小立碗蘚泛素連接酶U-box家族的鑒定及表達分析

摘 要： U-box家族編碼E3泛素連接酶能夠特異性識別底物，從而調(diào)控蛋白的修飾和降解過程。為鑒定小立碗蘚U-box家族成員，分析其生物學(xué)特征及基因表達規(guī)律，該研究基于小立碗蘚的全基因組測序數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)技術(shù)對泛素連接酶U-box家族成員的理化性質(zhì)、進化關(guān)系、順式作用元件、組織表達模式、脅迫響應(yīng)等進行了分析。結(jié)果表明：（1）在小立碗蘚全基因組中共鑒定得到31個U-box家族成員，并且不均勻地分布于14條染色體上；其分子量大小在37.75～117.49 kDa之間，等電點介于5.32～8.55之間。（2）進化樹顯示，小立碗蘚的U-box家族成員分布在I-IX亞家族中，其中亞家族VII含有小立碗蘚成員最多，共11個（約占36.67%），說明小立碗蘚在歷史進化過程中具有高度保守性且功能多樣化。（3）經(jīng)啟動子分析發(fā)現(xiàn)，小立碗蘚U-box家族成員具有結(jié)合GA和ABA等多個激素的元件。（4）組織表達分析發(fā)現(xiàn)小立碗蘚U-box家族成員主要在綠絲體、軸絲體和孢子體S3時期大量表達。（5）通過ABA、甘露醇和飽和LiCl處理后發(fā)現(xiàn)，配子體的擬莖均發(fā)生黃化且PpPUB21的表達量均被顯著誘導(dǎo)。推測小立碗蘚U-box家族成員在生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用，這為后續(xù)深入研究小立碗蘚U-box家族成員的基因功能研究奠定了理論基礎(chǔ)，也為其相關(guān)研究提供了參考。

關(guān)鍵詞： 小立碗蘚， U-box家族， 基因表達， 功能分析， 全基因組鑒定

中圖分類號： Q943

文獻標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-3142（2024）09-1678-11

Genome-wide identification and expression analysis

of E3 ubiquitin-protein ligase U-box family

in Physcomitrium patens

Abstract： The U-box family encodes E3 ubiquitin ligase， which can specifically recognize the substrate and thus regulate the process of protein modification and degradation. In order to identificate the members of the Physcomitrium patens U-box family and to analyze their gene expression regularities， their physicochemical characteristics， evolutionary relationship， cis-acting element， tissue expression patterns and stress response were analyzed based on the whole sequencing data of P. patens through bioinformatics technology. The results were as follows： （1） A total of 31 U-box family members were identified in the whole genome of P. patens and were unevenly distributed on 14 chromosomes; their molecular weight sizes ranged from 37.75-117.49 kDa， and their isoelectric points ranged from 5.32-8.55. （2） The evolutionary tree showed that the U-box family members of P. patens were distributed in subfamilies I-IX， among which subfamily Ⅶ contained the largest number of members， with a total of 11 members accounting for about 36.67%. This indicated that P. patens was highly conserved and functionally diversified in the historical evolutionary process. （3） Promoter analysis yielded that P. patens U-box family members had elements that binded several hormones including GA and ABA. （4） Tissue expression analysis yielded that P. patens U-box family members was abundantly expressed mainly in the chloroplast， axoplast， and sporophyte S3 periods. （5） After simulated drought treatment with ABA， mannitol and saturated LiCl， it was found that the proposed stems of gametophytes were yellowed and the expression of PpPUB21 was significantly induced. It is hypothesized that the P. patens U-box family members plays an important role in growth and development and in response to adversity stress， and these findings provide a reference for further research on the U-box gene of P. patens.

