不同地理種群克氏原螯蝦形態(tài)差異及相關(guān)分子標(biāo)記研究

摘要：為了解我國克氏原螯蝦不同地理群體的種屬差異，加快克氏原螯蝦的育種進程，篩選與目標(biāo)性狀緊密相關(guān)位點的基因型進行分子輔助選育，選取安徽巢湖、江西鄱陽湖、山東微山湖、湖南洞庭湖、湖北洪湖、江蘇洪澤湖6個地區(qū)的克氏原螯蝦樣品，對全長、體長、體重、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹部長、腹部寬、尾扇長8個形態(tài)學(xué)指標(biāo)進行測量，以2個形態(tài)參數(shù)比進行多元分析；并根據(jù)標(biāo)記位點鑒定出的個體基因型，與測量到的形態(tài)指標(biāo)的差異進行生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，分析出克氏原螯蝦重要的經(jīng)濟性狀肌肉重、腹部寬、頭胸甲寬等和與之相關(guān)的標(biāo)記位點。聚類分析表明，6個地區(qū)的克氏原螯蝦分為2個分支，第1分支為巢湖群體和洪湖群體；鄱陽湖群體、微山湖群體、洞庭湖群體和洪澤湖群體構(gòu)成第2分支。主成分分析結(jié)果顯示，雌蝦的4個主成分累計貢獻率達85.10%，其中，第1和第2主成分分別是腹長因子和腹寬因子；雄蝦的4個主成分累計貢獻率達86.31%，第1和第2主成分分別為頭胸甲和腹部因子。判別分析中，雌性綜合判別率為82.16%，雄蝦為83.28%，判別率較高。關(guān)聯(lián)分析表明，14對分子標(biāo)記的連鎖不平衡共有105對SSR位點組合，滿足P<0.01的條件，14對SSR引物在168份克氏原螯蝦材料中存在連鎖不平衡，可與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析。采用一般線性模型對克氏原螯蝦種質(zhì)的6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀同SSR位點進行關(guān)聯(lián)分析，在P<0.01的閾值條件下，存在1組引物關(guān)聯(lián)多個性狀的情況，共檢測到30組引物對6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀呈極顯著關(guān)聯(lián)狀態(tài)。由此可以豐富克氏原螯蝦群體關(guān)聯(lián)位點的篩選，并在一定程度上為克氏原螯蝦種質(zhì)資源的保護和親本選育工作提供支持。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；形態(tài)差異；微衛(wèi)星標(biāo)記；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S968.22+9.12 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0203-11

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）別稱小龍蝦，屬于甲殼綱、十足目、螯蝦科，是一種能在淡水中穩(wěn)定生存并加以繁衍的生物［1］，在20世紀初被當(dāng)作牛蛙餌料從美國引進至日本，后又在20世紀中從日本傳入我國南京，并迅速擴散至我國大部分省份，在我國眾多湖泊水域中迅速繁衍［2-3］。因其肉質(zhì)松軟、營養(yǎng)全面、食療效果佳，而成為一種深受大眾消費和喜愛的餐桌美食，并且由于其頭部酶系統(tǒng)高效且發(fā)達［4］，所以在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用十分廣泛［5］，常用于制備乳液、脂質(zhì)體及微膠囊等運載體系［6］。在這種大背景下，小龍蝦養(yǎng)殖的經(jīng)濟收益顯著，前景十分廣闊，現(xiàn)已成為我國最具發(fā)展?jié)摿Φ酿B(yǎng)殖品種之一［7-8］。但其在養(yǎng)殖過程中對親本選育的重視性不足，未能很好地保護環(huán)境，造成野生種群數(shù)量的日益減少，品種資源保護不到位，種質(zhì)退化嚴重［9］，小龍蝦頭大尾小、含肉率低等［10］問題，均會影響到小龍蝦養(yǎng)殖市場的前景，從而影響小龍蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，迫切需要以野生種質(zhì)克氏原螯蝦種質(zhì)為研究對象，以關(guān)聯(lián)分析為主要方法，挖掘與性狀相關(guān)聯(lián)的基因位點，從而加速克氏原螯蝦的品種改良。

