9味中藥及中藥聯(lián)用對奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果

摘要：金黃色葡萄球菌是一種主要的食源性病原體，該菌也是造成反芻動物乳房炎的主要致病菌。而奶牛乳房炎極大地影響著奶牛的健康以及乳制品質(zhì)量，從而影響到畜牧業(yè)的發(fā)展。因此選擇合適的方式治療和預(yù)防奶牛乳房炎是至關(guān)重要的。本研究共納入了9味中藥，旨在選擇出最高效的抑制致病菌的中藥及中藥復(fù)方來改善奶牛乳房炎多發(fā)以及難以治療的現(xiàn)狀。試驗結(jié)果顯示金銀花、訶子、蒲公英、甘草及其中藥復(fù)方在體外抑菌試驗中對金黃色葡萄球菌的抑制效果較為理想。本研究為中藥療奶牛乳房炎方面提供了新的證據(jù)。中藥及中藥復(fù)方有望為治療奶牛乳房炎提供新的有意義的研究方向。

關(guān)鍵詞：中藥；體外抑菌試驗；奶牛乳房炎；金黃色葡萄球菌

我國為奶牛養(yǎng)殖大國，然而奶牛乳房炎一直困擾著養(yǎng)殖場。奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖過程中一種常見且多發(fā)的奶牛疾病，其發(fā)病率高并且不僅影響奶牛的產(chǎn)奶量還會導(dǎo)致奶制品質(zhì)量下降，此外后續(xù)還會持續(xù)影響奶牛產(chǎn)奶后的發(fā)情周期，可能會導(dǎo)致奶牛的乳房出現(xiàn)永久性的損傷，造成損失[1]。奶牛乳房炎因其常見性和多發(fā)性嚴(yán)重影響我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展。

細(xì)菌感染是造成奶牛乳房炎的主要原因。根據(jù)先前的報道可知引起奶牛乳房炎的最主要的病原微生物是金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生毒素和酶類物質(zhì)，導(dǎo)致乳腺組織炎癥反應(yīng)，因此其會引起奶牛乳房慢性感染并且金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素會對奶牛乳房造成不可逆的損傷，嚴(yán)重影響產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)[2]。因此，研究金黃色葡萄球菌在奶牛乳房炎中的發(fā)病作用并探索對其有效的抗菌藥物對于改善奶牛乳房炎的多發(fā)病現(xiàn)狀是十分重要的。

中藥作為中國傳統(tǒng)醫(yī)藥理論指導(dǎo)采集、炮制的藥物在各方面都發(fā)揮著重要作用[3]。 中藥具有來源廣泛、不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小、無殘留的特點，并且還可以作為潛在的抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于畜禽的疾病防控和治療中[4]。本研究探究了9味常見的中草藥以及其復(fù)方，采用體外試驗的方法探究中藥及其復(fù)方是否對藥物病原菌金黃色葡萄球菌產(chǎn)生體外抑制反應(yīng)。本研究旨在篩選更高效的抑菌中藥來防止奶牛乳房炎，并對奶牛乳房炎的預(yù)防和治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1）試驗菌株。本研究試驗樣品來自青島市某養(yǎng)殖場患有乳房炎奶牛的奶樣，采樣后分離出金黃色葡萄球菌。

2）主要培養(yǎng)基與中藥樣品。本研究選擇金銀花、訶子、蒲公英、甘草、沙參、山藥、黃連、艾葉、白芷等9味常見中藥。上述中藥均購自青島晟和醫(yī)藥中藥店（杏林堂店）；本實驗用培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技中國有限公司。

3）試驗儀器。DNP-9162-1A電熱恒溫培養(yǎng)箱（常州潤華電器有限公司）；電子天平 XPR226DR/AC（梅特勒托利多科技（中國））；實驗室冰箱283（廣州傲雪制冷設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

1）制備中藥液。取試驗所需的9味中藥每種80 g，分別加入1 000 mL超純水浸泡1 h使其有效成分析出，隨后加熱煮沸再小火慢煮至80 mL，過濾取中藥清液，將濾渣再加超純水至800 mL，重復(fù)煎煮至80 mL，取中藥清液。將兩份清液樣品混合后離心，取上清液繼續(xù)煎煮至80 mL，再進行高溫滅菌處理。將中藥樣品液放置恒溫4 ℃的醫(yī)用冰箱冷藏備用。