Key words： Physcomitrium patens， U-box family， gene expression， functional analysis， genome-wide identification

泛素化途徑中26S-蛋白酶體由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體組成，是真核生物生命活動中重要的調(diào)節(jié)機制之一（Mukhopadhyay et al.， 2007;Wang et al.， 2015）。泛素化是通過共軛聯(lián)級反應(yīng)來識別特定的泛素信號，而泛素連接酶E3決定底物蛋白的特異性識別，根據(jù)其作用機理和亞基的不同，可將泛素連接酶E3分為4類，即HECT、U-box、RING和多亞基泛素連接酶家族。其中，U-box的突變會使E3連接酶的活性降低或喪失，并導(dǎo)致細胞分裂、信號傳導(dǎo)、生物脅迫、非生物脅迫、生長發(fā)育等多個方面功能喪失（宋素勝和謝道昕，2006；Mazzucotelli et al.， 2006；Stone & Callis， 2007； 秦小兵， 2020；歐斯艷等，2020； Kim， et al.， 2021）。U-box結(jié)構(gòu)域最早發(fā)現(xiàn)于酵母UFD2蛋白且在真核生物中高度保守，其由70多個氨基酸殘基組成，但在不同生物基因組中數(shù)量差異較大（Koegl et al.， 1999）。

U-box家族已在多個物種中被鑒定，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出61個含有U-box的結(jié)構(gòu)蛋白，其中AtPUB1、AtPUB18、AtPUB19、AtPUB30與低溫、干旱和鹽脅迫有關(guān)（Wiborg et al.， 2008）；在水稻（Oryza sativa）中鑒定得到77個U-box結(jié)構(gòu)蛋白，其中OsPUB21、OsPUB23、OsPUB24、OsPUB26、OsPUB28、OsPUB54、OsPUB56、OsPUB60、OsPUB70均與干旱脅迫和稻瘟病有關(guān)。此外，在干旱脅迫條件下，OsPUB41基因被OsUBC25激活，并與OsCLC6相互作用，負調(diào)控干旱脅迫（Seo et al.， 2021）；在香蕉（Musa acuminata）中共鑒定得到91個U-box結(jié)構(gòu)蛋白，其中MaPUB84和MaPUB91在響應(yīng)干旱脅迫中起正調(diào)控作用（Hu et al.， 2018）；在番茄（Lycopersicon esculentum）中鑒定出56個U-box結(jié)構(gòu)蛋白，其中Solyc-01g007000.2.1在叢枝菌根真菌脅迫中顯著表達；在甘藍（Brassica oleracea）中鑒定出99個U-box成員，通過啟動子分析發(fā)現(xiàn)有36個候選基因與激素調(diào)節(jié)和干旱脅迫相關(guān)（Hu et al.， 2019； 胡燈科，2021）；在玉米（Zea mays）中共鑒定出76個U-box蛋白，通過分析啟動子序列得到玉米U-box基因可能參與光合作用、激素應(yīng)答和逆境脅迫且響應(yīng)程度不同，說明各成員間基因功能特異性明顯（陳曙等，2022）。

小立碗蘚（Physcomitrium patens）屬于非維管束植物、結(jié)構(gòu)簡單，是早期登陸植物的代表。植物在從水生到陸生的歷程中，需要適應(yīng)陸生環(huán)境的非生物脅迫和生物脅迫，是研究植物發(fā)育和逆境脅迫的理想材料（趙奐等，2004；劉艷等，2007；León et al.， 2012）；而小立碗蘚中的26S蛋白酶體對其發(fā)育進程至關(guān)重要（Girod et al.， 1999）。本文以小立碗蘚為研究材料，利用其全基因組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法鑒定U-box家族中的成員，對其特征及表達進行分析，擬探討：（1）小立碗蘚U-box家族的特征；（2）小立碗蘚U-box家族成員在非生物脅迫中發(fā)揮的重要作用。以期為后續(xù)深入研究小立碗蘚U-box家族的基因功能奠定基礎(chǔ)以及為其相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料 小立碗蘚材料由首都師范大學(xué)何奕騉教授贈送，利用BCDATG培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（25±1） ℃，光照40 mmol·m-2·s-1，每隔25 d進行繼代培養(yǎng)（田旭，2023）。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒TRIzol Reagent （Invitrogen， Cat. No. 15596-018）和熒光定量PCR試劑盒Power UPTM SYBRTM Green Master Mix （Thermofisher scientific， Cat. No. 25741）均購于賽默飛世爾科技公司；引物合成及測序由生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 U-box家族成員鑒定

