解淀粉芽孢桿菌PB-1對(duì)灰葡萄孢的抑菌機(jī)理

摘要：為篩選灰葡萄孢（Botrytis cinerea）高效生防菌株，對(duì)解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株P(guān)B-1從抑菌譜、發(fā)酵液的抑菌作用、抗生素合成基因PCR檢測(cè)、揮發(fā)性物質(zhì)（VOC）的抑菌作用、離體葉片防效幾個(gè)方面進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，PB-1的抑菌譜較廣，對(duì)8種供試植物病原菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，其中對(duì)灰葡萄孢（B. cinerea）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）、大斑凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum） 4種病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率分別為63.5%、70.7%、63.4%、56.0%。PB-1發(fā)酵液不僅對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)具較強(qiáng)抑制作用（20%濃度發(fā)酵液抑菌率達(dá)96.6%，受抑制菌絲腫脹扭曲、原生質(zhì)外滲、分枝異常），而且對(duì)分生孢子萌發(fā)也具有強(qiáng)烈抑制作用?？股睾铣苫騊CR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PB-1擴(kuò)增出srfAB、ituA基因片段，這說(shuō)明PB-1能夠產(chǎn)生表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturins）脂肽類(lèi)抗生素。PB-1揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)也具有明顯抑制作用。此外，小白菜品種上海青離體葉片防病效果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PB-1能明顯抑制灰葡萄孢的侵染。本研究結(jié)果表明，PB-1有作為植物灰霉病生物防治菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；灰葡萄孢；抑菌機(jī)制；抑菌率；菌絲生長(zhǎng)；孢子萌發(fā)；離體葉片防效

中圖分類(lèi)號(hào)：S476；S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）16-0149-06

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是葡萄孢屬（Botrytis）中最具破壞力的病原菌，引起番茄、草莓、玫瑰等多種農(nóng)業(yè)、園藝植物的灰霉病，在世界范圍內(nèi)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)100億～1 000億美元［1］。由于灰葡萄孢寄主的廣泛性，侵染及繁殖方式的多樣性等原因，導(dǎo)致灰霉病非常難于防治［2］。目前，化學(xué)防治仍然是灰霉病的有效防治途徑，但是殺菌劑的過(guò)度使用引發(fā)殺菌劑抗藥性［3-4］、環(huán)境污染、人類(lèi)健康和食品安全［5］等諸多問(wèn)題。因此，生產(chǎn)上亟需開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型、低毒低殘留、高防效的生防菌劑來(lái)用于灰霉病的防治。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種重要的生防細(xì)菌，具廣譜抑菌活性［6］，對(duì)植物病害生物防治具有重要意義［7］。解淀粉芽孢桿菌生防機(jī)制主要包括產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，如表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturins）、豐原素（fengycin）等脂肽類(lèi)抗生素，以及幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶等抗菌蛋白［8］；誘導(dǎo)植物抗病性［9］；以及產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)（volatile organic compounds，VOC） ［10］。盧彩鴿等報(bào)道解淀粉芽孢桿菌菌株MH71能夠產(chǎn)生嗜鐵素、蛋白酶等物質(zhì)，菌株發(fā)酵液對(duì)番茄離體葉片、果實(shí)灰霉病具有較好的防治效果［11］。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，分離自海洋沉積物的解淀粉芽孢桿菌SH-B74發(fā)酵液產(chǎn)生環(huán)狀脂肽plipastatin A1，對(duì)灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)具有較好的抑制作用［12］。明確生防新菌株的作用機(jī)制，對(duì)微生物殺菌劑領(lǐng)域具有積極的意義。目前，對(duì)于灰霉病的防治，大部分生防菌劑的研究是在條件可控的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，大田實(shí)際應(yīng)用效果并不太理想［13］。菌株P(guān)B-1為筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株具較好抑菌效果的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)PB-1的抑菌譜、抑菌機(jī)理及離體葉片生防效果進(jìn)行研究，即利用平板對(duì)峙方法檢測(cè)抑菌譜，含藥固體平板法及凹玻片法檢測(cè)PB-1發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的抑制作用，雙皿對(duì)扣法檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性，PCR檢測(cè)抗生素合成相關(guān)基因，以及離體葉片法檢測(cè)PB-1對(duì)灰葡萄孢的防效。研究結(jié)果將為深入評(píng)價(jià)PB-1對(duì)灰霉病的生防潛力及菌株進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

