柴芍口服液對肉雞霉變飼料造成肝損傷的保護效果研究

摘要：為了研究新獸藥柴芍口服液對肉雞肝臟保護的效果，試驗采用霉變飼料建立肉雞肝損傷模型，分別用不同劑量的柴芍口服液對肝損傷肉雞進行治療，觀察用藥后的臨床表現(xiàn)，計算總有效率，測定各組肉雞血清中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、膽堿酯酶（CHE）活性及增重情況。結果表明：霉變的飼料可以造成肉雞肝臟損傷，死淘率增加，血清中AST、ALT、ALP活性極顯著升高（P<0.01）， CHE活性極顯著降低（P<0.01）；在飲水中添加2.5 mL/L的柴芍口服液，能夠降低霉變飼料造成的死淘率，顯著抑制霉變飼料造成的血清中AST、ALT、ALP活性的升高（P<0.05），顯著提高血清CHE的活性（P<0.05），促進肝損傷模型肉雞的增重（P<0.05）。說明柴芍口服液對霉變飼料造成的肉雞肝損傷具有很好的治療效果。

關鍵詞：柴芍口服液；肉雞；霉變飼料；肝損傷；生化指標

柴芍口服液是在張仲景的《傷寒論》中的傳統(tǒng)方劑四逆散的基礎上，經(jīng)提取等工藝制得的口服溶液劑，由柴胡、白芍、枳實、甘草組成，柴胡疏解肝郁，使陽氣透達肌表，用為君藥；芍藥養(yǎng)血斂陰，與柴胡相配，一升一斂，使郁熱透解而不傷陰，為臣藥；佐以枳實行氣散結，以增強疏暢氣機之效；炙甘草緩急和中，又能調和諸藥為使，共同起到透解郁熱、調和肝脾的作用。張會梅等[1]考察了柴芍口服液對CCl4造成雞肝損傷的防治效果及推薦用量，發(fā)現(xiàn)飲水中添加0.5%、1%的柴芍口服液，能明顯緩解CCl4對實驗雞的肝損傷。根據(jù)文獻報道高水平的霉菌毒素含量，家禽會有不同程度的霉菌毒素中毒癥狀[2-4]，因此，本研究通過飼喂霉變飼料建立肉雞肝損傷模型，在模型肉雞的飲水中添加不同劑量的柴芍口服液，評估不同劑量的柴芍口服液對肉雞因霉變飼料造成肝損傷的保護效果。

1 材料與方法

1）藥品與試劑：柴芍口服液，每1 mL相當于原生藥1 g，生產(chǎn)批號20200702，由濰坊諾達藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。肝膽顆粒，每1 g相當于原生藥3 g，生產(chǎn)批號20200401，由菏澤普恩藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。試驗用飼料為雛雞全價配合飼料，購自青州通慧飼料有限公司。黃曲霉毒素B1（AFB1） ELISA試劑盒、T-2毒素（trichothecenes，T-2）ELISA試劑盒、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）ELISA試劑盒，均購自上海滬崢生物科技有限公司。谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）與膽堿酯酶（CHE）活性檢測試劑盒，均購自南京建成生物技術有限公司。

2）主要儀器：BK-200全自動生化分析儀，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。電子天平，北京賽多利斯儀器設備有限公司。

3）試驗動物：1日齡AA+商品代健康雌性雛雞，體重（45±3）g，350只，購自山東益生種禽有限公司。

4）試驗方法

①自制霉變飼料。將肉雞全價飼料50 kg，放置在自建固體發(fā)酵間內，控制濕度在60%～70%之間，溫度在30～35 ℃之間，進行高溫高濕處理5 d[5]，使用前取樣，采用ELISA試劑盒檢測霉菌毒素含量。

②霉變飼料造成肉雞肝損傷模型的建立。1日齡AA+肉雛雞，飼養(yǎng)至8日齡，隨機選擇320只健康雞分為2個組，A組40只，B組280只，A組為對照組，飼喂全價飼料，B組為模型組，飼喂自制的霉變飼料，連續(xù)數(shù)日，至B組累計死淘達5%以上時換用正常飼料。從A組和B組中分別隨機取5只存活試驗雞，翅下靜脈采血，分離血清，檢測血清中AST、ALT、ALP、CHE活性水平；比較對照組與模型組雞群的精神狀況、采食量、死淘率以及剖檢肝臟變化，綜合判斷試驗雞群是否出現(xiàn)霉變飼料造成的肝損傷問題。