小立碗蘚基因組數(shù)據(jù)來源于phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//jgi.doe.gov/data-and-tools/data-systems/phytozome/），擬南芥U-box基因和蛋白質(zhì)序列來源于TAIR （https：//www.arabidopsis.org/）。以TAIR數(shù)據(jù)庫中U-box成員PF04564序列與phytozome數(shù)據(jù)庫的小立碗蘚全基因組進行BLAST，篩選出小立碗蘚U-box基因，并翻譯成蛋白質(zhì)，利用SMART （http：//smart.emblheidelberg.de/）和Batch CD-Search （http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）篩選出U-box的保守結(jié)構(gòu)域，刪除無典型U-box結(jié)構(gòu)域的序列后得到的即為小立碗蘚U-box家族成員。

1.2.2 U-box結(jié)構(gòu)特征及亞細胞定位分析 根據(jù)已確定的小立碗蘚U-box家族成員的基因與CDS序列，利用TBtools軟件分析基因結(jié)構(gòu)并利用注釋文件對基因進行染色體定位和可視化（Chen et al.， 2020）。通過Expasy Proteomics Server （http：//www.expasy.org/roteomics）分析小立碗蘚U-box家族成員的蛋白質(zhì)分子量、等電點等理化性質(zhì)預(yù)測。利用Plant-mPLoc （http：//Plant-mPLoc server sjtu.edu.cn）預(yù)測U-box蛋白的亞細胞定位。

1.2.3 U-box系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 利用MEGA 11軟件對擬南芥、玉米、小立碗蘚的U-box蛋白序列進行比對，通過鄰接法（neighbor joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。參數(shù)設(shè)置成替換模型為Poisson model，缺口為pairwise deletion，矯正參數(shù)值為1 000。

1.2.4 U-box基因啟動子分析和組織表達模式分析 提取小立碗蘚U-box家族基因上游2 kbp的序列，通過Plant CARE （http：//bioinformatics.Psb.Ugent.be /webtools/plantcare/html/）對啟動子進行預(yù)測。利用小立碗蘚的EFP（https：//bar.utoronto.ca/）搜索31個U-box家族基因在不同組織及發(fā)育時期的表達，包括胚胎（S1）、早期孢子（S2）、孢子（S3）、減數(shù)分裂時期孢子（M）、假根、配子體、軸絲體、綠絲體、頸卵器、原生質(zhì)體和孢子體共11個組織（Ortiz-Ramírez et al.， 2016）。

1.2.5 小立碗蘚脅迫處理 將小立碗蘚接種在BCDATG培養(yǎng)基中，于25 ℃、光照16 h/黑暗8 h條件下培養(yǎng)28 d后，將其轉(zhuǎn)移到分別含新鮮的BCDATG培養(yǎng)基和含有50 μmol·L-1脫落酸、100 mmol·L-1甘露醇（mannitol， MAN）和飽和LiCl的新鮮培養(yǎng)基中，對小立碗蘚進行激素和不同的滲透脅迫，處理7 d后觀察表型（郭強和王曉琴， 2016）。

1.2.6 RNA提取及定量表達檢測 通過TRIzol提取不同處理后配子體的mRNA，利用RT-PCR kit （Takara， Tokyo）將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。Primer 6.0設(shè)計熒光定量引物后，參照Power UPTM SYBRTM Green Master Mix試劑盒進行定量，反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃預(yù)變性2 min、95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min保持40個循環(huán)。以Ppactin 3（GenBank： 3AY382283.1）作為內(nèi)參對目的基因進行相對定量，基因相對表達量用公式2-△△Ct法計算，3次生物學(xué)重復(fù)（王倩倩，2021）。具體基因的引物如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小立碗蘚基因組中U-box家族成員的鑒定和理化性質(zhì)分析

