不同譜系D型流感病毒HEF蛋白N-糖基化位點和B細胞表位預測分析

摘要：D型流感病毒（IDV）是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的正粘病毒科D型流感病毒屬成員，可引起牛、豬、豚鼠等多種動物的呼吸道疾病，具有潛在的人獸共患性?；贖EF基因遺傳多樣性，IDV可分為5個不同的譜系，分別是D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和 D/CA2019譜系。不同于甲型、乙型流感病毒，IDV的潛在N-糖基化位點主要集中分布在HEF基因上。為系統(tǒng)了解不同譜系毒株HEF蛋白的N-糖基化位點和B細胞表位，從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得151條全長HEF基因序列，通過使用MEGA-X生物信息學軟件構建遺傳進化樹，并用在線工具進行各毒株N-糖基化位點和線性B細胞表位預測分析。結果表明IDV的HEF蛋白具有6～8個潛在的N-糖基化位點，其中有2個N-糖基化位點（N146和N613）在不同譜系間相同，有6個N-糖基化位點（N28、N54、N249、N346、N390和N513）在不同譜系間存在差異。B細胞表位在不同譜系間有3個保守的表位和8～9個各譜系獨特的表位。線性B細胞表位的預測將有助于設計激活體液反應的多表位疫苗，預測結果還需要體外和體內(nèi)實驗證實來證明該應用的可行性。

關鍵詞：D型流感病毒；譜系；HEF蛋白；N-糖基化位點；B細胞表位；預測

正粘病毒科（Orthomyxoviridae）有四種類型的流感病毒（influenza viruses），分別命名為A、B、C和D型流感病毒（IAV、IBV、ICV和IDV）。已知IAV、IBV和ICV會導致人類呼吸道疾病[1-2]。IDV是一種新發(fā)現(xiàn)的正粘病毒科成員，最初于2011年在美國俄克拉何馬州的一頭患有嚴重呼吸道癥狀的病豬中分離出來[3]。目前已在美洲、歐洲、非洲、亞洲的多個國家和地區(qū)豬群、野豬群、牛群等檢測到該新型病毒[4-12]。IDV比IDC具有更加寬泛的宿主范圍，已在多種動物物種中檢測到，除了牛、豬和野豬外，還包括山羊、綿羊、馬、駱駝等[13-17]，在小鼠、豚鼠和雪貂中也建立了動物模型。IDV感染會導致牛的輕度呼吸道疾病，并與牛呼吸道綜合征相關[18]，對養(yǎng)牛業(yè)產(chǎn)生重大經(jīng)濟影響。

IDV的病毒基因組與ICV的基因組有約50%的相似性，與IAV和IBV相比，IDV的基因組由7條單鏈負義RNA片段組成，編碼9種蛋白質，分別是血凝素-酯酶-融合蛋白（HEF蛋白）、聚合酶PB2、PB1和P3、核蛋白、基質蛋白M1和CM2以及非結構蛋白NS1和NEP[3]。研究表明IDV的HEF蛋白具有與ICV HEF蛋白相似的受體結合、受體降解（乙酰酯酶）和膜融合等生物學功能，HEF由HEF1和HEF2兩個亞基組成，分為受體結合區(qū)（receptor binding domain，R）、酯酶活性區(qū)（esterase domain，E）以及融合活性區(qū)（fusion domain，F(xiàn)）[19]。

HEF是IDV中最易變異的基因組節(jié)段，HEF蛋白具有很好的免疫原性，主要用于該病毒的遺傳演變分析。根據(jù)HEF的序列差異，IDV可分為5個不同的遺傳演化譜系，即D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019。在歐洲和美洲，主要流行D/OK和D/660 譜系；在日本，主要流行D/Yama2016和D/Yama2019譜系[20]。此外，D/ CA2019 譜系只在美國的加利福尼亞州報道[21]。HEF蛋白是IDV的唯一糖基化蛋白，其糖基化位點的變化可能影響病毒的復制力、致病性和穩(wěn)定性等。因此，通過生物信息學方法預測分析比較IDV不同譜系HEF蛋白理化性質、結構、潛在N-糖基化位點和B細胞抗原表位，對于研究IDV復制、致病性、抗病毒藥物以及多表位疫苗研制等具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 毒株信息