③分組與給藥。待B組（280只）的雞群出現(xiàn)霉菌毒素肝損傷的表現(xiàn)，且死亡率超過5%時，隨機從B組雞群中選擇有臨床癥狀，且體重相近的試驗雞125只，隨機分為5組，每組25只，分別為第2組模型對照組、第3組柴芍口服液低劑量組、第4組柴芍口服液中劑量組、第5組柴芍口服液高劑量組、第6組肝膽顆粒藥物對照組，另從A組中挑選體重相近的健康肉雞25只，將其編為第1組空白對照組。在分組完成后，第1、2組飲水中不添加藥物，在第3～5組飲水中分別按照1、2.5和5 mL/L的劑量添加柴芍口服液，按照全天飲水量計算用量，集中添加到3～4 h的飲水中，并給第6組試驗雞飲水中按照每升水添加1 g對照藥物肝膽顆粒。試驗期共7 d，試驗期間所有試驗雞飼喂正常全價飼料。

④臨床表現(xiàn)及體重變化。試驗期間觀察記錄肉雞采食、飲水、精神狀況、糞便情況，治療試驗開始前后分別逐只稱重。

⑤血液生化指標變化。在分組治療7 d后，每組試驗雞隨機取5只，翅下靜脈采血，分離血清，采用試劑盒檢測血清中AST、ALT、ALP、CHE活性水平。

⑥解剖病理變化。試驗結束后，每組隨機取5只進行解剖，觀察試驗雞肝臟病變情況。

⑦總有效率計算。在試驗結束時，觀察試驗雞臨床表現(xiàn)，并統(tǒng)計各組肉雞的死亡率、治愈率、有效率、無效率，且經(jīng)卡方檢驗統(tǒng)計總有效率[6]。死亡率：病死雞剖解出現(xiàn)典型霉變飼料肝損傷，主見：肝邊緣變薄，壞死，表面見有褐紫色或淡黃色、灰黃色壞死灶等，并根據(jù)死亡數(shù)量計算死亡率。治愈率：發(fā)病肉雞經(jīng)給藥治療后精神、采食量、糞便等均恢復正常屬治愈，并根據(jù)治愈數(shù)量計算治愈率。有效率：經(jīng)給藥治療后，相關臨床癥狀有明顯減輕，僅表現(xiàn)出精神稍差，采食、飲水基本恢復正常，即判斷為有效，并根據(jù)其數(shù)量計算有效率。無效率：在試驗期間，經(jīng)給藥治療后，其臨床癥狀未見明顯改善，主要表現(xiàn)：精神不振、羽毛松亂、拉稀糞，判斷為無效，并根據(jù)其數(shù)量計算無效率?？傆行?治愈率+有效率，在卡方檢驗中采用總有效率進行檢驗（用X2與P值表示）。

⑧統(tǒng)計分析。采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與處理，總有效率進行卡方檢驗分析，對各組肉雞血清中AST、ALT、ALP、CHE活性水平、肉雞增重情況進行方差分析， P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 霉變飼料中毒性肝損傷模型結果

1）霉變飼料中相關毒素含量檢測。將霉變的飼料干燥后，混合均勻，取少量，采用AFB1、T-2、ZEN的ELISA試劑盒檢測含量（見表1），結果顯示，試驗用霉變飼料中AFB1、ZEN、T-2三種菌毒素含量均超標。其中，AFB1含量82.78 μ g/kg，超過飼料中允許的最高限量8倍多；ZEN含量為956.51 μ g/kg，接近超過飼料中最高限量的1倍；T-2毒素含量為1 082.65 μ g/kg，超過飼料中允許的最高限量的1倍多。

