田陽區(qū)仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

摘要：為了了解百色市不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中不同日齡斷奶仔豬源副豬嗜血桿菌流行情況和對臨床中常用抗生素的耐藥性情況，為臨床中仔豬源副豬嗜血桿菌防控及合理用藥提供參考依據(jù)。本研究于2022-2023年采集田陽區(qū)養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中患呼吸道疾病的斷奶仔豬鼻咽拭子及死亡仔豬胸腔積液和肺臟樣品組織287份，對采集的287份病料樣品采用細菌分離鑒定進行副豬嗜血桿菌鑒定，分別采用人工攻毒小鼠試驗和K-B藥敏紙片法檢測其分離菌株的致病性和對常用抗生素的耐藥性。結(jié)果顯示：從田陽區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中采集的217份病料樣品中分離到92株副豬嗜血桿菌（42.4%），分離的62株副豬嗜血桿菌對小鼠具有致病性（死亡率在40%～100%之間），且對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等10種抗生素的耐藥率為51.6%以上，本研究為田陽區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中仔豬副豬嗜血桿菌病的綜合防控提供參考。

關(guān)鍵詞：仔豬；副豬嗜血桿菌；分離鑒定；致病性；耐性

在豬的養(yǎng)殖過程，仔豬的呼吸道疾病是臨床中常見的疾病之一，其中細菌性因素是引起仔豬呼吸道疾病的主要因素之一，其中副豬嗜血桿菌最為常見[1-3]。仔豬副豬嗜血桿菌病主要有不同血清型的副豬嗜血桿菌（haemophilus parasuis，Hps）引起仔豬的呼吸道傳染病，該菌可以感染不同階段的仔豬，其中以4～8周玲的仔豬最易感，其死亡率高達80%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-5]。仔豬副豬嗜血桿菌主要表現(xiàn)為呼吸困難、纖維素性胸膜炎及關(guān)節(jié)炎等為主的一系列的臨床癥狀，在臨床中仔豬副豬嗜血桿菌與相關(guān)病毒性疾?。▓A環(huán)病毒、藍耳病毒及豬瘟）混合感染，不僅給臨床中相關(guān)疾病的診斷帶來一定困難，還可以導(dǎo)致其豬的死亡，具有高的感染率和死亡率[6-7]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，仔豬副豬嗜血桿菌病具有多種血清型，且有地域流行性，給仔豬副豬嗜血桿菌病疫苗制備帶來一定的困難[8]。本研究對采集田陽區(qū)不同養(yǎng)豬場中疑患呼吸道疾?。ㄋ苹几必i嗜血桿菌病）的病料組織樣品進行副豬嗜血桿菌分離鑒定，并研究其分離菌株的致病性和對臨床中常用藥物的耐藥性，為進一步指導(dǎo)田陽區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中合理使用抗生素治療仔豬副豬嗜血桿菌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2022—2023年采集田陽區(qū)養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中患呼吸道疾?。愃聘必i嗜血桿菌病臨床癥狀的）仔豬的鼻咽拭子樣品、肝臟樣品、胸腔積液樣品和肺臟樣品共計287份。

1.2 細菌分離與培養(yǎng)

將采集的各種病料組織（鼻咽拭子、肝臟、胸腔積液和肺臟等樣品）287份進行編號1～287號，并放在無菌PBS中處理（8 000 r/min離心5 min），取處理的上清液在超凈工作臺無菌中按照1：100比例分區(qū)劃線接種于副豬嗜血桿菌鑒別培養(yǎng)基（巧克力培養(yǎng)基）上，在含有5% CO2厭氧的環(huán)境中培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)12～18 h后，挑取副豬嗜血桿菌鑒別培養(yǎng)基（巧克力培養(yǎng)基）上單個典型菌落在無菌條件下接種于TSB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩（100 r/min）12～18 h后，按照革蘭氏染色試劑盒說明書進行染色和顯微鏡觀察。

1.3 生化試驗鑒定

取1.2中純化培養(yǎng)的分離菌株，參照副豬嗜血桿菌特定生化鑒定試劑盒說明書，將1.2中純化培養(yǎng)的分離菌株，加入細菌生化鑒定試劑盒37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后鑒定其生化特性。