為達此目的，首先需要對我國現(xiàn)有的克氏原螯蝦群體進行鑒別，進而保護種質(zhì)資源合理利用。對于種質(zhì)資源鑒別，從業(yè)人員首先需要對我國存在的主要自然水域的天然群體進行形態(tài)差異性的鑒別。該方法直觀、簡單、快速，能非常有效地反映不同地理種群之間的差異［11］，并且容易被廣大從業(yè)人員所理解。國內(nèi)關(guān)于克氏原螯蝦形態(tài)學(xué)的研究已有較多的報道，張龍等利用通徑分析分析了影響克氏原螯蝦體重的若干因素，得出頭胸甲長是影響克氏原螯蝦體重的最大因素，其次是全長和頭胸甲寬，為克氏原螯蝦親本選擇和改良育種帶來了幫助［12］。田燦等采用形態(tài)學(xué)測量和地表點法分析江蘇、江西、湖北、上海和河南5個地區(qū)克氏原螯蝦形態(tài)差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過長時間地理隔離，各地區(qū)克氏原螯蝦遺傳分化較嚴重，不同地區(qū)各群體形態(tài)差異明顯，差異主要集中在頭胸甲和腹部，大大簡化了克氏原螯蝦生產(chǎn)選育過程中群體的鑒別［13］。徐濱等利用多元統(tǒng)計分析方法分析了盱眙、合肥、沅江、武漢、潛江和沙市6個克氏原螯蝦群體的10項生態(tài)學(xué)指標(biāo)，6個群體的形態(tài)參數(shù)差異顯著，并根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果分出潛江、沅江、武漢群體，沙市、合肥群體及盱眙群體3大分支群，盱眙龍蝦群體較其他群體遺傳距離較遠，可直接從形態(tài)上同其他群體進行區(qū)分［14］。但以上研究仍有一定局限性，如試驗方法單一及選點分布集中于單一或少數(shù)的省份，尚未就全國范圍內(nèi)典型水域的野生克氏原螯蝦群體開展研究。

其次，以往的研究表明，與生長相關(guān)的性狀（體質(zhì)量、體長等）是受微效多基因控制和環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀［15-17］。因此，尋找控制這些數(shù)量性狀的基因和標(biāo)記，建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，是縮短時代間隔、加快育種進展的有效方法之一，可提高克氏原螯蝦育種的速度和效率。微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、共顯性、穩(wěn)定性好等特點，已被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的性狀相關(guān)分子標(biāo)記篩選、QTL定位［18］、遺傳圖譜的構(gòu)建［19］、群體遺傳學(xué)、物種遺傳多樣性的研究［20］、疾病的檢測［21］及親本分析［22］等方面。許多研究有所涉及，如張義鳳等報道了鯉魚主要經(jīng)濟性狀相關(guān)的7個微衛(wèi)星標(biāo)記［16］。王洪哲等對24個微衛(wèi)星位點與鏡鯉主要經(jīng)濟性狀相關(guān)性進行分析［23］。孫新等共獲得4個與鏡鯉體質(zhì)量、體長相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記［24］。李建林等在30個微衛(wèi)星中發(fā)現(xiàn)位點GM041、UNH860、GM304的AA基因型及位點GM519的DE基因型可作為羅非魚以體質(zhì)量為選育目標(biāo)的輔助標(biāo)記［25］。但對克氏原螯蝦的相關(guān)分析較少，在分子生物學(xué)技術(shù)未成熟以前，研究者們對克氏原螯蝦的研究常集中在養(yǎng)殖、營養(yǎng)和病害方面［26］，而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，越來越多的研究人員開始利用微衛(wèi)星技術(shù)進行克氏原螯蝦遺傳多樣性的研究，如高楊等基于微衛(wèi)星標(biāo)記進行克氏原螯蝦種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析［27］；彭剛等利用SSR分析了安徽巢湖、江西鄱陽湖、江蘇洪澤湖3大淡水湖內(nèi)養(yǎng)殖的克氏原螯蝦遺傳多樣性［28］；費騰等利用SSR對比分析了洪澤湖、長江野生湖以及塘封閉水體內(nèi)養(yǎng)殖的克氏原螯蝦等［29］。但以上研究選點區(qū)域內(nèi)仍有一定局限性，如選點分布集中于單一或少數(shù)的省份，尚未就全國范圍內(nèi)典型水域的野生克氏原螯蝦群體開展研究。