2）肉雞霉變飼料造成肝損傷模型的建立。在建模過程中，A組肉雞均表現(xiàn)健康。B組喂霉變飼料4 d后，有少數(shù)肉雞精神狀況變差、采食大幅下降；5 d后出現(xiàn)5只肉雞死亡；7 d后出現(xiàn)較明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)：精神沉郁、呆立，腹瀉，采食量與飲水量下降，B組累計死亡21只。分別從A組和B組h0h/EWW5QfV/xvNbZigf4m4dsfoAjaedTZejMH09jKo=挑選存活的試驗雞5只，解剖觀察對比肝臟變化（圖1、2），可見肝損傷模型肉雞的肝臟邊緣變薄，發(fā)黃，表面有出血點。結果表明，肝損傷模型組的肉雞肝臟符合霉變飼料造成肉雞肝損傷的特征。在飼喂霉變飼料的第7天，從A、B組分別隨機挑選5只，采血檢測相關血液生化指標，結果見表2，B組造模肉雞AST、ALT、ALP活性均極顯著高于空白對照組A組（P<0.01），且B組肉雞CHE活性極顯著低于A組（P<0.01）。試驗結果表明，建模組B組試驗雞肝臟功能受損明顯，符合霉變飼料造成肉雞肝損傷的特征。

2.2 柴芍口服液對肝損傷肉雞的治療效果

1）柴芍口服液對肝損傷肉雞臨床癥狀的總有效率的影響。肉雞在停止飼喂霉變飼料后，其臨床癥狀均有所好轉，經(jīng)不同劑量柴芍口服液、肝膽顆粒治療的試驗雞臨床癥狀整體改善情況優(yōu)于模型對照組?？傆行试囼灲Y果顯示（見表3），第3～6組試驗雞死亡率均明顯低于第2組，且第3～6組試驗雞的治愈率均明顯高于第2組。經(jīng)卡方檢驗，第3、6組總有效率高于第2組，但是差異不顯著，第4、5組總有效率顯著高于第2組 ，差異顯著（P<0.05）。結果表明，柴芍口服液能顯著改善試驗雞霉變飼料造成肝損傷的臨床癥狀，降低死亡率，在每升飲水中分別添加2.5 和5 mL柴芍口服液時治療效果最明顯，優(yōu)于對照藥物肝膽顆粒。

2）柴芍口服液對肝損傷肉雞肝臟剖解變化的影響。解剖發(fā)現(xiàn)：空白對照組為健康的肉雞，肝臟呈棕紅色，富有彈性（圖3）；模型對照組的肉雞肝臟呈淡黃色，表面大量出血點，易碎（圖4）；柴芍口服液低劑量組的肉雞肝臟呈土黃色，腫大（圖5）；柴芍口服液中劑量組的肉雞肝臟呈淺黃色，少量出血點（圖6）；柴芍口服液高劑量組的肉雞肝臟呈暗紅色，略帶少量黃色病變（圖7）；肝膽顆粒組的肉雞肝臟呈淡黃色，少量出血點（圖8）。結果表明，柴芍口服液能夠降低霉變飼料造成的雞肝臟的損傷，減輕肝臟出血、發(fā)黃等病變，在每升飲水中分別添加2.5 和5 mL柴芍口服液的效果最顯著，且優(yōu)于對照獸藥肝膽顆粒。

3）柴芍口服液對肝損傷肉雞血液生化指標的影響。試驗結果顯示（見表4），與空白陽性對照第2組比較，經(jīng)藥物治療7 d的第3～6組試驗肉雞相關肝功能血液生化水平均顯著提高，第3～6組試驗雞AST、ALT、ALP活性均明顯低于第2組（P<0.05），第3～6組試驗雞CHE活性極顯著高于空白對照第2組（P<0.05）。其中第4、5組試驗雞生化指標改善情況最佳，優(yōu)于第3、6組，且第6組優(yōu)于第3組。試驗結果表明，柴芍口服液能顯著改善霉變飼料造成的雞肝功能相關血液生化指標，在每升飲水中分別添加2.5 和5 mL柴口服液的效果最顯著，且優(yōu)于對照獸藥肝膽顆粒。

