基于KAPPA統(tǒng)計量評價奶牛布魯氏菌病不同血清學(xué)檢測方法的比較研究

摘要：本研究采用虎紅平板凝集試驗（RBT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗（MRT）、試管凝聚試驗（SAT）、免疫膠體金層析法（GICA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）檢測方法對327份奶牛血清和327份全乳進(jìn)行奶牛布魯氏菌病檢測，以SAT為金標(biāo)準(zhǔn)，基于Kappa統(tǒng)計量評價不同檢測方法的靈敏度、特異度、符合率、一致性等相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，cELISA靈敏度、特異度、符合率、Kappa值最高，分別為100.00%、99.37%、99.39%、0.898，MRT各項指標(biāo)最差，但符合率在95%以上。研究表明5種檢測方法在靈敏度、特異度等方面各有優(yōu)缺點，但對于奶牛布魯氏桿菌病檢測均有重要應(yīng)用推廣價值。因此，要結(jié)合檢測需要采取多種方法綜合運用，以提高檢測準(zhǔn)確性，建議采用MRT、RBT和GICA初步篩選，對疑似患病奶牛再運用cELISA、SAT確診。研究為奶牛布魯氏桿菌病檢測方法應(yīng)用和凈化提供了技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：布魯氏桿菌?。谎鍖W(xué)；檢測；Kappa

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種可威脅公共衛(wèi)生安全和食品安全的嚴(yán)重人畜共患傳染病[1]。動物感染布魯氏菌后呈現(xiàn)急性或慢性經(jīng)過，通常表現(xiàn)母畜繁殖障礙和乳腺炎、公畜睪丸炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。人感染布魯氏菌病會引起流感樣癥候群及長期虛弱，嚴(yán)重危害人類健康和食品衛(wèi)生安全，是世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）列為法定通報的疾病，被我國列為二類動物傳染病[2-3]。

奶牛布魯氏菌病是奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中重點防控的疫病。加強監(jiān)測對于及時全面準(zhǔn)確了解奶牛布魯氏菌病流行趨勢，制定防控和凈化方案具有重要意義。動物布魯氏菌病實驗室檢測分為病原學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測和分子生物技術(shù)。病原學(xué)鑒定是檢測布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，但病原學(xué)鑒定操作較煩瑣、費時，且檢測環(huán)境生物安全要求較高。分子生物技術(shù)雖然靈敏度和特異性好，但試驗儀器昂貴，成本高，操作復(fù)雜，檢測人員專業(yè)要求，也難以在基層動物疫病防治中大面積推廣。血清學(xué)檢測方法快捷方便，操作比較簡單，靈敏度和特異性也較高，是目前動物布病檢測最常規(guī)的方法。我國《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)（GB/T 18646—2018）》[5]重點規(guī)定了血清學(xué)檢測方法，其中包括虎紅平板凝集試驗（RBT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗（MRT）、試管凝聚試驗（SAT）、補體結(jié)合試驗（CFT）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）。這些方法各有優(yōu)缺點和局限性，具體選擇何種方法，值得探討。本研究采用RBT、MRT、SAT、免疫膠體金層析法（GICA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）分別對奶牛布魯氏菌病檢測，并運用Kappa統(tǒng)計量檢驗5種方法一致性，以豐富奶牛布魯氏菌病檢測技術(shù)資料。

1 試驗材料與檢測方法

1.1 待檢樣本

2022年7月，選擇無乳房疾病健康泌乳奶牛327頭（受檢奶牛均未布魯氏菌疫苗免疫），每頭牛分別采集血清327份血清和全乳327份，對應(yīng)編號，牛血清樣本-20 ℃保存待檢，全乳室溫保存以備MRT檢測。

1.2 檢測試劑

RBT抗原，MRT抗原，SAT抗原，GICA檢測試紙，cELISA試劑盒，布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，均為上海快靈生物科技有限公司產(chǎn)品。所有檢測試劑在有效期內(nèi)使用。