本研究中所用解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）PB-1、灰葡萄孢（B. cinerea）、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、大斑凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、粉紅聚端孢（Trichothecium roseum） 、榆樹(shù)間座殼菌（Diaporthe eres），均由河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院植物病理學(xué)研究室提供。植物病原真菌和PB-1的活化和保存，以及平板測(cè)定試驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂粉 15 g/L）；PB-1發(fā)酵采用LB培養(yǎng)基（Tryptone 10 g/L、Yeast Extract 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH值7.0），各類(lèi)培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃滅菌20 min備用。

1.2 PB-1的抑菌譜測(cè)定

2022年2月于河南省河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展以下相關(guān)試驗(yàn)。以灰葡萄孢（B. cinerea）、禾谷鐮孢（F. graminearum）、禾谷絲核菌（R. cerealis）、新月彎孢霉（C. lunata）、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、大斑凸臍蠕孢（E. turcicum）、粉紅聚端孢（T. roseum）及榆樹(shù)間座殼菌（D. eres）共8種病原為靶標(biāo)病原菌，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)方法測(cè)定PB-1抑菌活性。各病原菌接種于PDA平板，24 ℃培養(yǎng)1～5 d，PB-1接種于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)24 h。距PDA平板（直徑90 mm）邊緣2 cm處劃線(xiàn)接種PB-1，另一側(cè)（與PB-1中心距5 cm）接種直徑 5 mm 病原菌菌絲塊。以不接種PB-1為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。將各平板置于 24 ℃ 培養(yǎng)直至對(duì)照長(zhǎng)滿(mǎn)平板為止，逐日觀察并測(cè)量各病原菌菌落半徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑菌率=（對(duì)照菌落半徑－處理菌落半徑）/（對(duì)照菌落半徑-2.5 mm）×100%。

1.3 PB-1發(fā)酵液的抑菌作用

1.3.1 發(fā)酵液的制備

PB-1接種PDA平板，28 ℃ 培養(yǎng)24 h后，接種環(huán)蘸取1環(huán)至裝有1.5 mL LB的EP管（規(guī)格2.0 mL）中，置于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h作為種子液。種子液以1%（體積比，下同）接種量接種至裝有99 mL LB的三角錐形瓶（規(guī)格250 mL）中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng) 12 000 r/min 離心10 min，上清液分別經(jīng)0.45、0.22 μm 濾膜過(guò)濾得PB-1發(fā)酵液，置于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

采用含藥固體平板法［14］測(cè)定發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。即PB-1發(fā)酵液以20%的比例與40～50 ℃ PDA培養(yǎng)基混合均勻，分裝于直徑90 mm 培養(yǎng)皿，20 mL/皿，制成含藥固體平板。以L(fǎng)B培養(yǎng)基與PDA混合制平板為對(duì)照。各處理5次重復(fù)?；移咸焰呔杲臃N于PDA平板置于24 ℃培養(yǎng) 2 d 后，取菌落邊緣菌絲塊（直徑 5 mm）接種各處理平板中心處，置24 ℃培養(yǎng)，2 d后測(cè)量各平板菌落直徑。

1.3.3 發(fā)酵液濃度與抑菌活性的關(guān)系測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定發(fā)酵液濃度與抑菌活性的關(guān)系。將PB-1發(fā)酵液分別以終濃度1.25%、2.50%、5.00%、10.00%和20.00%與PDA混合制平板，以添加相應(yīng)比例的LB培養(yǎng)基為對(duì)照，平板中心接種5 mm菌絲塊，每處理3次重復(fù)。將各平板置24 ℃培養(yǎng) 2 d，逐日測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-5 mm）×100%。

1.3.4 發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制作用

采用凹玻片法測(cè)定PB-1發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的抑制作用。將20 μL不同稀釋倍數(shù) PB-1 發(fā)酵液與20 μL孢子液（濃度1×104個(gè)/mL）混合滴加凹玻片，使發(fā)酵液終稀釋倍數(shù)分別為2倍、4倍、8倍、20倍、40倍，即20 μL發(fā)酵液+ 20 μL孢子液，10 μL發(fā)酵液+10 μL無(wú)菌水+ 20 μL孢子液，5 μL發(fā)酵上清液+ 15 μL無(wú)菌水+ 20 μL孢子液，2 μL發(fā)酵上清液+ 18 μL無(wú)菌水+ 20 μL孢子液，1 μL發(fā)酵上清液+ 19 μL無(wú)菌水+ 20 μL孢子液。以添加20 μL無(wú)菌水處理為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。24 ℃培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)鏡檢200個(gè)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率＝（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%。