從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索，共獲得151條全長的HEF基因序列（截止至2023年3月30日），具體見表1。通過使用MEGA-X軟件采用最大似然性法（maximum likelihood）進行系統(tǒng)進化分析，選擇Tamura-Nei為最適替換模型，設置自展值（bootstrap replicates）為1000，構建遺傳進化樹。

1.2 HEF蛋白理化性質與蛋白結構預測

對不同譜系D型流感病毒HEF蛋白通過在線軟件網(wǎng)站ProParam（https：//www.expasy.org/protparam），利用Expasy工具分析其基本物理和化學性質。蛋白跨膜預測使用TMHMM Server v.2.0 （https：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）工具；蛋白信號肽預測，采用SignalP4. 1 Server （http：//www.cbs.dtu dk/services/SignalP/）在線工具。

1.3 HEF蛋白N-糖基化位點預測

用N-糖基化位點在線預測軟件（https：//services.healthtech. dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）對不同譜系D型流感病毒HEF蛋白進行預測，陽性閾值定為0.5以上。

1.4 HEF蛋白線性B細胞表位預測與驗證

利用在線工具軟件ABCpred（https：//webs. iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）和 Bepipred（http//tools.iedb. org/bcell/）預測B細胞表位。ABCpred軟件預測氨基酸長度設置為18，閾值設置為0.80；Bepipred軟件預測設置閾值為0.35，肽段長度為5～30 個氨基酸。綜合分析上述兩種在線工具軟件預測結果篩選候選線性B細胞表位。

2 結果

2.1 基于HEF基因的D型流感病毒譜系劃分

GenBank中可檢索到151株完整的HEF基因序列，其中12株來源于感染豬的IDV，139株來源于感染牛的IDV?；谘仵ッ溉诤希℉EF）蛋白的核苷酸序列運用生物軟件MEGA-X分析，IDV可分為5個不同的譜系（圖1），即D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019。D/OK譜系包含的毒株最多，151株HEF基因序列中有69.54%（105/151）的毒株屬于該譜系，其次是D/660譜系為23.18%（35/151），D/OK譜系和D/660譜系流行于美洲、歐洲和亞洲地區(qū)。D/Yama2016譜系和D/CA2016譜系的毒株最少，均有3株序列，占比僅1.99%，分別流行于日本和美國地區(qū)，其他地區(qū)未見分離報道。D/Yama2019譜系里的5株流行株分別來自日本、中國和土耳其地區(qū)。11株國內(nèi)流行株分別屬于D/OK譜系和D/Yama2019譜系，其中9株屬于D/OK譜系，并與其他國家分離的毒株在遺傳進化樹上彼此分離，形成獨立的小分支。豬源的12株IDV HEF基因序列，除1株（D/swine/Kentucky/17TOSU1262/2017）屬于D/660譜系外，其余11株均屬于D/OK 譜系，由圖1可見豬源和牛源毒株聚集在一起，沒有形成獨立的分支，表明IDV在豬和牛之間可能可以相互傳播。

IDV的5個譜系 （D/OK、D/660、D/CA2019、D/Yama2016和D/Yama2019）分別用藍色、紫色、黃色、綠色和橙色標記，各譜系的代表株和中國分離株分別用紅色和亮藍色標記。

2.2 HEF蛋白理化性質與結構預測

根據(jù)ProParam分析可知，IDV各譜系HEF蛋白均由644個氨基酸組成，該蛋白相對分子質量在71575.2～71761.02之間，pI值在5.39～6.22之間，不穩(wěn)定性指數(shù)在36.42～37.56之間（>40判定為不穩(wěn)定蛋白），平均親水系數(shù)在-0.075～-0.138之間，歸為穩(wěn)定性親水蛋白。由 TMHMM 軟件和SignaIP軟件分析顯示，IDV 各譜系HEF蛋白信號肽區(qū)為1～16位氨基酸，D/OK譜系胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)序列分別位于第17～636，637～660 和 661～664 位氨基酸（圖 2），其他譜系跨膜區(qū)分別為17～644或17～640位氨基酸。