關(guān)聯(lián)分析作為研究數(shù)量性狀行之有效的研究方法，是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，用于鑒定目標(biāo)表型性狀和具有特定功能的基因位點［30］。相較于QTL定位，關(guān)聯(lián)分析的精確度更高，耗時少、檢測廣度大，更重要的是可同時研究同一位點的多個等位基因的優(yōu)勢［31］，現(xiàn)已廣泛用于凡納濱對蝦［32］、草魚［33］、大西洋鮭魚等具有經(jīng)濟價值的水產(chǎn)物種［34］，皆已取得良好的效果，但在這方面對克氏原螯蝦的研究甚少。目前，水產(chǎn)生物的育種研究仍以傳統(tǒng)的選擇育種和雜交育種為主，分子標(biāo)記育種作為輔助育種手段，對于克氏原螯蝦也是如此，可快速找到同目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的基因或分子標(biāo)記，因而受到廣泛應(yīng)用，然而，其結(jié)果的準確性也受到多重因素的影響。其中，群體結(jié)構(gòu)是影響關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的重要因素，不同群體的混入會造成整個群體內(nèi)連鎖不平衡的強度增強，進而影響不連鎖的基因位點與性狀間的關(guān)聯(lián)，得出假陽性的結(jié)果。因此，群體結(jié)構(gòu)越簡單，關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果也更可靠［35］。此外，連鎖不平衡作為關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)，對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準確性同樣有影響，連鎖不平衡的結(jié)果受到遺傳漂變和自然選擇等因素的影響。

因此，本研究分別利用主成分分析、判別分析、聚類分析3種多元分析方法分析了6個不同地區(qū)克氏原螯蝦的形態(tài)差異；主成分分析可以判斷各種性狀指標(biāo)對群體的貢獻率，判別分析則可對不同的群體進行統(tǒng)一的分類；聚類分析可以明晰各群體的分支。本研究基于3種分析方法，對我國不同地理區(qū)域的群體克氏原螯蝦的差異性加以了解，同時可反映在長期地理隔離下，不同自然水域克氏原螯蝦的形態(tài)差異變化和彼此間的親緣關(guān)系；并且把體質(zhì)量、全長、體長、腹部長、頭胸甲長等相關(guān)性性狀作為克氏原螯蝦傳統(tǒng)育種的主要選擇依據(jù)，利用通過結(jié)合高通量測序信息綜合分析獲得的SSR分子標(biāo)記對這些性狀加以關(guān)聯(lián)，尋找關(guān)聯(lián)印記。本研究方法將是經(jīng)濟有效的用于輔助選擇、提高育種效率、加快育種進程的重要方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6組克氏原螯蝦野生群體分別采集自江蘇洪澤湖（HZH）、湖北洪湖（HH）、湖南洞庭湖（DTH）、山東微山湖（WSH）、安徽巢湖（CH）、江西鄱陽湖（PYH）的同一水系條件下，從捕撈的個體中挑選出形態(tài)大小相同、個體無明顯差異及健康無殘肢的蝦體作為研究對象，各組群體蝦的樣本量為30，為減少數(shù)據(jù)帶來的宏觀測量誤差，所有采集到的活體樣本就近完成采樣工作。

1.2 測量形態(tài)指標(biāo)與分析

1.2.1 形態(tài)指標(biāo)測量

使用測量工具對每尾克氏原螯蝦的7項指標(biāo)，包括全長、體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹部長、腹部寬和尾扇長，進行準確測量，并保證其測量結(jié)果精確值在0.01 cm（圖1）；用天平稱量每尾蝦體重、肝胰腺重、肌肉重3項重量指標(biāo)，稱量結(jié)果精確至0.01 g。

1.2.2 聚類分析

為科學(xué)合理地對比各野生群體生長性能、品質(zhì)優(yōu)劣，以盡可能消除不同蝦體規(guī)格、生長周期帶來的誤差干擾，待所有指標(biāo)數(shù)據(jù)測量統(tǒng)計完成后，采用多組次的2項性狀指標(biāo)比例參數(shù)作為衡量形態(tài)差異的主要依據(jù)，具體比例參數(shù)指標(biāo)見表1。測出的各項生長表型指標(biāo)，以群體作為單位區(qū)分，錄入Excel 2010軟件，然后利用Excel 2010軟件計算出各組各指標(biāo)的平均值，隨后進行聚類分析。聚類分析中的類別抽樣為層次聚類分析中的O型聚類，分析方法為歐氏距離最短系統(tǒng)距離法［36］。

1.2.3 主成分與判別分析

聚類分析中的12個數(shù)據(jù)指標(biāo)被劃分為能夠充分反映母系信息的相對獨立指標(biāo)，從而避免了變量之間存在的共線性問題。在進行分析前，為了消除各群體之間生長期不同導(dǎo)致的個體大小偏差影響，本研究利用SPSS 16.0軟件對6個種群的168個樣本數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗。以各自形態(tài)的相對變量之間的比值作為度量形式，繼續(xù)使用SPSS 16.0軟件對12個形狀的比例系數(shù)進行分析，以得到各自的特征值、主成分的貢獻率及累計貢獻率，從而來判斷出不同類群間的形態(tài)差異，分析出性狀對形態(tài)差異的影響［37］。