通過BLAST比對搜索，并利用SMART和Batch CD-Search網(wǎng)站，去除無典型U-box結(jié)構(gòu)域的序列，最終鑒定得到小立碗蘚U-box家族共有31個成員，如表2所示，小立碗蘚U-box家族成員中，蛋白的分子量差異較大。PpPUB30有1 036個氨基酸，分子量最大，為117.49 kDa；而PpPUB5有327個氨基酸殘基，分子量最小， 為37.74 kDa； 此外，U-box家族成員的等電點也存在顯著差異，PpPUB25等電點為8.55，而PpPUB29等電點為5.32。小立碗蘚U-box家族成員不均勻地分布在14條染色體上，分別是1、3、6、9、10、12～15、17、18、20、22、24號染色體。除PpPUB3、PpPUB14、PpPUB18和PpPUB24定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核以外，其余成員均定位在細胞核中。

2.2 小立碗蘚U-box家族的基因結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化分析

利用基因組注釋文件，通過TBtools軟件對小立碗蘚U-box家族成員的基因結(jié)構(gòu)繪制基因結(jié)構(gòu)圖（圖1）。由圖1可知，在小立碗蘚的31個PUB蛋白中，有8個成員僅由1個外顯子構(gòu)成且無內(nèi)含子。預(yù)測31個小立碗蘚U-box家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)域，得到U-box家族除含有典型的U-box結(jié)構(gòu)域以外，部分還具有WD-重復(fù)蛋白和34個多肽重復(fù)序列的蛋白質(zhì)共價結(jié)合相關(guān)結(jié)構(gòu)域。利用鑒定出的31個小立碗蘚U-box家族成員的蛋白質(zhì)序列與擬南芥和玉米U-box家族成員組成數(shù)據(jù)矩陣，使用MEGA 11構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2）。圖2結(jié)果表明，小立碗蘚、擬南芥和玉米U-box家族可以分為9個亞家族，不同亞家族間小立碗蘚的U-box成員數(shù)量差異明顯，其中亞家族Ⅶ中含有小立碗蘚成員最多，共有11個（占U-box家族的36.67%）；在亞家族Ⅰ、Ⅲ中各含有6個成員；在亞家族Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ中不含有小立碗蘚的成員。

2.3 小立碗蘚U-box家族的基因啟動子順式作用調(diào)控元件分析

對U-box家族成員上游2 kbp的啟動子順式作用元件進行分析和可視化（圖3）。由圖3可知，其主要有植物激素響應(yīng)元件和非生物應(yīng)答元件；在激素調(diào)控方面主要有生長素、脫落酸、赤霉素和水楊酸等響應(yīng)元件；非生物響應(yīng)元件包括低光反應(yīng)元件、溫脅迫響應(yīng)元件和干旱脅迫響應(yīng)元件。在31個U-box家族成員中，所含啟動子作用元件的數(shù)量和種類差異明顯，PpPUB7含有的啟動子元件最少，有11個；PpPUB4含有的啟動子元件最多，有39個，主要包括低溫響應(yīng)元件、脫落酸反應(yīng)元件、赤霉素反應(yīng)元件、生長素反應(yīng)元件、MeJA響應(yīng)元件、光反應(yīng)元件。在植物激素調(diào)控方面，與脫落酸調(diào)控相關(guān)的元件最多，有28個基因家族成員含有與脫落酸調(diào)控相關(guān)的作用元件。此外，有21個基因家族成員含有與干旱脅迫相關(guān)的元件。

