西門塔爾肉牛源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

摘要：為了了解承德地區(qū)西門塔爾肉牛腹瀉大腸桿菌流行情況及對常用抗菌藥物的耐藥性情況，本試驗2022—2023年從承德地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)?；鲋胁杉煌正g患有腹瀉病的西門塔爾肉牛的肛拭子樣品、糞便樣品及死亡肉牛肝臟病料樣品共計172份，對采集的病料樣品進行大腸桿菌分離鑒定，并測定分離的大腸桿菌的致病性和常用藥物的耐藥性。結(jié)果顯示，從采集172份病料組織樣品中分離得到58株致病性大腸桿菌菌株，58株致病性大腸桿菌對青霉素、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素等7種抗生素的耐藥率在44.8%以上，對其他6種抗生素具有不同程度的耐藥性。結(jié)果表明：該地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)?；鲋辛餍械拇竽c桿菌分離菌株具有致病性，對臨床中常用的抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。

關(guān)鍵詞：西門塔爾肉牛；大腸桿菌；致病性；耐藥性

相關(guān)研究表明，大腸桿菌（Escherichia coli）是動物養(yǎng)殖過程常見的致病菌之一，該菌具有多種血清型和不同的類型，可以引起牛、羊、馬、雞、鴨、豬和兔等多種動物和人類發(fā)病，該菌感染途徑比較廣泛，如消化道、呼吸道、污染的飼料和飲水及環(huán)境等多種途徑感染均可以感染多種動物和人，引起動物嚴重的腹瀉、腸炎、肺炎、腹膜炎等一系列的疾病，嚴重者可以導(dǎo)致動物死亡，給動物養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[1-2]。研究表明，近幾年來在牛、羊等動物中致病性大腸桿菌的分離率或檢出率逐年上升，該菌不僅可以引起牛、羊動物的消化道感染，個別菌株可以引起牛羊的肺炎，以犢牛和羔羊較易感，可以引起急性死亡，死亡率較高，危害著我國牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展[3-4]。大腸桿菌病可以導(dǎo)致多牛的急性敗血癥和慢性感染（腸炎、腹瀉），急性敗血癥可致死亡，慢性感染可致使動物精神萎靡、食欲減退等，嚴重影響生長和生產(chǎn)性能[5-6]。國內(nèi)相關(guān)研究表明，臨床中分離的不同動物源的致病性大腸桿菌，已經(jīng)對臨床中不同種類的抗菌藥物（β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮等）產(chǎn)生嚴重的耐藥性，且呈現(xiàn)多重耐藥性，且對臨床治療帶來一定的困難[7]。因此，在臨床中治療動物巴氏桿菌病應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗結(jié)果正確地選擇和合理使用抗菌藥物。本試驗從承德地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)?；鲋胁杉加懈篂a病的西門塔爾肉牛的病料組織樣品172份進行大腸桿菌鑒定，并檢查其致病性和耐藥性，為該地區(qū)養(yǎng)殖場中西門塔爾肉牛大腸桿菌病的防控理論支撐。

1 材料與方法

1.1 病料來源

本試驗2022—2023年從承德地區(qū)（隆化、圍場）散養(yǎng)戶和規(guī)模化牛場中不同日齡患有腹瀉病的西門塔爾肉牛的肛拭子樣品、糞便樣品及死亡肉牛肝臟病料樣品共計172份（表1）。

1.2細菌分離和培養(yǎng)

將采集的患?。ㄋ溃┪鏖T塔爾肉牛的病料組織（肛拭子、糞便及死亡肉牛肝臟）樣品用無菌PBS進行處理，在超凈工作臺中按照1∶100比例分別劃線接種于伊紅-亞甲藍培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)12～18 h后，挑取典型帶金屬光色單個菌落接種于鑒別培養(yǎng)基上（大腸桿菌顯色培養(yǎng)基）培養(yǎng)12～18 h后，挑取典型淺綠色單個菌落進行革蘭染色，顯微鏡下觀察分離菌株的形態(tài)學(xué)。

1.3 細菌生化試驗

對臨床分離的菌株接種營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期，參照細菌生化顯色全套試劑盒說明書，對臨床中分離的每一株菌株進行生化特性鑒定。

1.4 細菌PCR鑒定

取1.3中分離培養(yǎng)至對數(shù)期分離菌株的菌液進行編號，以水煮法提取基因組DNA為模板，參考文獻反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，用細菌16S rRNA通用引物（生工生物工程（上海）股份有限公司合成）進行PCR檢測[7]，取檢測陽性的分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物送測序分析，測序分析結(jié)果，參照同源性≥97%進行判定[7]。

