還原型谷胱甘肽皮膚滲透性研究

本文以評估還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione， GSH）在豬皮膚表面和真皮層的駐留量為目的，以巴馬小型豬離體皮膚作為皮膚模型材料，并應(yīng)用Franz擴(kuò)散池和HPLC法分別測定兩種制劑（QRMT和D-5X）中GSH在不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚表面和真皮層中駐留量。結(jié)果顯示， QRMT中的GSH釋放到皮膚表面的速度更快。在1小時(shí)和2小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，QRMT中的GSH駐留量分別是D-5X中的5.5倍和3.4倍。同樣地，QRMT中的GSH也更快地滲透進(jìn)入皮膚真皮層。在1小時(shí)和2小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，QRMT中的GSH在豬皮膚真皮層中的駐留量分別是D-5X中的25.1倍和21.8倍。這些研究結(jié)果為QRMT中的GSH在皮膚表面和真皮層中發(fā)揮功效提供了更充分的化學(xué)基礎(chǔ)。結(jié)論表明，QRMT中的GSH釋放和滲透進(jìn)入真皮層的速度更快，且在皮膚表面和皮膚真皮層中的駐留量都顯著高于D-5X中的GSH駐留量。

關(guān)鍵詞：還原型谷胱甘肽；巴馬小型豬皮膚模型; 皮膚表面駐留量；皮膚真皮層中駐留量

近年來，隨著人們對健康和美麗的追求，皮膚護(hù)理研究越來越受到關(guān)注。在眾多的皮膚護(hù)理成分中，還原型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）因其獨(dú)特的抗氧化、抗衰老和皮膚修復(fù)功效而備受關(guān)注。GSH是一種天然存在于人體內(nèi)的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成[1]。GSH具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)的自由基，防止自由基對皮膚細(xì)胞的損傷。此外，還原型谷胱甘肽還具有抗衰老、抗炎和促進(jìn)皮膚修復(fù)的作用。研究表明，還原型谷胱甘肽能夠抑制膠原蛋白的降解，促進(jìn)膠原蛋白的合成，從而延緩皮膚老化[1-3]。

功效成分在產(chǎn)品中的釋放量，及其在皮膚的駐留劑量是其發(fā)揮功效作用的關(guān)鍵[4，5]。保濕和美白等化妝品功效成分的開發(fā)與應(yīng)用，需要建立在透皮吸收的基礎(chǔ)上。例如，防曬產(chǎn)品中的紫外線吸收劑的更多劑量應(yīng)能駐留在皮膚表面，以執(zhí)行吸收和反射紫外線的功能；美白產(chǎn)品中的活性美白成分應(yīng)能靶向皮膚的基底層，以干預(yù)和阻斷黑色素的形成過程；而抗衰老產(chǎn)品的有效成分通常應(yīng)作用于真皮層的成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)皮膚彈性和緊致度的提升。因此，化妝品活性成分是否能在皮膚的不同部位達(dá)到足夠的駐留量對其能否發(fā)揮功效是有顯著影響的。

本研究建立了測定GSH含量測定分析方法，并采用巴馬小型豬皮膚模型，測定不同時(shí)間點(diǎn)的GSH在單位皮膚表面駐留量和皮膚真皮層中駐留量，并且比較了兩個(gè)含有GSH供試樣品在不同時(shí)間點(diǎn)單位皮膚表面和皮膚真皮層中駐留量。此研究所建立的豬皮膚模型能為評估皮膚美容功效產(chǎn)品提供重要的實(shí)驗(yàn)方法。

Part 1

儀器與材料

1.儀器

BSA323S電子天平（精度0.001g，德國賽多利斯公司）；PR224ZHE型電子天平（精度0.0001g，沙鷹科學(xué)儀器有限公司）；LC-2030C型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2600型紫外檢測器（日本島津公司）；TT-B（D）型Franz透皮試驗(yàn)儀（天津市正通科技有限公司）；800D-1型離心機(jī)（常州天瑞儀器有限公司）；F6/10型電動(dòng)均漿機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

2.材料

谷胱甘肽閃釋膜片（QRMT， 規(guī)格130mg，批號HLG2405，常州偉博海泰化妝品有限公司研制）；LYUH ESTHER SALMON DNA DIRECT 5X （D-5X，規(guī)格326mg， 批號YGY 13028， 韓國BIO 360生產(chǎn)）；谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品（純度：98%，阿拉丁生化科技股份有限公司）; Luna C18色譜柱（Phenomenex公司）；FiveEasy Plus型pH計(jì)（梅特勒—托利多儀器有限公司）；BIO-DL型移液槍（賽多利斯公司）；濾膜（0.22 μm，天津津騰公4579da2f0b67ce21d849af674d7e19fd司）；色譜純乙腈（Fisher 公司）；5，5′—二硫雙-2—硝基苯甲酸（DTNB，批號 E1922062，阿拉丁生化科技股份有限公司）；試劑實(shí)驗(yàn)用水為超純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；生理鹽水，磷酸二氫鉀，磷酸為分析純（北京化工集團(tuán)股份有限公司）。