根據(jù)測定的參考指標(biāo)對群體進行分類，從而建立出判別函數(shù)，根據(jù)判別函數(shù)的樣品來源不同來進行分類，采用距離判別方法，判別準確率則是由樣品中判別正確的尾數(shù)占此群體實際尾數(shù)的百分比來進行判斷［38］。在群體中，綜合判別率為判別正確的尾數(shù)占實際尾數(shù)的比例。

1.3 基因型與關(guān)聯(lián)分析及遺傳效應(yīng)評估

總基因組DNA提取采用苯酚/三氯甲烷法［39］提取尾節(jié)組織的總基因組DNA，DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗純度，紫外分光光度計測定D260 nm和D280 nm濃度，合格的DNA稀釋濃度至50.00 ng/mL，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

參考GenBank已發(fā)表的微衛(wèi)星序列及本實驗室自行開發(fā)的微衛(wèi)星序列共14對（表2），正向引物的5′端FAM標(biāo)記委托無錫天霖生物有限公司加以合成。PCR反應(yīng)總體系為DNA模板 2.0 μL，Taq酶12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，最后加滅菌的超純水至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序為 94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃變性10 s，在最適退火溫度下退火10 s，72 ℃延伸15 s，30個循環(huán)；最后72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過ABI3730XL測序儀（美國ABI公司）進行毛細管電泳檢測，通過geneMarker軟件進行基因型分型。

本研究利用14對分子標(biāo)記、6項表型性狀數(shù)據(jù)和2項質(zhì)量性狀數(shù)據(jù)對供試的168尾克氏原螯蝦資源進行關(guān)聯(lián)分析，再根據(jù)判別分析篩選的主要變量進行具體分析。首先，利用Excel軟件對168尾克氏原螯蝦的擴增產(chǎn)物數(shù)據(jù)進行整理，使用Tassel 2.1軟件計算14個位點間的連鎖不平衡，使用SPSS 22.0軟件對基因型數(shù)據(jù)和生長數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)，分析采用一般線性模型（general linear model，GLM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 6個不同地理群體外形指標(biāo)分析及其聚類分析

外形指標(biāo)分析通過比較不同個體間的外形指標(biāo)差異，達到區(qū)分雌雄個體的作用。對于克氏原螯蝦而言，雌雄個體在腹部、頭胸甲部存在明顯的差異。為探明6個不同群體的雌雄克氏原螯蝦外形指標(biāo)間的差異性，對6個不同地區(qū)的雌雄蝦體形態(tài)參數(shù)進行了測量，由表3可知，雌雄個體存在多項指標(biāo)參數(shù)相同的情況，如A2頭胸甲長/體長、A3頭胸甲寬/體長、A4腹部長/體長、A5腹部寬/體長、A6尾扇長/體長、A11肌肉重/體重、A12肝胰腺重/體重。A8腹部寬/頭胸甲寬在各群體中均出現(xiàn)雌性>雄性的現(xiàn)象；A10腹部長/腹部寬則相反，呈現(xiàn)雄性>雌性的現(xiàn)象。由以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌雄克氏原螯蝦個體在體態(tài)區(qū)別最明顯的特征呈現(xiàn)在腹部。

聚類分析可很好地辨別不同群體的分支和來源，對于群體的溯源有著重要的作用。為了探明6個群體的來源分支情況，本研究對6個群體進行聚類分析，從而為物種遺傳多樣性的保護提供價值。由圖2可知，雌雄6個群體可分為2個主要分支，第1分支為巢湖群體和洪湖群體，其間形態(tài)差異較??；第2分支則較為復(fù)雜，先由遺傳距離最短的鄱陽湖群體和微山湖群體聚為一類，然后再同洞庭湖群體相聚類，最后與洪澤湖群體聚類，4個群體共同聚為一支。鄱陽湖群體和微山湖群體相似度更近于分支內(nèi)的其他群體。洪澤湖群體相較鄱陽湖群體和微山湖群體有著較遠的遺傳距離，其間形態(tài)差異較大。鄱陽湖群體和微山湖群體相近度更近于分支內(nèi)的其他群體。第1分支與第2分支聚類，反映了分支內(nèi)群體間最遠的遺傳距離。聚類分析表明，6個不同水域群體的形態(tài)不同，地理區(qū)域的差異也如此。