1.3.5 PB-1 脂肽類(lèi)抗生素合成基因的PCR檢測(cè)

采用110F/110R、ituA1F/ituA1R 、FenB1F/FenB1R 3對(duì)引物分別擴(kuò)增表面活性素srfAB、伊枯草菌素ituA和豐原素fenB基因片段（表1）。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min（35個(gè)循環(huán)）；72 ℃延伸 10 min，16 ℃保溫5 min。PCR采用25 μL反應(yīng)體系：細(xì)菌基因組DNA（50 ng/μL）1.0 μL，10× PCR Buffer（10 mmol/mL）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）0.5 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 19.75 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)片段擴(kuò)增情況，目標(biāo)片段回收后送公司測(cè)序，并用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 PB-1揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性測(cè)定

采用雙皿對(duì)扣法［17］測(cè)定PB-1揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性。試驗(yàn)設(shè)置提前48 h接種和同時(shí)接種2個(gè)處理，提前48 h接種處理即PDA平板先接種 PB-1，28 ℃培養(yǎng)48 h后，去掉培養(yǎng)皿皿蓋，上扣接種灰葡萄孢菌絲塊（直徑5 mm）的PDA平板，透明膠帶密封對(duì)扣處；同時(shí)接種處理即同時(shí)將接種PB-1的平板與接種灰葡萄孢的平板對(duì)扣，以空白PDA平板與接種灰葡萄孢PDA平板對(duì)扣為對(duì)照（CK）。各處理重復(fù)3次。將各處理平板置24 ℃培養(yǎng)2 d后，測(cè)量灰葡萄孢菌落直徑。

1.5 PB-1對(duì)灰葡萄孢侵染的抑制作用

采用離體葉片接種法測(cè)定PB-1對(duì)灰葡萄孢侵染的抑制作用。用0.1% 吐溫-20溶液配制 PB-1 濃度分別為108、107、106、105、104 CFU/mL的細(xì)菌懸浮液，小白菜品種上海青離體葉片用1%的NaClO表面消毒1 min，無(wú)菌水沖洗2次，自然晾干后，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的搪瓷盤(pán)中。將不同濃度的PB-1細(xì)菌懸浮液均勻噴灑葉片，以只噴0.1% 吐溫-20溶液為對(duì)照，待葉片晾干后，接種灰葡萄孢菌絲塊（直徑 5 mm）。每張葉片2塊菌絲塊，每個(gè)處理3張葉子，3次重復(fù)。搪瓷盤(pán)覆保鮮膜保濕，置于24 ℃培養(yǎng)3 d，逐日觀察葉片發(fā)病情況，并測(cè)量病斑直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB-1抑菌譜

由表2可知，PB-1對(duì)8種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均具有明顯抑制作用，抑菌率為34.5%～70.7%。PB-1對(duì)新月彎孢霉、灰葡萄孢、大斑凸臍蠕孢的抑制作用較強(qiáng)，菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為70.7%、63.5%、63.4%，對(duì)禾谷鐮孢、禾谷絲核菌的抑制作用次之，抑制率分別為56.0%、42.0%，對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用最弱，抑菌率為34.5%，各處理之間存在顯著差異（P<0.05）。

2.2 PB-1發(fā)酵液的抑菌作用

2.2.1 發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)和形態(tài)的影響

由圖1-A可知，PB-1對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)存在明顯的抑制作用，培養(yǎng)2 d后，對(duì)照組灰葡萄孢菌落直徑為63.7 mm，而發(fā)酵液處理的菌落直徑為 7 mm，兩者之間存在極顯著差異（P<0.01），菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)96.6%。乳酸酚棉藍(lán)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，對(duì)照菌絲生長(zhǎng)正常，菌體飽滿(mǎn)且著色均勻（圖1-B）；而發(fā)酵液處理菌絲生長(zhǎng)受阻，表現(xiàn)為菌絲扭曲腫脹，細(xì)胞球狀膨大，原生質(zhì)外滲，著色不均勻（圖1-C）。