1.5 動物攻毒試驗

取1.3中培養(yǎng)菌株菌液，調(diào)整菌液濃度為107～8CFU/mL，每1株分離菌株為攻毒組，通過灌胃攻毒方法攻毒2只小鼠（0.25 mL/只），對照組2只小鼠通過同樣的方法給予等量的無菌的PBS。攻毒組和對照組的小白鼠攻毒后，觀察攻毒組和對照組的小白鼠發(fā)病和死亡情況。

1.6 藥敏試驗

取1.3中分離培養(yǎng)至對數(shù)期分離菌株的菌液（107～8CFU/mL），在無菌條件下均勻涂布在90 mm普通營養(yǎng)瓊脂中，貼上藥敏紙片后37 ℃條件下培養(yǎng)12～18 h后，測量抑菌圈濃度，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2013年推薦藥敏試驗進行結(jié)果判斷，分析其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離和培養(yǎng)

從172份病料樣品中（肛拭子、糞便死亡肉牛肝臟）分離得到菌株，在伊紅-亞甲藍培養(yǎng)基（帶金屬光色的菌落）和大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（藍色的菌落）分別長出典型的菌落，革蘭氏染色可見典型的桿狀陰性菌形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，細菌生化顯色全套試劑盒判定結(jié)果與大腸桿菌的生化特性一致。通過統(tǒng)計，從172份病料組織中分離得到89株菌株，初步鑒定為大腸桿菌。

2.2 細菌PCR鑒定

以水煮法提取89株分離菌株的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA 通用引物進行PCR鑒定，結(jié)果顯示， 89株菌株均擴增出大約為1 429 bp目的條帶，測序結(jié)果顯示，89株分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)的大腸菌比，其同源性均大于98.9%，均可以判定為大腸桿菌。

2.3動物攻毒試驗

攻毒組的小鼠在攻毒后2～3 d出現(xiàn)不同程度的發(fā)病情況，如精神沉郁、采食量減少、扎頓和腹瀉等，個別攻毒小鼠攻毒后出現(xiàn)急性死亡。剖檢死亡的小鼠取肝臟組織分離得到大腸桿菌。致病性試驗結(jié)束，對照組未見臨床癥狀和死亡情況。通過致病性試驗統(tǒng)計58株可引起小鼠死亡的致病性大腸桿菌。

2.4藥敏試驗

臨床分離菌株的藥敏試驗顯示， 臨床分離的58株西門塔爾肉牛源致病性大腸桿菌對對青霉素、磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素等7種抗生素的耐藥率在44.8% ～100%之間；對頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星等6種抗菌藥耐藥率在10.3%～31.0%之間。

3 討論

大腸桿菌為危害多種動物常見的病原菌之一，該菌具有多種血清型，廣泛存在養(yǎng)殖環(huán)境中，可以通過多種途徑（飼料、飲水、墊料等）=可以感染多種動物、野生動物和人類，在一定條件下該菌可以通過多種途徑在不同動物之間及動物與人類之間相互傳播，對人和動物的危害較大[8]。相關(guān)研究表明，大腸桿正常情況下不會發(fā)病，當(dāng)外界環(huán)境或者有應(yīng)激因素時，當(dāng)動物機體出現(xiàn)不同程度的抵抗力下降時，可以引起牛嚴重的敗血癥、腹瀉、腸炎、脫水等一系列的臨床癥狀，甚至引起急性死亡[9]。本試驗研究表明，從采集的172份患腹瀉病西門塔爾肉牛病料組織中分離得到58株對小鼠具有致病性的大腸桿菌菌株，說明大腸桿菌可能是西門塔爾肉牛腹瀉病的主要病原菌之一，在該地區(qū)肉牛場中廣泛流行，可能存在潛在的威脅，應(yīng)該注意防控。目前，由于大腸桿菌血清型眾多，且疫苗效果不理想，抗生素成為防治該病的主要措施，隨著抗生素的濫用，導(dǎo)致其嚴重耐藥性問題[10]。本試驗結(jié)果顯示，臨床分離=致病性大腸桿菌對常用抗生素的產(chǎn)生嚴重的耐藥性。說明該地區(qū)分離的致病性大腸桿菌耐藥性嚴重。因此，應(yīng)該引起重視，合理使用抗菌藥物，減少耐藥性產(chǎn)生和定期對養(yǎng)殖環(huán)境進行消毒，并進行采取綜合性防控。本研究為該地區(qū)散養(yǎng)戶和規(guī)模化牛場中西門塔爾肉牛大腸桿菌病的防控提供研究基礎(chǔ)?！?/p>

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