2.2 主成分與判別分析

主成分分析可研究判斷出各種主成分的貢獻率，選擇出對物種影響較大的幾項外形指標(biāo)，可在一定程度上為育種提供一定參考借鑒。為探究出對克氏原螯蝦影響最大的外形指標(biāo)， 本研究以6個不同水域克氏原螯蝦野生種群的形態(tài)參數(shù)為材料進行主成分分析，獲得了方差貢獻率最大的4個主成分因子。由表4可知，各組成部分對應(yīng)的特征值和累計貢獻率，雌蝦和雄蝦4個主成分的累計貢獻率分別為85.10%和86.31%。雌蝦、雄蝦4個主成分的累積貢獻率較高，包含了大部分的變異相關(guān)信息，可作為獨立因子反映不同地區(qū)克氏原螯蝦野生種群的形態(tài)特征。

雌雄群體主成分特征值及累計貢獻率存有差異。就雌蝦而言，雌蝦的第1主成分特征值為4.17，方差貢獻率42.30%，其中，起主要作用的指標(biāo)是腹部長/腹部寬（A10），反映了克氏原螯蝦的腹部特征，稱為腹長因子；第2主成分的特征值為2.12，方差貢獻率23.32%，起主要作用的是腹部寬/頭胸甲寬（A8），稱為腹寬因子；第3主成分的主要作用是頭胸甲長/頭胸甲寬（A9），稱為頭胸甲因子；第4主成分主要反映腹部長/體長（A4）。雄蝦的第1主成分特征值為3.97，方差貢獻率39.14%，起主要作用的是頭胸甲長/頭胸甲寬（A9）、頭胸甲長/體長（A2），鮮明地反映了頭胸甲特性。第2主成分特征值2.17，方差貢獻率24.64%，起主要作用的是腹部長/體長（A4）、腹部長/腹部寬（A10），反映克氏原螯蝦的腹部特性。第3主成分主要作用是頭胸甲長/體長（A2）。第4主成分主要反映腹部長/體長（A4）。根據(jù)以上論述，由此發(fā)現(xiàn)，腹部長、腹部寬、頭胸甲長、頭胸甲寬、體長可作為區(qū)分不同群體克氏原螯蝦的重要指標(biāo)依據(jù)。此外，雌蝦因獨特的生理特征，尾扇部位作為抱卵場所，較為發(fā)達，可作為區(qū)分雌性群體的重要指標(biāo)。雄性個體螯足更發(fā)達，體重可作為區(qū)分群體的重要指標(biāo)。

由表5可知，6組雌蝦群體中，第1主成分貢獻率最高的是洪湖群體（39.17%），最低的是洪澤湖群體（35.72%）；4個主成分累計貢獻率最高的是鄱陽湖群體（88.36%），最低的是洪澤湖群體（83.12%）。雄蝦群體中，第1主成分貢獻率最高的是洞庭湖群體（38.14%），最低的是洪澤湖群體（34.18%）；4個主成分累計貢獻率最高的是微山湖群體（87.64%），最低的是洪澤湖群體（85.16%）。

F檢驗判別分析結(jié)果表明，群體判別分析的結(jié)果均較好（P<0.01）。從12項性狀比值中篩選出用于區(qū)分不同野生克氏原螯蝦群體的幾個主要變量，其中對雌性群體具有顯著貢獻的有A1、A7、A8、A9、A10 5 項變量，這5個變量群體的判別準確率高，判別效果良好，具有顯著性意義。對雄性群體則篩選出了A1、A7、A9、A10、A11 5 組變量，以此5組變量建立起的判別方程用于判別雄性群體的效果較好。通過代入雌雄各5組性狀的數(shù)值到判別方程中，即可確定相應(yīng)個體所對應(yīng)的群體。由表6可知，雌性群體中判別率最高的是洪澤湖群體（89.92%），最低的是微山湖群體（73.28%），綜合判別率83.16%；雄性群體中，判別率最高的是洞庭湖群體（92.14%），最低的是巢湖群體（72.18%），綜合判別率87.28%。