2.3 不同譜系D型流感病毒的N-糖基化位點預測分析

經(jīng)N-糖基化位點在線軟件預測（糖基化可靠性閾值大于0.5），結果如表2所示。IDV HEF蛋白有8個潛在的N-糖基化位點，分別位于N28，N54、N146，N249，N346，N390、N513和N613位點，各譜系分別具有其中的6～8個潛在N-糖基化位點。IDV各譜系毒株HEF蛋白中有2個最保守的潛在N-糖基化位點分別為N146和N613；其次是N28和N54位點均只有1株糖基化可靠性閾值小于0.5，N28位點只有D/Yama2019譜系的D/bovine/CHN/JLSL/2021糖基化可靠性閾值小于0.5，N54位點只有D/OK譜系的D/bovine/Mississippi/C00148N/2014在該位點天冬酰胺（N）突變?yōu)樘於彼幔―）而不具有潛在的N-糖基化位點；D/Yama2019和D/ CA2019 譜系所有毒株具有N249位的潛在N-糖基化，D/Yama2019譜系毒株和D/660譜系的D/bovine/France/2986/2012因在該位點的天冬酰胺（N）突變?yōu)榻z氨酸（S）而缺失了N-糖基化位點，D/OK譜系中有4株N-糖基化可靠性閾值小于0.5；D/Yama2019、D/Yama2016和D/ CA2019譜系的N346位比較保守，其N-糖基化可靠性閾值均大于0.5，D/660譜系中有1株T348突變?yōu)镮348而不具有該位點的N-糖基化，D/OK譜系中有2株N346突變?yōu)镠346而不具有該位點的N-糖基化；N390位只有D/Yama2019譜系N-糖基化可靠性閾值均大于0.5；N513位和N346位有D/Yama2019、D/Yama2016和D/ CA2019譜系N-糖基化可靠性閾值大于0.5，D/660和D/OK譜系各有1株第513位天冬酰胺（N）突變?yōu)樘於彼幔―）以及D/OK譜系中有3株N513位臨近位點有突變而不具備該位點的N-糖基化。

糖基化主要有N-X-T和N-X-S兩種形式，在IDV各譜系中8個潛在的N-糖基化位點中有6個位點（N54、N146，N249，N346，N390和N513）是N-X-T形式，N28位點只有D/Yama2016譜系是N-X-T形式，其他4個譜系均為N-X-S形式，只有N613位點在各譜系中均為N-X-S形式。IDV各譜系潛在的N-糖基化位點數(shù)量也不相同，D/Yama2016譜系最少為6個，D/OK譜系中除了6株來源于中國的毒株具有7個潛在的N-糖基化位點外都是6個，D/ CA2019和D/660譜系（其中1株D/bovine/France/2986/2012為5個）具有7個潛在的N-糖基化位點，D/Yama2019譜系除1株D/bovine/CHN/JLSL/2021外其他都有8個潛在的N-糖基化位點。

2.4 HEF蛋白B 細胞抗原表位預測

ABCpred和BepiPred在線工具軟件對HEF蛋白氨基酸序列進行分析，得到的B細胞表位序列及分值，D/OK譜系代表株（JQ922308）分別用ABCpred和BepiPred軟件分析預測結果見表3和表4，其中表中加粗部分有12個表位為ABCpred和BepiPred預測的重疊表位可認為是 D/OK譜系HEF蛋白的B細胞抗原表位，每個潛在的表位都高于2個軟件包設置的閾值，具有合適的長度和較高的抗原性。用同樣的方法獲得了其他4個譜系HEF蛋白的B細胞抗原表位（表5）。256FGCGD260、278NRVAA291和404YTKGETPFVK DYLSPP415這3個保守的B細胞抗原表位為IDV 的5個不同譜系共有；42YSMKTEPMTGF TNVTK57和302PGTYSI- KS309為 D/OK、D/Yama2019、D/Yama2016和D/CA2019這4個譜系共有，479GYFWGRSNGGGGGA492為D/660、D/Yama2019、D/Yama2016和D/CA2019這4個譜系共有。