4）柴芍口服液對肝損傷的肉雞增重的影響。試驗結果顯示（見表5），在治療之前，第2～6組試驗雞體重無顯著差異，對比試驗結果可見，經(jīng)藥物治療7天的第3～6組試驗雞體重均有顯著改善，3～6組試驗雞體重顯著高于第2組（P<0.05），但均顯著低于空白對照第1組（P<0.05），第4、5組試驗雞體重改善情況最佳，優(yōu)于第3、6組，且第5組優(yōu)于第6組，第6組優(yōu)于第3組。試驗結果表明，柴芍口服液能顯著改善霉菌毒素中毒造成的生長遲緩問題，增加試驗雞體重，在每升飲水中添加2.5 和5 mL的柴芍口服液時，效果最顯著，優(yōu)于對照獸藥肝膽顆粒。

3 討論

1）試驗雞中毒性肝損傷模型探討。飼料及原料在生產(chǎn)、儲存過程中不可避免發(fā)生霉變，特別是在降雨較多的季節(jié)，主要產(chǎn)生黃曲霉毒素B1（AFB1），其次是玉米赤霉烯酮（ZEN）、嘔吐毒素（DON）、T-2毒素等，其檢出率在70%以上，且有5%左右的樣品相關毒素含量超過飼料衛(wèi)生標準的要求[7]，危害嚴重。霉菌毒素特別是AFB1和T-2毒素對肝臟損傷較重，當毒素進入機體后，需要在肝臟等器官中進行代謝，解毒，損傷肝細胞[8]。ALT主要存在于肝細胞的胞質中，是肝損傷的一個很靈敏的指標，而AST廣泛存在于機體組織中，因此，當ALT、AST這兩種血清轉氨酶活性同時升高，在一定程度上可體現(xiàn)肝細胞的損害程度，另外，血清ALP、CHE活性變化也可衡量肝功能的變化[9]。在本試驗的試驗雞霉變飼料中毒性肝損傷的建模過程中，試驗雞血清AST、ALT、ALP 活性均顯著上升（P<0.05），且血清CHE活性顯著下降（P<0.05）。自制霉變飼料檢測結果顯示，AFB1、T-2、ZEN三種霉菌毒素均嚴重超標。再結合飼喂霉變飼料后，試驗雞群表現(xiàn)精神萎靡、羽毛蓬亂、縮頭閉眼、呆立，采食量與飲水量顯著下降，拉白色稀糞，生長速度下降，并出現(xiàn)死淘。解剖可見肝邊緣變薄，壞死，表面有黃色、紫色的壞死灶及壞死點等病變。與王素芳等[10]報道的臨床癥狀一致。因此，從臨床表現(xiàn)、病理解剖、血清生化以及飼料霉菌毒素檢測結果分析，采用霉變飼料建造的肉雞肝損傷模型是成功的。

2）柴芍口服液對霉變飼料造成肉雞肝損傷的治療效果。柴芍口服液是四逆散的改進型產(chǎn)品，據(jù)研究四逆散對肝損傷具有保護作用，彭漢光等[11]研究表明，加味四逆散具有防治四氯化碳、D-氨基半乳糖所致急性肝損傷作用。王鶴[12]采用系統(tǒng)藥理學的方法，闡述了四逆散80個活性成分與91個治療靶點互相作用，直接或間接地通過相互作用的方式參與慢性肝炎的治療。宋琳等[13]的研究表明四逆散可通過糾正脂代謝紊亂、改善胰島素抵抗、保護肝細胞等途徑，對非酒精性脂肪性肝炎發(fā)揮治療作用。屈倩等[14]研究發(fā)現(xiàn)與四逆散相同組方的保肝湯對海南文昌雞的霉菌中毒具有明顯的臨床療效。柴芍口服液能顯著改善霉變飼料導致肉雞肝損傷的癥狀，降低肉雞死亡率，在每升飲水中分別添加2.5 和5 mL柴芍口服液均能顯著提高霉變飼料引起肝損傷治療的有效率，柴芍口服液能顯著降低試驗雞血清AST活性、ALT活性、ALP活性，并顯著升高血清CHE活性，柴芍口服液能顯著促進肉雞生長，增加雞體重。

3）綜上所述，柴芍口服液在治療霉變飼料導致的肉雞肝損傷方面具有顯著療效，按照每升飲水中分別添加2.5 和5 mL的柴芍口服液，連續(xù)使用7 d，可達到治療霉變飼料造成肝損傷的目的?！?/p>

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