2.2.2 發(fā)酵液濃度與抑菌活性關(guān)系

PB-1發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，隨著PDA培養(yǎng)基中PB-1發(fā)酵液濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。由圖2可知，當(dāng)PB-1發(fā)酵液濃度為從1.25%增加到10.00%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)抑菌率從14.2%上升到80.8%，發(fā)酵液濃度為20%時(shí)，抑菌率最高，達(dá)93.3%。發(fā)酵液濃度對(duì)數(shù)（x）與抑菌率概率值（y）之間呈顯著正相關(guān)（y=2.238 7x+3.444 0，r2=0.916 2，P<0.05）。

2.2.3 發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的影響

由表3可知，PB-1發(fā)酵液對(duì)孢子萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用。24 ℃下培養(yǎng)12 h后，PB-1不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液處理對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)抑制率之間存在顯著差異。2×稀釋液、4×稀釋液及8×稀釋液處理均未觀察到灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)，抑制率均為100%；而20×稀釋液、40×稀釋液抑制作用較弱，孢子萌發(fā)抑制率分別僅為5.4%、2.5%。

2.2.4 PB-1脂肽類(lèi)抗生素合成基因的PCR檢測(cè)

利用3對(duì)引物，分別對(duì)解淀粉芽孢桿菌PB-1脂肽類(lèi)抗生素合成基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，從PB-1中擴(kuò)增出srfAB、ituA基因片段（圖3），將基因片段測(cè)序BLAST比對(duì)分析結(jié)果表明，從PB-1中擴(kuò)增的srfAB基因片段序列與B. amyloliquefaciens菌株WS-8（CP018200.1）、B. velezensis菌株WLYS23（CP055160.1）等的相似性均為99%，ituA基因片段序列與B. amyloliquefaciens菌株WS-8（CP018200.1）、B. velezensis菌株WLYS23（CP055160.1）、B. subtilis菌株OFE17 ituA合成酶基因（MT957085.1）等的序列相似性均為100%；而fenB基因片段未擴(kuò)增出。由此可見(jiàn)，PB-1可以產(chǎn)生表面活性素、伊枯草菌素等脂肽類(lèi)抗生素。

2.3 PB-1 揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性

由圖4可知，PB-1揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。2d后，對(duì)照菌落直徑為57.5 mm，PB-1與灰葡萄孢同時(shí)接種處理菌落直徑為58 mm，兩者之間無(wú)顯著差異；而PB-1提前48 h 接種處理菌落直徑為35.2 mm，與對(duì)照之間存在顯著差異。

2.4 PB-1對(duì)灰葡萄孢侵染的抑制作用

由圖5可知，PB-1對(duì)灰葡萄孢侵染存在明顯的抑制作用。對(duì)照處理（0 CFU/mL）葉片病斑平均直徑為11.7 mm，1×104 CFU/mL處理為10.2 mm，1×105 CFU/mL處理為8.0 mm，1×106 CFU/mL處理為7.0 mm，1×107 CFU/mL處理為5.3 mm，而 1×108 CFU/mL處理抑制效果最好，病斑直徑為3.2 mm；統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，各處理之間存在顯著差異。

3 討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌抑菌活性物質(zhì)豐富，可防治多種植物病害。2010—2020年全球新登記微生物農(nóng)藥活性成分統(tǒng)計(jì)表明，解淀粉芽孢桿菌為新登記較多的一種芽孢桿菌［18］。盧彩鴿等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌MH71抑菌譜廣泛，對(duì)鐮刀病菌、灰霉病菌、大白菜黑腐病菌、黃瓜細(xì)菌性角斑病菌等多種植物病原菌具較強(qiáng)抗菌活性［11］。本研究結(jié)果表明，PB-1除了對(duì)B. cinerea具有較強(qiáng)抑制作用外，對(duì)新月彎孢霉（C. lunata）、大斑凸臍蠕孢（E. turcicum）和禾谷鐮刀菌（F. graminearum）均有較好的抑制作用，這說(shuō)明PB-1具有廣譜抗菌活性，具有較好的應(yīng)用前景。