2.3 一般線性模型分析及性狀比值指標(biāo)與標(biāo)記位點的關(guān)聯(lián)分析

由表7可知，本研究采用一般線性模型對克氏原螯蝦種質(zhì)的6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀同SSR位點進行關(guān)聯(lián)分析，在P<0.01的閾值條件下，存在1組引物關(guān)聯(lián)多個性狀的情況，共檢測到30組引物對6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀呈極顯著關(guān)聯(lián)狀態(tài)。其中，體長性狀與5組引物呈極顯著關(guān)聯(lián)，5組引物分別是PCLG02、PCLG10、PCLG27、Transcript1和Transcript4024，是關(guān)聯(lián)引物數(shù)目最多的性狀；全長、腹部長、腹部寬、肌肉重4個性狀分別與4組引物相關(guān)聯(lián)；體重、頭胸甲長、頭胸甲寬3個性狀同3組引物相關(guān)聯(lián)。

為更精確地得到性狀與標(biāo)記位點的關(guān)聯(lián)性，消除生長周期等外在物理條件因素對關(guān)聯(lián)結(jié)果造成的影響，本研究根據(jù)判別分析篩選的5組變量，特采用2項生長性狀的比值作為衡量指標(biāo)進行位點關(guān)聯(lián)性的分析。在P<0.01的條件下，同樣存在1組標(biāo)記與多組性狀比值指標(biāo)有關(guān)聯(lián)，共檢測出40組引物與6項比值性狀指標(biāo)有極顯著關(guān)聯(lián)，其中，肌肉重/體質(zhì)量（A11）有著最多關(guān)聯(lián)標(biāo)記數(shù)量，達到12組，分別為PCLG02、PCLG08、PCLG10、PCLG13、PCLG27、PCLG33、PCLG48、Transcript1、Transcript2011、Transcript4024、Transcript8060、Transcript13127。其余5項指標(biāo)分別是全長/體長（A1）、頭胸甲寬/體長（A3）、腹部寬/體長（A5）、頭胸甲長/頭胸甲寬（A9）、腹部長/腹部寬（A10），與這些比值性狀相關(guān)聯(lián)的引物見表8。就已得出的標(biāo)記和性狀間的關(guān)聯(lián)性，以克氏原螯蝦最含經(jīng)濟價值的肌肉重、腹寬、頭胸甲寬性狀而言，肌肉重/體重這項比值指標(biāo)與PCLG02、PCLG08、PCLG10、PCLG28、PCLG33、PCLG48、Transcript8060、Transcript13130這些引物標(biāo)記極顯著相關(guān)。腹部寬/頭胸甲寬這項指標(biāo)與PCLG10、PCLG48、Transcript8060這些標(biāo)記極顯著相關(guān)。

2.4 6個群體Hardy-Weinberg平衡分析和連鎖不平衡檢驗

連鎖不平衡（LD）作為關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)，反映了同一染色體上或不同染色體間不同基因座等位基因非隨機關(guān)聯(lián)的結(jié)果，其結(jié)果水平反映了連鎖的緊密程度，連鎖越緊密相應(yīng)所需的分子標(biāo)記就越少［40］。14對分子標(biāo)記的連鎖不平衡共有105對SSR位點組合，從分析結(jié)果來看，滿足P<0.01的條件，所選用的14對SSR引物在168份克氏原螯蝦材料中存在連鎖不平衡，可與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析。將所有標(biāo)記的基因型進行Hardy-Weinberg平衡分析，由表9可知，沒有1對位點在6個群體中均符合哈代溫伯格平衡，各位點在各群體中均存在明顯哈代溫伯格平衡偏離現(xiàn)象。其中，PCLG10位點僅在2個群體中存在哈達溫伯格平衡偏離，其余13對標(biāo)記位點均在2個以上群體的基因型分布偏離Hardy-Weinberg平衡，已知所取的14對位點基因型純合率較高，表明標(biāo)記位點內(nèi)存在嚴重的雜合子缺失現(xiàn)象，同時各群體間近親雜交的現(xiàn)象明顯，須采取適當(dāng)措施以防止野生種資源生物多樣性降低。

對6組克氏原螯蝦群體進行連鎖不平衡檢測，共檢測到59個基因座位對，其中，巢湖群體和洪澤湖群體均存在6個連鎖座位對的不平衡狀態(tài)，鄱陽湖群體是連鎖座位對處于不平衡狀態(tài)最少的群體，僅為2對，同時，各個群體處于不平衡狀態(tài)時相應(yīng)的連鎖座位對并不相同。對于整個群體而言，一共檢測到9個連鎖座位對處于不平衡狀態(tài)。