3.動(dòng)物

巴馬小型豬【合格證號：SCXK （蘇） 2022-0013，泰州泰和生物科技有限公司，雄性，日齡30，體重2.5-3.5 kg】。

Part 2

方法與結(jié)果

1.GSH含量測定與方法學(xué)驗(yàn)證

（1）柱前衍生化：GSH化學(xué)結(jié)構(gòu)中的巰基與DTNB試劑化學(xué)反應(yīng)，生成的衍生物在pH值偏酸性流動(dòng)相中，有明顯的紫外線吸收。

（2）色譜條件：色譜柱為C18 （4.6 mm150 mm，3.0 μm）；流動(dòng)相A為乙腈， 流動(dòng)相B為0.025%磷酸水（pH3.8），梯度洗脫程序：0～3 min， 12% A; 3～4.5 min， 12%～18% A;4.5～15 min， 18%～40%A；流速 0.8 mL/min；柱溫 40℃，檢測波長 330 nm；進(jìn)樣量 20 μL。

（3）對照品溶液制備：精密稱取GSH對照品約10 mg，加入生理鹽水溶液溶解并定容于10 ml量瓶中，搖勻，即得濃度約為1.0 mg·mL-1的混合對照品儲(chǔ)備溶液，備用。

（4）線性關(guān)系考察：用移液槍分別量取對照品溶液不同體積，再加入生理鹽水溶液進(jìn)行稀釋，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為100、50、10、5、1.0、0.10 μg·mL-1的系列對照品溶液。分別吸取上述各濃度對照品溶液各1mL，加入100 g·mL-1 DTNB 溶液1 mL，渦旋3 min，取20 L依次注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得GSH回歸方程為Y＝1.66E+04X+7.57E+03，r＝0.9998。結(jié)果表明，GSH的線性濃度分別為0.103—102.68 μg·mL-1。

（5）精密度試驗(yàn)：取對照品（約1.0 μg·mL-1）溶液 20 μL，分別于同1 d之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定6次，并在6 d 之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示3個(gè)對照品溶液日內(nèi)精密度RSD分別為2.68%、1.93%、1.31%，日間精密度RSD分別為2.12%、2.38%、18.7%。

（6）穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取供試品溶液（QRMT離體豬皮膚透皮試驗(yàn)中制備的豬皮膚表面和真皮層樣品） 0.5 mL，各加入100 g·mL-1 DTNB 溶液0.5 mL，渦旋反應(yīng)3 min，0.22 m微孔濾膜過濾，續(xù)濾液分別于0h、1h、2h、4h、8h、24h測定峰面積，結(jié)果顯示峰面積RSD分別為1.38%和1.62%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（7）回收率試驗(yàn)：將剪碎的豬皮膚中加入GSH對照品溶液（100 μg·mL-1） 1.0 mL，再加入生理鹽水超聲，提取2次，每次5.0 mL水，合并提取液。取0.25 mL，按1：1比例分別加入對照品溶液0.25 mL，加入100 g·mL-1 DTNB 溶液0.5 mL，渦旋反應(yīng)3 min，12000轉(zhuǎn)離心10 min， 上清液0.22 μm濾膜過濾。每個(gè)樣品平行制備3份供試品，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。GSH平均回收率范圍為97.2%—103.6%，平均RSD值為2.81%。

（8）專屬性試驗(yàn)：取供試品溶液，對照品溶液、陰性樣品（豬皮提取液），按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件檢測，記錄色譜圖。對照品峰形良好，供試品與對照品在相應(yīng)位置上存在相同峰，且陰性樣品溶液對測定結(jié)果不產(chǎn)生干擾。

2.離體豬皮透皮試驗(yàn)

（1）離體豬皮制備：巴馬小型豬處死后立即剪取腹部皮膚，剝離皮下脂肪和結(jié)締組織，用95%酒精棉球反復(fù)擦試皮膚表面，再用生理鹽水沖冼干凈，濾紙吸干水分，備用。

（2）透皮試驗(yàn)：參考文獻(xiàn)方法[6，7]，應(yīng)用Franz透皮試驗(yàn)儀進(jìn)行透皮試驗(yàn)，將豬皮膚置于接收池頂面，皮膚角質(zhì)層向上與供給池接觸，真皮層與透皮接受液接觸。透皮接收液為生理鹽水5 mL。樣品（約含谷胱甘肽10 mg）直接加入至透皮供給池內(nèi)（生理鹽水溶液）。擴(kuò)散池水浴溫度37±0.5°C，攪拌速度450 r·min-1，取樣時(shí)間點(diǎn)1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h。皮膚表面樣品：用3只棉球分別擦試干凈皮膚表面殘留物，再用生理鹽水溶液沖洗皮膚表面3次，每次1 mL，然后將這些棉球放在生理鹽水中超聲提取，冷卻置室溫，定容置5 mL。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差對結(jié)果的影響，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行6份。真皮層樣品制備：用棉球擦試干凈皮膚表面的殘留物，然后膠帶粘貼法粘貼表皮20次，將皮膚角質(zhì)層粘下。然后將處理后剩余皮膚剪碎，在勻漿機(jī)內(nèi)加入5 mL生理鹽水溶液進(jìn)行勻漿處理，離心，取上清液，0.22 m微孔濾膜過濾。所有樣品均取 0.5 mL， 加入100 g·mL-1 DTNB 溶液0.5 mL，渦旋反應(yīng)3 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)針HPLC分析。

