)病急或發(fā)現(xiàn)比較晚的病例治療效果很不理想。

6 討論

該養(yǎng)殖單位環(huán)尾狐猴感染弓形蟲的情況與國內(nèi)外資料報道的情況相似或相同，無論是臨床癥狀還是病理變化都基本吻合，且發(fā)病率和死亡率均很高[2-4]。充分說明，環(huán)尾狐猴對弓形蟲高度易感，該病對環(huán)尾狐猴種群影響非常大，提醒各動物園、萌寵樂園或其他環(huán)尾狐猴飼養(yǎng)單位，做好弓形蟲的防控任務(wù)十分緊迫。

按照當(dāng)前動物疾病治療水平，可選擇的藥物大多為磺胺類、乙胺嘧啶、螺旋霉素、林可霉素、阿奇霉素等，藥物的副作用都比較大，再加上動物體內(nèi)的弓形蟲包囊難以殺滅及清除和/或疾病分期的問題，其治療效果受限[5-6] 。今后在弓形蟲敏感低毒藥物的篩選、弓形蟲在環(huán)尾狐猴致病機(jī)理、治療方式方法、早期診斷和預(yù)防等方面加大研究力度，方可進(jìn)行有效防控。

弓形蟲?。╰oxoplasmosis）是剛地弓形蟲寄生于多種動物和人的有核細(xì)胞內(nèi)引起的一種重要的人與動物共患病。弓形蟲宿主種類廣泛，幾乎所有的溫血動物都可能成為感染弓形蟲的來源[7]。弓形蟲可寄生在除紅細(xì)胞外的幾乎所有有核細(xì)胞內(nèi)，蟲體整個生活史分為五個階段，分別是滋養(yǎng)期、包囊期、裂殖期、配子體和卵囊期。由于弓形蟲病的臨床癥狀無明顯特異性，且多呈現(xiàn)隱性感染，故依據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)難以作出診斷。目前弓形蟲病主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷，主要方法有病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)技術(shù)[8]。

病原學(xué)檢查以從病料中直接查到速殖子或卵囊為確診標(biāo)準(zhǔn)。采用直接涂片或者組織切片、動物接種和卵囊等檢查法，該檢查結(jié)果準(zhǔn)確，但由于檢出率低、耗時長，不適用于大熊貓弓形蟲病的快速檢測和流行情況調(diào)查；免疫學(xué)檢測是從血清或腦脊液內(nèi)檢測到特異性抗體是診斷弓形蟲病應(yīng)用廣泛的重要輔助手段。主要方法包括染色試驗(yàn)（sabin-Feldman dye test，DT）、間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination test，IHA）、乳膠凝集試驗(yàn)（latrx agglutination test，LAT）、間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunofluorescent assay，IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等[9]。其中IHA特異性高、假陽性率低、診斷價值高和操作簡便；ELISA具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測速度快、受檢樣本多等特點(diǎn)，有很好的推廣應(yīng)用價值。分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于弓形蟲病的檢測，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種弓形蟲病基因診斷方法，主要有LAMP、DNA探針和PCR技術(shù)等。目前用于弓形蟲檢測的探針多為特異性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探針，但其制備需要一定條件，且費(fèi)用較高，不易推廣。PCR技術(shù)自建立以來，以其靈敏、特異、高效而成為一項目前廣為應(yīng)用的診斷技術(shù)。為提高試驗(yàn)的敏感性和特異性，在PCR基礎(chǔ)上，又發(fā)展了巢式PCR（nested PCR）、PCR-ELISA和RT-PCR技術(shù)，并在弓形蟲病診斷中得以應(yīng)用[10]。

目前關(guān)于圈養(yǎng)非人靈長類動物感染弓形蟲的研究仍然知之甚少，已證實(shí)首要風(fēng)險因素是攜帶弓形蟲卵囊的貓科動物，而動物種屬、館舍開放程度和飼養(yǎng)管理等因素在不同地區(qū)的非人靈長類感染中的權(quán)重也有所差異[11]?，F(xiàn)有研究表明新世界靈長類對弓形蟲具有較高的易感性，且急性弓形蟲病易導(dǎo)致其死亡[12]。獲得性弓形蟲的常見傳播方式是經(jīng)口感染其組織包囊或卵囊，導(dǎo)致動物發(fā)病和傳播，因此，加大滅鼠工作力度，加強(qiáng)流浪貓的管控，是控制或防止弓形蟲病發(fā)生的重要手段?！?/p>

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