3 討論

多元分析方法已被廣泛用于遺傳變異的研究，并已取得較好的效果。國內(nèi)很多學(xué)者采用了多元分析方法進行魚蝦蟹類的分析，其中，包括對日本沼蝦［41-42］、凡納濱對蝦種群［43］、日本對蝦［44］、中國白蝦［45］、中華絨螯蟹［46］、青蝦［45］和大黃魚［47］等的形態(tài)分析研究，但對克氏原螯蝦的形態(tài)學(xué)的分析較少。在少數(shù)對克氏原螯蝦形態(tài)分析的研究中，田燦等基于圖像識別對5個不同產(chǎn)地克氏原螯蝦進行了形態(tài)差異分析［13］。而本研究則是通過3種多元分析方法，深入研究大家涉及較少且更大范圍的克氏原螯蝦群體，去更加細致地分析不同群體克氏原螯蝦的差異及在不同自然水域中群體呈現(xiàn)的形態(tài)差異。

聚類分析方法可對不同群體進行初步的分類，聚類之間距離則表現(xiàn)為不同群體親緣關(guān)系的遠近［48］。本研究顯示，所挑選的6組克氏原螯蝦群體在形態(tài)差異上均產(chǎn)生一定的變異，可從形態(tài)上進行一定的區(qū)分。從聚類的結(jié)果來看，巢湖群體和洪湖群體形狀差異最小，親緣關(guān)系相近，相互集為一支，棲息在共同的長江水域下不受地理隔離障礙的影響。鄱陽湖、微山湖、洞庭湖和洪澤湖最后再聚為一支。聚類結(jié)果表明，長江中游棲息的克氏原螯蝦群體與其他水系群體的親緣關(guān)系不近，同時本次聚類顯示的洪澤湖群體、微山湖群體、鄱陽湖群體的聚類結(jié)果與地理分布并不一致，可能與克氏原螯蝦近些年來養(yǎng)殖規(guī)模日益龐大，不同屬地的克氏原螯蝦以苗種或成蝦的形式銷售進入其他水域環(huán)境中，當(dāng)?shù)氐乃w環(huán)境為克氏原螯蝦代代繁衍提供了條件。

主成分分析方法利用多個變量進行線性變換，創(chuàng)造出一些代表性的因子變量，各因子變量間相關(guān)性較低，通過少數(shù)變量代替原先多變量［49］，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物的形態(tài)分析，成果顯著。如韓曉磊等應(yīng)用主成分分析反映了克氏原螯蝦和東北螯蝦身體寬度形態(tài)變化［50］。本研究的主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹部長、腹部寬、頭胸甲寬、體長是對6組群體形態(tài)影響最大的性狀因子。頭胸甲作為攝食部位，腹部作為游泳運動部位，承擔(dān)克氏原螯蝦的大部分生命活動，同時受環(huán)境影響。食物作為生物生長不可或缺的條件，在食物獲取不充足時，野生克氏原螯蝦為了尋找更多的食物［51］會發(fā)生同性相殘的現(xiàn)象，發(fā)生了不同程度的優(yōu)勝劣汰，全長較長的個體更容易得以保留。這4項形狀指標(biāo)作為分析形狀中進化速度相對較快的性狀，可用于辨別群體。此外，本研究將所有重要指標(biāo)按體長劃分進行校對改正，分開對雌雄群體進行處理，避免誤差。其中，影響雌蝦的性狀主要是腹長、腹部和體長，而影響雄蝦則是頭胸甲寬、腹部寬和體長。此結(jié)果與6個種群中雄性的胸甲寬度/體長指數(shù)（A3）均大于雌性的結(jié)果一致。同時，對雌蝦來說，尾扇長度也對形態(tài)有一定的影響，雄蝦的體重也對自身形態(tài)有一定影響。

另一種通過觀察樣本數(shù)據(jù)建立線性函數(shù)的群體鑒定方法為判別分析。以構(gòu)建的線性函數(shù)，計算單因子F值的大小，完成對未知樣品的初步分類［52-53］。本研究得到的連鎖不平衡水平較低，有效的連鎖不平衡對數(shù)僅占全部位點組合的13.26%。連鎖不平衡水平較低，可能是個體間出現(xiàn)近親雜交引起有效重組率較低；另外標(biāo)記數(shù)量的覆蓋范圍不足，留下較大的空白遺傳距離也會對結(jié)果準確性產(chǎn)生影響。未來隨著高通量測序的進一步發(fā)展，在此基礎(chǔ)上，評估衰減率達到增加標(biāo)記覆蓋率的效果，可促進精準定位［54］。