2.4 小立碗蘚U-box家族成員在不同組織和發(fā)育期的表達分析

通過eFP Browser（http：//www. bar. utoronto.ca/）查詢31個小立碗蘚PUB基因在不同組織的表達，并將孢子體分為4個發(fā)育時期，分別是M期和S1-S3期（Ortiz-Ramírez et al.， 2016）。利用TBtools繪制基因表達熱圖，結(jié)果如圖4所示，除部分基因（如PpPUB12、PpPUB13和PpPUB18）的表達量較低以外，小立碗蘚U-box基因家族成員在不同組織中表達差異變化明顯，可以分為3個聚類。其中，大部分PpPUBs在綠絲體、軸絲體和孢子體S3時期大量表達，推測這些U-box成員對原絲體階段的形成和孢子體的發(fā)育起著重要的作用。相對于其他基因家族成員，PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25和PpPUB26在配子體中的表達量較高。由于小立碗蘚是以單倍體配子體為主要生活史，因此PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25和PpPUB26在植物配子體對外界的環(huán)境響應(yīng)過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

2.5 不同脅迫處理下對小立碗蘚U-box家族的表達量分析

通過ABA、飽和LiCl和甘露醇的處理，觀察配子體的表型，并分析小立碗蘚U-box家族在配子體中高表達的4個基因PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25和PpPUB26的表達變化（圖5）。由圖5可知，ABA處理后配子體擬莖的下端出現(xiàn)輕微的黃化；而飽和LiCl和甘露醇模擬干旱處理，均導(dǎo)致配子體的整個部位出現(xiàn)明顯黃化，其中LiCl的表型更為明顯， 其處理后擬葉部位枯萎甚至出現(xiàn)褐色斑點。通過進一步分析PpPUBs的表達量，發(fā)現(xiàn)PpPUBs在脫落酸的處理下表達均被顯著誘導(dǎo)，可能與其啟動子能夠結(jié)合脫落酸的信號相關(guān)，其中PpPUB21的表達最為顯著，經(jīng)ABA處理后增加了8.10倍。在飽和LiCl和甘露醇處理后，PpPUB21的表達量變化最為明顯，分別增加了6.50倍和3.90倍。此外，PpPUB26在飽和LiCl處理后被顯著誘導(dǎo)，但在甘露醇的滲透脅迫中沒有發(fā)生顯著變化，而PpPUB22和PpPUB25在甘露醇處理后則顯著增加。這表明不同PpPUB成員在不同的滲透脅迫下發(fā)揮著重要的作用。