（3）數(shù)據(jù)分析：單位面積皮膚上GSH在皮膚表面駐留量和皮膚內(nèi)駐留量，按如下公式（1）計(jì)算：

Qr = C1×V1／S（1）

式中Qr （μg·cm-2）代表GSH在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的單位面積皮膚內(nèi)駐留量；Ci （μg·mL-1）代表在GSH濃度；Vi （mL）代表提取溶液體積（5.0 mL）；S （cm2）代表擴(kuò)散池暴露離體皮面積（0.71 cm2）。

3. 豬皮膚模型中GSH在皮膚表面和真皮層中駐留量

圖1顯示了QRMT和D-5X中GSH在豬皮膚模型中皮膚表面駐留量—累積時(shí)間曲線。相比較于D-5X，QRMT中GSH釋放皮膚表面速度更快，尤其是在1 h和2 h，Qr分別為5.5 倍和3.4倍（如表1所示）。如圖1B所示，QRMT中GSH可以更容易和更快速滲透進(jìn)入皮膚真皮層。相反，D-5X中GSH在豬皮膚真皮層中駐留量相對較低。尤其是在1 h，2 h和12 h，QRMT中GSH在豬皮膚真皮層中駐留量分別是D-5X中GSH的25.1， 21.8和 1.9倍（如表1所示）。此外，QRMT中GSH在皮膚真皮層中的駐留量顯著高于皮膚表面駐留量，2小時(shí)后，真皮層中的駐留量約是皮膚表面駐留量的6.7倍（如表1所示）。

Part 3

討論

本研究通過建立一種豬皮膚模型評估方法，對GSH在皮膚表面和皮膚真皮層中的駐留行為進(jìn)行了研究。通過柱前衍生化方法[8]，我們成功測定了GSH在不同時(shí)間點(diǎn)單位皮膚表面駐留量和皮膚真皮層中駐留量，為理解GSH在發(fā)揮皮膚美容功效中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，QRMT中GSH在豬皮膚模型中的釋放和駐留行為表現(xiàn)出了顯著的時(shí)間依賴性。在皮膚表面，GSH的釋放速度較快，8h內(nèi)即可達(dá)到相對穩(wěn)定的表面駐留量。這表明GSH成分可能迅速作用于皮膚表層，提供即時(shí)的抗氧化和護(hù)膚效果。此外，QRMT 中GSH 在皮膚真皮層中的駐留量顯著高于皮膚表面駐留量，2h 后，真皮層中的駐留量約是皮膚表面駐留量的21.8 倍，這表示GSH 在更深層皮膚中的滲透速率和美白功效將達(dá)到更好的效果。這些結(jié)果對于皮膚護(hù)理產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。QRMT 中GSH 的快速表面和真皮層中駐留可能使其成為理想的即時(shí)護(hù)膚成分。此外，12h 后， QRMT 中GSH 在皮膚表面和真皮層中具有較大駐留量，這可以增強(qiáng)GSH 在皮膚表層和深層皮膚中的功效的持久性。此外，研究還揭示了GSH 在不同皮膚層中的不同駐留行為，這為設(shè)計(jì)針對不同皮膚問題的護(hù)膚產(chǎn)品提供了科學(xué)依據(jù)。

盡管本研究取得了重要發(fā)現(xiàn)，但仍有一些局限性需要考慮。首先，本研究使用的豬皮膚模型與人類皮膚存在一定差異，盡管在很多研究中公認(rèn)豬皮膚是與人類的皮膚生理結(jié)構(gòu)最為接近的[9，10]，但也不能完成等同。因此，研究結(jié)果向人類皮膚的推廣需要注意不同皮膚之間的差異性。其次，研究僅評估了GSH 在短期內(nèi)的駐留行為，長期效果尚未明確。

GSH 對皮膚有多種攻效，為了實(shí)現(xiàn)這些功效，需要GSH 在皮膚表面和皮膚真皮層均有足夠的駐留量，并且要能在皮膚內(nèi)部持續(xù)足夠長的時(shí)間。目前的多數(shù)文獻(xiàn)研究主要是測定藥物在皮下接收液中透過量[11-13]，較少的研究同時(shí)測定皮膚中皮膚表面和皮膚真皮層中駐留量[14，15]。本研究以巴馬小香豬皮膚作為皮膚模型，同時(shí)測定GSH 在皮膚表面和皮膚真皮層中駐留量。該研究為開發(fā)能充分利用GSH 護(hù)膚功效的化妝品提供了一種新的研究途徑。

作者介紹

李和偉：博士，高級工程師，主要研究方向：化妝品和生物醫(yī)藥研究，

供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

代 穎、魏國志：供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

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