2）金黃色葡萄球菌懸液制備。將冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株在營養(yǎng)瓊脂上劃線復(fù)活并使其處于37 ℃環(huán)境溫度下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后將金黃色葡萄球菌菌落接種到7.5%氯化鈉肉湯中。將菌液接種到Baird-Parker培養(yǎng)基上，37 ℃至長出金黃色葡萄球菌菌落呈圓形，表面光滑，濕潤，菌落直徑為2～3 mm，細(xì)菌排列呈葡萄球狀顏色呈深灰黑色，有淺色邊緣。將菌液稀釋至3.0×108 CFU/mL，留存?zhèn)溆谩?/p>

3）抑菌試驗。使用牛津杯法進行抑菌試驗，通過在牛津杯周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈[5]。抑菌圈的判定為：抑菌圈直徑大于20 mm為極度敏感（++++）；抑菌圈直徑在20～15 mm之間為高度敏感（+++）；抑菌圈直徑在15～10 mm之間為高度敏感（++）；抑菌圈直徑小于10 mm為低度敏感（+）；無抑菌圈為不敏感（-）[6]。

4）測定最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）。在抑菌圈的邊緣處，瓊脂培養(yǎng)基中所含抑菌物質(zhì)的濃度即為該菌懸液對該種指示菌的MIC。 MBC是指能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)99.9%以上測試細(xì)菌菌量的最低濃度。本研究采用試管稀釋法測定所測樣品組的MIC及MBC。本研究所有測量性試驗均重復(fù)三次。

5）測定雙聯(lián)中藥復(fù)方抑菌濃度（FIC）。根據(jù)尹光美等[7]的研究方法，本研究使用棋盤稀釋法進行聯(lián)合抑菌定量法，計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)：FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。

判別標(biāo)準(zhǔn)為：協(xié)調(diào)作用（FIC<0.5）；相加作用（0.5<FIC<1）；無關(guān)作用（1<FIC<2），拮抗作用（FIC>2）。

2 結(jié)果分析

2.1 9味中藥對金黃色葡萄球菌的體外抑菌程度

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果如表1所示，可知9味中藥對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了不同的抑菌效果。其中7味對金黃色葡萄球菌有抑菌效果，而沙參和山藥對金黃色葡萄球菌不產(chǎn)生抑菌效果。在7味有效抑菌的中藥中，金銀花、訶子的抑菌等級為極度敏感，蒲公英、甘草的抑菌等級為高度敏感，黃連次之抑菌等級為中度敏感，而艾葉白芷抑菌等級為低度敏感。

2.2 MIC和MBC的測定

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示，訶子和金銀花在抑金黃色葡萄球菌方面表現(xiàn)最佳，其中金銀花和訶子的MIC為7.813 mg/mL，MBC為15.625 mg/ mL，蒲公英和甘草的MIC為15.625 mg/mL，MBC為31.250 mg/ mL；黃連、艾葉以及白芷在抑金黃色葡萄球菌方面表現(xiàn)不佳，其中黃連的MIC為125.000 mg/mL，MBC為250.000 mg/ mL；艾葉和白芷的MIC為250.000 mg/mL，MBC為500.000 mg/ mL。因此，根據(jù)以上試驗結(jié)果對于抗金黃色葡萄球菌效果來說，訶子和金銀花效果更好。

2.3 中藥復(fù)方FIC指數(shù)測定

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果如表3所示，結(jié)果顯示不同種類的雙聯(lián)中藥復(fù)方的MIC和FIC不同。其中蒲公英+金銀花、蒲公英+訶子、訶子+金銀花的相關(guān)作用均為相加。而金銀花+甘草、蒲公英+甘草、訶子+甘草的相關(guān)作用為無關(guān)。不過與單一中藥相比雙聯(lián)中藥復(fù)方的MIC值均有下降。且抑菌圈直徑與藥物對測試菌的最低抑菌濃度呈負(fù)相關(guān)，即MIC愈小，抑菌圈愈大，抑菌效果越好。因此，選擇合適的中藥進行聯(lián)合復(fù)方使用對金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種強大的細(xì)菌，可導(dǎo)致人類和動物的嚴(yán)重疾病甚至死亡。此外，它是牛、奶牛、羊和山羊乳房炎的主要原因之一，其可以對奶牛的乳房組織造成不可逆的損傷，并且導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量大幅下降，給乳制品行業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟損失[8]。金黃色葡萄球菌外毒素在包括乳腺炎在內(nèi)的感染中發(fā)揮作用，治療主要依靠抗生素如青霉素，氨芐西林鈉和苯唑西林鈉。根據(jù)沈冬梅等[9]的試驗結(jié)果表明，氨基糖苷類、氯霉素類藥物對于金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用，青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物在治療奶牛乳房炎方面應(yīng)用得較多，我國優(yōu)先選擇抗生素類藥物治療奶牛乳房炎，但是長期使用抗菌藥會使致病菌產(chǎn)生耐藥性難以提高治療效果，此外乳汁中的抗生素殘留也難以攻克。這極大地影響了奶牛的乳汁質(zhì)量并造成經(jīng)濟損失。