1.3 檢測方法

按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)（GB/T 18646—2018）》規(guī)定進(jìn)行RBT、MRT、SAT、cELISA檢測和結(jié)果判定；其中，327份全乳用于MRT檢測，且當(dāng)日進(jìn)行檢測，棄用腐敗、發(fā)酸全乳。GICA檢測試紙檢測按照試紙條說明書操作。

1.4 KAPPA統(tǒng)計量評價

Kappa是描述和評價診斷一致性比較理想的測量指標(biāo)，用來比較兩個或多個觀測者對同一事物，或者觀測者對同一事物的兩次或多次觀測結(jié)果是否一致，以由于機(jī)遇機(jī)會造成的一致性和實際觀測的一致性之間的差別大小作為評價基礎(chǔ)的統(tǒng)計指標(biāo)[6]。本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件計算4種檢測方法的Kappa統(tǒng)計量進(jìn)行一致性檢驗，評價指標(biāo)和結(jié)果判斷采用配對設(shè)計的四表格列表。見表1。

靈敏度為評價檢測方法正確判定陽性結(jié)果一致性的指標(biāo)，以sen=A/P1×100%表示；特異度為反映檢測方法正確判定陰性結(jié)果一致性的指標(biāo)，以spe=D/N1×100%表示；漏診率為反映實際錯判為陰性的指標(biāo)，也稱為假陰性率，以p-=C/P1×100%表示；誤診率反映實際錯判為陽性的指標(biāo)，也稱為假陽性率，以p+=B/N1×100%表示；符合率反映總樣本結(jié)果的一致性，以coin=（A+D）/S×100%表示。Kappa=（PA-PE）/（1-PE），式中PA=（A+D）/S，PE=[（A+B）（A+C）+（B+D）（C+D）]/S2 。Kappa值介于﹣1～+1之間，一般說來，若Kappa≥0.75為一致性良好，0.40<Kappa<0.75為一致性中等，Kappa<0.4為缺乏一致性[7]。

2 結(jié)果

2.1 奶牛布魯氏菌病5種檢測陽性結(jié)果

MRT檢測327份全乳和RBT、SAT、GICA、cELISA分別檢測327份血清，陽性率介于2.75%～5.20%，SAT陽性率最低，GICA陽性率最高。見表2。

2.2 5種檢測方法一致性和相關(guān)性比較

《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》GB/T 18646—2018規(guī)定SAT、cELISA和CFT用于確診，未規(guī)定布魯氏菌病血清學(xué)檢測金標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究中選取SAT作為金標(biāo)準(zhǔn)，利用Kappa檢驗RBT、MRT、GICA、cELISA檢測方法與SAT一致性，同時評價它們相關(guān)性（靈敏度、特異度、誤診率、漏診率和符合率）。見表3。SAT與RBT、MRT、GICA、cELISA的符合率分別為98.47%、96.33%、97.86%、99.39%；cELISA靈敏度最高，為100%，漏診率最低，為0，對SAT檢出的9份陽性樣本，全部檢出，MRT靈敏度最低，為77.78%，漏診率最高，為22.22%，對SAT檢出的9份陽性樣本檢出7份；cELISA特異度最高，為99.37%，誤診率最低，為0.63%，對SAT檢測出318份陰性樣本，檢出316份；MRT特異度最低，為96.86%，誤診率最高為3.14%，對SAT檢測出318份陰性樣本，檢出310份。

利用Kappa統(tǒng)計量檢驗其他RBT、MRT、GICA、cELISA檢測方法與SAT方法的一致性，結(jié)果見表4。按照Kappa判斷標(biāo)準(zhǔn)，與SAT比較，RBT、MRT、GICA、cELISA的Kappa值中，MRT、GICA的Kappa值均<0.75，分別為0.519、0.691，而RBT、cELISA的Kappa值均>0.75，以GICA最高，為0.932。