解淀粉芽孢桿菌生防機(jī)制多樣［8］。劉人萱等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌FS6可濕性粉劑對(duì)人參灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均表現(xiàn)明顯的抑制作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，PB-1發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)96.6%，被抑制菌絲出現(xiàn)著色不均勻、腫脹扭曲、分枝異常、原生質(zhì)外滲等現(xiàn)象，且發(fā)酵液濃度對(duì)數(shù)與菌絲生長(zhǎng)抑制率概率值間呈顯著正相關(guān)。PB-1發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)也具有較強(qiáng)的抑制作用。PB-1發(fā)酵液2×、4×及8×稀釋液處理，分生孢子均不萌發(fā)?；颐共≈饕苑稚咦幼鳛樘镩g病害的初侵染和再侵染來(lái)源，PB-1發(fā)酵液對(duì)菌絲和分生孢子的較強(qiáng)抑制作用，說(shuō)明其具有較好的生防潛力。劉超等從解淀粉芽孢桿菌BA-26發(fā)酵液抑菌譜較廣，抗真菌活性物質(zhì)抑制灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，導(dǎo)致菌絲分枝異常、菌絲膨大畸形，并從中分離純化到11個(gè)抑菌活性組分［20］。朱弘元等發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B15可以產(chǎn)生iturin A、fengycin［21］。本研究結(jié)果表明，PB-1可以產(chǎn)生表面活性素、伊枯草菌素等脂肽類(lèi)物質(zhì)。下一步，還需要采用高效液相色譜（UPLC）與質(zhì)譜（LC-MS）檢測(cè)對(duì)PB-1的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗生素類(lèi)型分析，以便更好地挖掘PB-1的生防潛力。細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOC）主要是通過(guò)一種間接機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性（ISR），在真菌病原體的生物防治中具有重要作用［22］。解淀粉芽孢桿菌NJN-6產(chǎn)生VOC抑制香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)［10］。Gotor-Vila 等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CPA-8 VOC不僅抑制灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)，并對(duì)櫻桃果實(shí)產(chǎn)孢抑制率達(dá)100%［23］。本研究揮發(fā)性物質(zhì)抑菌試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，PB-1 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。下一步，還需對(duì)PB-1揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢侵染抑制效果進(jìn)行檢測(cè)，以期將其應(yīng)用于果蔬采后灰霉病的防治。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7不僅可以降低葡萄采后灰霉病的發(fā)病率、病變直徑和腐爛指數(shù)，而且提高了葡萄多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶等抗性相關(guān)酶的活性［24］。本研究離體葉片接種試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)PB-1對(duì)灰葡萄孢的侵染具有明顯的抑制作用。隨著PB-1濃度的提高，病斑直徑明顯減小。下一步還需開(kāi)展盆栽和大田防效試驗(yàn)，以評(píng)估PB-1田間應(yīng)用潛力。

生防細(xì)菌具有復(fù)雜的生防機(jī)理，因此明確其作用機(jī)制對(duì)于生防菌劑的成功應(yīng)用非常重要。本研究已初步明確PB-1的生防機(jī)理，該菌株具有廣譜抗菌活性，產(chǎn)生多樣抗菌物質(zhì)及揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，并對(duì)灰葡萄孢侵染具有明顯抑制作用。本研究結(jié)果顯示，PB-1具有良好的灰霉病生防應(yīng)用前景。Salvatierra-Martinez等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌菌株BBC047在番茄葉片上產(chǎn)生強(qiáng)大生物膜，有助于其空間競(jìng)爭(zhēng)能力的提高［25］。因此，下一步還需展開(kāi)PB-1生物膜形成能力及植物表面定殖能力的研究，以期為PB-1的田間應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Boddy L. Pathogens of autotrophs：the fungi［M］. 3rd ed. London：Academic Press，2016：245-292.

［2］Elad Y，Pertot I，Cotes Prado A M，et al. Plant hosts of Botrytis spp.［M］//Fillinger S，Elad Y. Botrytis：the fungus，the pathogen and its management in agricultural systems. Berlin Heidelberg：Springer International Publishing，2016：413-486.

［3］Walker A S，Micoud A，Rémuson F，et al. French vineyards provide information that opens ways for effective resistance management of Botrytis cinerea （grey mould）［J］. Pest Management Science，2013，69（6）：667-678.

［4］Hahn M.The rising threat of fungicide resistance in plant pathogenic fungi：Botrytis as a case study［J］. Journal of Chemical Biology，2014，7（4）：133-141.

［5］Komárek M，C[DD（-*1][HT6]ˇ[DD）]adková E，Chrastny V，et al. Contamination of vineyard soils with fungicides：a review of environmental and toxicological aspects［J］. Environment International，2010，36（1）：138-151.

［6］王繼華，徐世強(qiáng)，張木清. 解淀粉芽孢桿菌的研究進(jìn)展［J］. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2017，13（3）：191-195.