1.4 致病性試驗

參考文獻[9-10]的方法，將分離的副豬嗜血桿菌按照1.2中方法培養(yǎng)至對數(shù)期（采用分光光度計測定），在無菌的條件下計數(shù)，并調(diào)整純化培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌濃度為108 cfu/mL，分離的副豬嗜血桿菌菌株的1株通過腹腔注射（劑量為0.25 mL/只）攻毒5只小鼠為攻毒組，未進行攻毒的5只小鼠以同樣的方法給予等量的TSB液體培養(yǎng)基，致病試驗期為7 d，在攻毒試驗期間，每天觀察2次，觀察其攻毒組和對照組的小鼠發(fā)病與死亡情況。

1.5 藥敏試驗

對分離菌株進行藥敏試驗，其操作方法參照美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）2020年推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

采集的各種病料組織（鼻咽拭子、胸腔積液和肺臟）287份經(jīng)分離培養(yǎng)結(jié)果顯示，分離的菌株在副豬嗜血桿菌鑒別培養(yǎng)基（巧克力培養(yǎng)基）上長出典型的菌落，通過TSB培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，通過革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果顯示，分離得到的菌株培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)均符合副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)。

2.2生化試驗鑒定

分離的92株分離菌株的生化鑒定結(jié)果顯示，分離的92株分離菌株的生化特性與細菌生化鑒定試劑盒說明書的副豬嗜血桿菌的生化特性一致。

2.3 致病性試驗

攻毒試驗期間，經(jīng)過觀察攻毒組小鼠和對照組的小鼠，其中攻毒組小鼠在攻毒后2～5 d出現(xiàn)死亡，個別小鼠表現(xiàn)為呼吸困難、腹圍增大等，剖檢死亡的小鼠可見肺臟出現(xiàn)了不同程度的水腫、出血，且腹腔出現(xiàn)嚴重滲出液。采集死亡小鼠的病料組織（肝臟、肺臟及心血等樣品）中分離得到了與攻毒一致的副豬嗜血桿菌，攻毒試驗結(jié)束，未攻毒組健康存活。其中62株副豬嗜血桿菌能引起小鼠死亡（40%～100%），為致病性副豬嗜血桿菌。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果由表1可知，62株副豬嗜血桿菌對青霉素、阿莫西林、氨芐西林等10種藥物的耐藥率為51.6%～91.9%，對頭孢噻呋、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星等4種藥物耐藥率為6.5%～40.3%。

3 討論

仔豬副豬嗜血桿菌廣泛存在于自然界的養(yǎng)殖環(huán)境中，當(dāng)飼養(yǎng)管理不當(dāng)如應(yīng)激（如天氣驟變、轉(zhuǎn)群、運輸）導(dǎo)致其免疫力下降引起發(fā)病，可以通過多種途徑（直接接觸傳播、空氣傳播、飼料飲水傳播等）在不同豬只之間傳播，為臨床中常見的條件致病菌之一[8-9]。副豬嗜血桿菌病可以引起豬嚴重的呼吸道感染，具有發(fā)病比較急、死亡率較迅速等特點，且在臨床中常常出現(xiàn)混合感染，尤其對仔豬的危害較大[10]。本試驗結(jié)果表明，采集的各種病料組織（鼻咽拭子、肝臟、胸腔積液和肺臟等樣品） 217份中分離到62株致病性的副豬嗜血桿菌分離菌株，其對小鼠的死亡率40%～100%。說明副豬嗜血桿菌是引起百色市不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中仔豬呼吸道感染的主要的病原菌，均為致病性菌株且均在百色市不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中流行嚴重，因此，對仔豬副豬桿菌病應(yīng)進行有效的防控，可以考慮接種多價的副豬桿菌疫苗。仔豬副豬桿菌是臨床中常見的呼吸道性細菌病之一，在豬的養(yǎng)殖過程中主要通過抗生素進行防治，目前在養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致其臨床中分離的副豬嗜血桿菌的耐藥性呈現(xiàn)日漸上升的趨勢，且出現(xiàn)嚴重的耐藥性，同時降低其治療效果[11]。藥敏試驗結(jié)果表明，62株致病性副豬嗜血桿菌對臨床中常用的10種抗生素耐藥率為51.6%以上，說明從該地區(qū)養(yǎng)豬場中分離的副豬嗜血桿菌對臨床中常用的藥物產(chǎn)生耐藥嚴重性。因此，應(yīng)該引起重視，通過藥敏試驗進行分析其耐藥性，注意抗生素的合理使用，降低其耐藥性，提高治療效果，同時應(yīng)該對養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶制定有效消毒制度，減少環(huán)境感染?！?/p>

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