中藥來源于植物、動物和礦物中提取的天然產(chǎn)物和提取物，具有維持健康和治療疾病的有效生物功能。幾十年來，它在全球范圍內(nèi)廣泛使用[10]。早在東漢時期，中醫(yī)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載了中醫(yī)在治病方面的應(yīng)用。中藥藥理學(xué)研究表明，中藥以及其提取物可以有效改變細(xì)胞中細(xì)胞膜的通透性從而改變細(xì)菌細(xì)胞壁的生理性質(zhì)，從而可以通過改變蛋白質(zhì)合成以及DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程來發(fā)揮藥理作用[11]。

本試驗共納入金銀花、訶子、蒲公英、甘草、黃連、艾葉、連翹、沙參、山藥共9味中藥，其中金銀花、訶子、蒲公英、甘草、黃連、艾葉、連翹，均表現(xiàn)出了對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，并且金銀花、訶子、蒲公英、甘草抑菌效果突出，表現(xiàn)出了極度敏感的抑菌效果，MIC 結(jié)果為7.813～15.625 mg/mL，MBC 結(jié)果為15.625～31.25 mg/mL。查閱文獻可知金銀花、訶子、蒲公英、甘草均為抗菌抗炎效果極好的中草藥。其中金銀花具有廣譜的抗病毒、抗菌效果，能抑制多種病原微生物的生長。金銀花的有效抗菌成分為綠原酸和異綠原酸為主，其可以改變致病菌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁生理特性從而抑制細(xì)菌的代謝酶活性[12]。訶子含有的訶子鞣質(zhì)可以對生物膜產(chǎn)生影響[13]。蒲公英抑菌作用與黃酮類、酚酸類、多糖有關(guān)，其抑菌機制為可以破壞細(xì)胞膜的完整性，從而致使金屬離子、蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)滲出，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，起到抑菌作用[14]。類似的甘草中也含有黃酮類化合物以及多糖，從而也可以通過影響細(xì)胞膜以及細(xì)胞壁的生物活性發(fā)揮抑菌的效果[15]。

因此，中藥抗菌研究有很大發(fā)展空間以及前景。但也有些問題需要注意，首先中藥作為中華文明五千年的結(jié)晶，其種類繁多，成分復(fù)雜，還有很多成分尚未探索透徹，因此在進行中藥聯(lián)合治療時要特別注意不同的中藥復(fù)方是否會產(chǎn)生毒性成分從而造成損失；其次，人們對中藥及其中藥復(fù)方生理層面以及分子層面的了解知之甚少，因此在后續(xù)的研究中可以更多地對中藥分子層面發(fā)揮作用影響進行討論；再次，不同的中藥其有效成分不同，因此其有效成分的提取方式、提取溫度、保存條件也不同，要注意不同中藥的有效成分的提取工藝；最后，為了更高效地對中藥進行研究，建議在選擇中藥時先查閱相關(guān)資料參考中藥的藥用價值，以做到優(yōu)選更合適的中藥作為試驗對象。

4 結(jié)論

本研究試驗結(jié)果顯示中藥可以有效地對造成奶牛乳房炎的致病菌金黃色葡萄球菌產(chǎn)生體外抑制作用。此外，通過試驗結(jié)果可知適宜的中藥組方聯(lián)用的MIC數(shù)值更小，說明相比于單一的中藥有更好的抑菌效果。

中藥治療奶牛乳房炎可以很好地改善致病菌耐藥性以及乳汁中抗生素殘留問題，并且一些中藥可以作為飼料添加使用來預(yù)防疾病，因此更多地篩選出高效的中藥來治療奶牛乳房炎對我國的畜牧業(yè)蓬勃發(fā)展是有重大意義的。希望后續(xù)的研究中可以盡快地篩選出更多而有效的中藥及中藥聯(lián)用來改善奶牛乳房炎高發(fā)、難治療的現(xiàn)狀?！?/p>

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