3 討論與結(jié)論

泛素蛋白質(zhì)降解途徑在植物的生長發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用（Xiao et al.， 2018）。U-box家族是E3泛素連接酶家族中重要的一個，也是底物特異性識別的重要因子（繳莉等，2016）。在擬南芥的基因組中，與E3泛素連接酶相關(guān)的基因有1 200多個，其中U-box是E3泛素連接酶中具有重要功能的一類（趙丹等，2021）。迄今為止，U-box家族的特征和功能已在維管束植物中被鑒定報道，但對小立9rvqTJEfn0fFaA5KQSaz4w==碗蘚U-box家族未見報道。本研究從小立碗蘚全基因組中鑒定出31個U-box家族成員，相對于擬南芥和玉米的U-box家族成員要少，但與葡萄的U-box家族成員相同，表明U-box家族成員在不同物種中存在差異，推測這可能與物種間進化關(guān)系和適應(yīng)環(huán)境有關(guān)（Smalle & Vierstra，2004）；小立碗蘚U-box家族成員在不同亞家族間的理化性質(zhì)及基因結(jié)構(gòu)差異較大，推測不同的成員功能可能存在差異（Ignacio，2010），基因結(jié)構(gòu)與進化分析結(jié)果顯示，同一亞家族中，不同分支的U-box家族的蛋白質(zhì)序列長度、保守結(jié)構(gòu)域、外顯子和內(nèi)含子等具有較大差異；同一分支的基因結(jié)構(gòu)相似，說明小立碗蘚U-box家族的基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，暗示其功能的多樣性，推測小立碗蘚泛素連接酶U-box家族在進化過程中保持高度保守性，在維持其基本功能的同時使其基因功能多樣化，以適應(yīng)環(huán)境變化和物種的延續(xù)；保守的結(jié)構(gòu)域與基序通常與轉(zhuǎn)錄因子的功能相關(guān)，而同一分支的保守結(jié)構(gòu)域相似，推測其具有相似的信號調(diào)控途徑和生物學(xué)功能，不同亞家族的特異性保守結(jié)構(gòu)域可能在轉(zhuǎn)錄中同樣發(fā)揮了重要作用（王玉鳳等，2023）。小立碗蘚U-box家族成員亞細胞定位大部分在細胞核中，說明其在細胞質(zhì)中合成后進入細胞核發(fā)揮作用；此外部分還分布于細胞質(zhì)中，說明其功能分工上有所不同，可能是在信號傳遞的不同階段發(fā)揮作用（Sakuma et al.， 2002）。通過對小立碗蘚31個U-box家族成員啟動子功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，其含有大量與植物激素響應(yīng)相關(guān)的元件，表明其能夠響應(yīng)植物的生長發(fā)育、逆境脅迫、細胞周期調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，推測U-box家族成員可能參與植物的生長發(fā)育（王悅冰等，2008）；通過ABA處理小立碗蘚配子體后的基因表達量分析發(fā)現(xiàn)，PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25、PpPUB26顯著上調(diào)表達，推測其可能參與ABA響應(yīng)，而通過干旱處理小立碗蘚后的基因表達量分析，發(fā)現(xiàn)PpPUB21、PpPUB26基因表達量顯著上調(diào)，推測其可能參與調(diào)控干旱脅迫后恢復(fù)，其結(jié)果與啟動子分析的結(jié)果一致（Ignacio，2010）。通過對小立碗蘚11個不同組織部位表達分析發(fā)現(xiàn)，不同的U-box基因在不同組織中表達差異明顯，PpPUB2、PpPUB16在綠絲體、原生質(zhì)體、假根、配子體、軸絲體和孢子中表達量較高，在孢子體和頸卵器中表達量較低，推測其與小立碗蘚單倍體的生長發(fā)育有關(guān)，PpPUB5、PpPUB6和PpPUB27在孢子體，頸卵器中表達量較高，在綠絲體、原生質(zhì)體、假根、配子體、軸絲體表達量較低，推測可能與小立碗蘚的有性繁殖有關(guān)。

小立碗蘚U-box家族具有與其他物種相似的生物信息學(xué)特征及規(guī)律，同時參與小立碗蘚的生長發(fā)育、逆境脅迫的生物學(xué)功能。通過研究小立碗蘚U-box家族的分子生物信息學(xué)特征及組織表達規(guī)律，有助于闡明小立碗蘚U-box家族的分子調(diào)控機制。本研究依據(jù)小立碗蘚全基因組數(shù)據(jù)，篩選出31個小立碗蘚的U-box 家族成員，各成員內(nèi)含子數(shù)目差異較大，其中8個成員無內(nèi)含子；亞細胞定位顯示PpPUB3、PpPUB14、PpPUB18和PpPUB24定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核，其余成員均定位于細胞核中；啟動子功能預(yù)測分析結(jié)果顯示，U-box家族成員可能參與小立碗蘚激素應(yīng)答和脅迫應(yīng)答反應(yīng)且響應(yīng)程度不同?；虮磉_模式分析結(jié)果顯示，小立碗蘚PpPUBs基因表達具有組織特異性。配子體中高表達的PpPUB21在ABA和不同滲透脅迫下均能被顯著上調(diào)，為進一步揭示PpPUB基因在植物進化過程和逆境脅迫中的作用提供了理論基礎(chǔ)，也為將來揭示該基因家族在進化過程中發(fā)揮重要的功能以適應(yīng)環(huán)境提供了理論依據(jù)。

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