3 討論

本研究中采用上述5種方法對327份奶牛血清和327份全乳檢測，奶牛布魯氏菌病陽性率結(jié)果均不相同，以SAT為最高，為5.20%，GICA最低，為2.75%。表明檢測方法、檢測者人為因素、其他偶然因素等影響了結(jié)果差異。陽性率高低不能說明檢測方法靈敏度、特異度，可能存在誤診、漏診情況，以及我國沒有規(guī)定檢測金標(biāo)準(zhǔn)，缺乏對比性，難以反映真實性。因此，需要對這5種方法運用Kappa檢驗它們的一致性、相關(guān)性。

本研究以SAT為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT與RBT、MRT、GICA、cELISA比較，符合率、靈敏度、特異度均以cELISA最高，分別為99.39%、100%、99.37%，表明與SAT檢測出的真陽性和真陰性比例最高，存在誤診和漏診的情況最少。MRT符合率、靈敏度、特異度均最低，分別為96.33%、77.78%、96.86%。從Kappa值看，cELISA最高，為0.898，表明一致性最高，MRT、GICA最低，表明一致性最差。綜上分析可以看出，cELISA各項指標(biāo)最佳。需明確指出，本研究是在SAT為金標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行Kappa檢驗一致性，盡管一定程度反映了每種方法的各項指標(biāo)高低，但研究用不同生產(chǎn)企業(yè)甚至不同批次的商品化試劑之間敏感性、特異性、符合率等都存在差異，存在診斷結(jié)果的多樣性和不確定性[1]。

RBT通過血清樣本中的布魯氏菌抗體與虎紅抗原結(jié)合，觀察是否產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，能夠快速、簡單地診斷動物布病，檢測敏感性較高，但是凝集時間、抗原的標(biāo)準(zhǔn)化影響其敏感性，易受到非特異性抗體的干擾，假陽性較多，常被用于基層現(xiàn)場大量樣品的布病初篩。SAT檢測原理是血清IgM抗體與布魯氏菌發(fā)生凝聚反應(yīng)，不易受其他干擾因子影響，特異性較強，陽性結(jié)果比較準(zhǔn)確，GB/T 18646—2018規(guī)定SAT可以作為確診檢測方法，但SAT需要大量試管等耗材，且24 h培養(yǎng)，步驟煩瑣，結(jié)果判斷受檢測者主觀因素影響，需要綜合判定檢測結(jié)果。MRT主要通過檢測牛奶樣本中的抗體來實現(xiàn)布病檢測，僅適用于泌乳母牛，適用范圍小，對某一頭奶牛的全乳或者多頭奶牛的混合牛奶均可以檢測，采樣方便，避免了血清采樣造成的驅(qū)趕、保定等應(yīng)激影響，但是靈敏度較低，本研究中僅為77.78%，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。此外，對樣本要求必須是沒有產(chǎn)酸、變質(zhì)或者凍融的全乳，適合大規(guī)?，F(xiàn)場初篩。GICA是一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，檢測時間短，數(shù)分鐘判斷結(jié)果，操作方便，樣本無需預(yù)處理，專業(yè)技術(shù)要求低，檢測結(jié)果易于判定，特異性好，在基層有很強的實用性，但靈敏度較差，高度依賴于抗體的特異性。cELISA靈敏度、特異度均高，借助酶標(biāo)儀判定結(jié)果，克服了肉眼隨意性帶來的判定結(jié)果偏差，數(shù)據(jù)再現(xiàn)性更高。本研究中cELISA一致性等相關(guān)指標(biāo)最佳，但檢測儀器昂貴、檢測成本較高等限制了該方法在基層推廣應(yīng)用，可作為實驗室檢測手段。

因此，對于奶牛布魯氏菌病要運用多種方法檢測方法，結(jié)合疫病流行現(xiàn)狀、檢測技術(shù)、田間檢測規(guī)模及成本等多種因素考慮，一般先用RBT、MRT、GICA進(jìn)行大面積現(xiàn)場初篩，再運用SAT、cELISA等靈敏度和特異度高的方法確診，有效提高檢測真實性，有利于布魯氏桿菌病凈化。

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