3 討論

IDV最早發(fā)現(xiàn)于有流感樣病征的美國豬群，進一步的研究表明IDV在牛群中比在豬群中更普遍，這種病毒可能利用牛作為主要宿主，并與牛的呼吸道綜合征密切相關[18]。在我國，IDV最早于2014年在山東的養(yǎng)牛場被發(fā)現(xiàn)[22]，隨后研究人員在南方一些省份（廣東、江蘇、安徽和福建）的牛群或豬群中檢測到該病毒[23-24]，這些毒株均屬于D/OK譜系。2021年10月—2022年2月從中國廣州市各地屠宰場采集的250份健康牛鼻拭子樣本中鑒定出一株（D/bovine/CHN/JY3001/2021）屬于D/Yama2019譜系的毒株，結果表明國內(nèi)牛群中存在D/OK譜系和D/Yama2019譜系IDV毒株[25]。

IAV熱穩(wěn)定性和耐酸能力對其跨種傳播能力具有重要作用。Yu等[26]通過反向遺傳學研究表明HEF蛋白對IDV的熱穩(wěn)定性和耐酸能力起到關鍵作用，發(fā)現(xiàn)IDV較IAV、IBV和ICV具有較強的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，因此推測IDV具有較廣泛的組織嗜性和宿主感染性。本研究對5個不同譜系的IDV HEF糖蛋白經(jīng)N-糖基化位點相關軟件預測，最早發(fā)現(xiàn)的IDV毒株D/Swine/Oklahoma/1334/2011屬于D/OK譜系，其HEF蛋白含有6個潛在的N-糖基化位點（N28，N54，N146，N346，N513，N613），日本流行的D/Yama2016譜系毒株一樣只有6個潛在的N-糖基化位點；隨著新的IDV譜系的發(fā)現(xiàn)，其潛在的N-糖基化位點也增多，D/660、D/ CA2019 和D/Yama2019譜系增加到7個，潛在的N390位N-糖基化位點為D/Yama2019譜系內(nèi)毒株所特有，D/Yama2019譜系部分毒株甚至具有8個潛在的N-糖基化位點。潛在的N-糖基化位點增加可能進一步增強IDV毒株的熱穩(wěn)定性和耐酸能力，引起其免疫原性、組織嗜性、致病性以及宿主范圍等發(fā)生變化。

抗原表位預測在疫病疫苗設計和基礎科學研究中具有重大意義，在疫苗研究中使用生物信息學分析蛋白結構和預測表位成為大多數(shù)實驗室的首選方案，獲得的預測結果比常規(guī)試驗更加準確和高效?；谌斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡的B細胞表位數(shù)預測的ABCpred和B細胞表面積預測IEDB[27]具有較高的抗原表位預測精度而成為最常用的2個預測工具。Wang等[28]采用ABCpred、IEDB和LBtope預測了24株ADV HE蛋白的B細胞抗原表位獲得了5個保守的抗原表位。本研究預測的HEF蛋白B 細胞抗原表位均位于胞外區(qū)，在5個不同譜系中預測各獲得11～12個抗原表位，其中有3個抗原表位是5個譜系的保守抗原表位，還有3個抗原表位是其中4個譜系的保守抗原表位。預測的抗原表位為選擇合適肽段設計和制備多表位疫苗提供了理論依據(jù)，但仍需試驗進行驗證其免疫原性和免疫保護效果。

IDV在世界范圍內(nèi)的家畜（如牛和豬）中傳播，擴散到包括豬在內(nèi)的其他哺乳動物宿主。研究顯示，人血清中也有D型流感病毒的特異性抗體，尤其是牛場工作人員血清陽轉率非常高，這表明IDV存在感染人的風險[29]。因此，需要對IDV流行病學進行持續(xù)調查，尤其是人群中IDV流行情況，同時對其診斷方法、遺傳進化規(guī)律、致病機制以及疫苗研發(fā)等相關問題進一步研究。■

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