各數(shù)量性狀間常會表現(xiàn)出某種特定的關(guān)聯(lián)性。就[CM（21]本研究而言，對來自6個地區(qū)的168尾克氏原螯蝦自然群體進行表型性狀和品質(zhì)性狀的調(diào)查和測定，采用SSR標(biāo)記對所選個體進行分子標(biāo)記的分析，對供試樣本的多個生長性狀與相關(guān)標(biāo)記進行關(guān)聯(lián)分析，尋找生長性狀的可靠相關(guān)位點，根據(jù)之前報道過的結(jié)合本實驗室自行開發(fā)的14對克氏原螯蝦SSR分子標(biāo)記，在168份樣品中共檢測到等位基因124個，各群體不同標(biāo)記位點的等位基因數(shù)（Na）在3～14，有效等位基因數(shù)在1.00～5.16，平均期望雜合度為0.81，平均多態(tài)信息含量分布在0.42～0.59，證明所選的引物多態(tài)性較高，同時選用試驗材料遺傳多樣性豐富。對所有克氏原螯蝦樣本的SSR位點進行關(guān)聯(lián)分析，檢測到多對標(biāo)記與克氏原螯蝦生長相關(guān)聯(lián)，如PCLG02、PCLG08、PCLG10、PCLG13、PCLG27、PCLG33、PCLG48、Transcript1、Transcript2011、Transcript4024、Transcript8060、Transcript13127，同時存在1組標(biāo)記與多對生長性狀相關(guān)聯(lián)，充分闡釋了多基因共顯性作用，可為選擇性選育工作提供參考。另外，在同一組標(biāo)記下，不同基因型的個體對自身生長性狀也會產(chǎn)生影響。

因此了解到克氏原螯蝦體重與體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹部長呈極顯著正相關(guān)，出現(xiàn)這種表型性狀的相關(guān)性可能與某個基因的多效性或控制不同性狀的基因緊密連鎖造成。本研究中，檢測到多組1對標(biāo)記控制多對性狀如PCLG02同時與體重、體長、肌肉這3組性狀相關(guān)聯(lián)。除此，各生長性狀之間也有一定的關(guān)聯(lián)性。腹部寬和體長之間有關(guān)聯(lián)性，PCLG27同時控制這2組性狀；頭胸甲長和體長這2組性狀則由Transcript4024控制?？梢姡嚓P(guān)性狀之間的遺傳關(guān)聯(lián)性在本研究中得到了進一步的證實，在育種過程中，利用關(guān)聯(lián)標(biāo)記進行輔助性選擇，有助于實現(xiàn)多性狀的遺傳改良［55］。

本研究綜合利用3種方法，通過聚類分析將相同地理來源的克氏原螯蝦群體分為一類，根據(jù)聚類分析的結(jié)果，6個群體的克氏原螯蝦群體被分為2個分支，證明了不同地區(qū)的克氏原螯蝦種質(zhì)具有遺傳差異。遺傳結(jié)構(gòu)分析和主成分分析表現(xiàn)出相同的分類趨勢，證明相同來源的種質(zhì)群體具有較近的親緣關(guān)系，而根據(jù)形態(tài)學(xué)表觀測量數(shù)據(jù)結(jié)果，可直觀對生長指標(biāo)進行研判，進行親本選育過程中的初步篩選。但由于目前有關(guān)克氏原螯蝦的關(guān)聯(lián)分析研究還很空白，本研究中標(biāo)記顯著關(guān)聯(lián)到的生長性狀還沒有在其他文獻中報道，因此，仍需進一步分析本研究結(jié)果的準確性。因為涉及關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的還有許多，未來可對更大的群體數(shù)據(jù)及多年多點的數(shù)據(jù)進一步研究以提高關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準確性。另外，本研究采用了線性研究方法進行性狀的關(guān)聯(lián)分析方法，比較直觀簡單，但不能估計QTL的具體位置，鑒于此，采用2種分析方法相結(jié)合的策略，提高克氏原螯蝦性狀標(biāo)記分析的精確性和準確性，進一步為育種工作提供幫助。

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資助項目：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費資助項目（編號：2022XT01）；江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項目（編號：JBGS〔2021〕123）；中央級基本科研業(yè)務(wù)費（編號：2021JBFM21）。

作者簡介：高 楊（1997—），男，安徽銅陵人，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種。E-mail：1463455739@qq.com。

通信作者：蘇勝彥，博士，研究員，主要從事蝦蟹遺傳育種研究，E-mail：ouhaicourse@hotmail.com；朱 健，碩士，研究員，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究，E-mail：zhuj@ffrc.cn。