［7］劉小玉，付登強(qiáng). 解淀粉芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］. 中國(guó)果菜，2022，42（8）：81-84.

［8］趙月盈. 解淀粉芽孢桿菌抗病機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2021，17（3）：205-210.

［9］Rahman A，Uddin W，Wenner N G. Induced systemic resistance responses in perennial ryegrass against Magnaporthe oryzae elicited by semi-purified surfactin lipopeptides and live cells of Bacillus amyloliquefaciens［J］. Molecular Plant Pathology，2015，16（6）：546-558.

［10］Yuan J，Raza W，Shen Q R，et al. Antifungal activity of Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 volatile compounds against Fusarium oxysporum f. sp. cubense［J］. Applied and Environmental Microbiology，2012，78（16）：5942-5944.

［11］盧彩鴿，張殿朋，劉 霆，等. 解淀粉芽胞桿菌MH71的生防活性及脂肽類(lèi)抗生素基因檢測(cè)［J］. 植物保護(hù)，2015，41（3）：12-18.

［12］Ma Z W，Hu J C.Plipastatin A1 produced by a marine sediment-derived Bacillus amyloliquefaciens SH-B74 contributes to the control of gray mold disease in tomato［J］. 3Biotech，2018，8（2）：125.

［13］Rana H，Marc F，Carlos C，et al. Modes of action for biological control of Botrytis cinerea by antagonistic bacteria［J］. Phytopathologia Mediterranea，2016，55（3）：301-322.

［14］陳長(zhǎng)卿，鍺逸軒，謝 昭，等. 生物殺菌劑對(duì)煙草鐮刀菌根腐病的防治效果及農(nóng)藝性狀的影響［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，47（6）：41-46.

［15］Joshi R，McSpadden Gardener B B. Identification and characterization of novel genetic markers associated with biological control activities in Bacillus subtilis［J］. Phytopathology，2006，96（2）：145-154.

［16］Cao Y，Xu Z H，Ling N，et al. Isolation and identification of lipopeptides produced by B. subtilis SQR 9 for suppressing Fusarium wilt of cucumber［J］. Scientia Horticulturae，2012，135：32-39.

［17］Zhong T，Wang Z R，Zhang M，et al. Volatile organic compounds produced by Pseudomonas fluorescens ZX as potential biological fumigants against gray mold on postharvest grapes［J］. Biological Control，2021，163：104754.

［18］劉 芳，方 偉，王月瑩，等. 2010—2020年全球新登記的主要活體微生物農(nóng)藥活性成分與啟示［J］. 農(nóng)藥，2021，60（7）：469-474.

［19］劉人萱，張小蕊，王 睿，等. 生防菌劑對(duì)人參灰霉病菌的抑制作用及田間防控效果［J］. 菌物研究，2021，19（3）：191-196.

［20］劉 超，劉洪偉，汪步青，等. 解淀粉芽孢桿菌 BA-26 抗菌物質(zhì)分離及對(duì)灰葡萄孢抑菌作用研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（7）：83-89.

［21］朱弘元，康 健，范 昕，等. 解淀粉芽孢桿菌B15 產(chǎn)脂肽的分離鑒定及抑菌機(jī)理［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：186-189.

［22］Sharifi R，Ryu C M. Are bacterial volatile compfAu6LHoeG9U6JpvnrVojBw==ounds poisonous odors to a fungal pathogen Botrytis cinerea，alarm signals to Arabidopsis seedlings for eliciting induced resistance，or both？［J］. Frontiers in Microbiology，2016，7：196.

［23］Gotor-Vila A，Teixidó N，di Francesco A，et al. Antifungal effect of volatile organic compounds produced by Bacillus amyloliquefaciens CPA-8 against fruit pathogen decays of cherry［J］. Food Microbiology，2017，64：219-225.

［24］Zhou Q X，F(xiàn)u M R，Xu M H，et al. Application of antagonist Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7 against Botrytis cinerea in postharvest Red Globe grapes［J］. Food Science & Nutrition，2020，8（3）：1499-1508.

［25］Salvatierra-Martinez R，Arancibia W，Araya M，et al. Colonization ability as an indicator of enhanced biocontrol capacity—An example using two Bacillus amyloliquefaciens strains and Botrytis cinerea infection of tomatoes［J］. Journal of Phytopathology，2018，166（9）：601-612.

基金項(xiàng)目：河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專(zhuān)項(xiàng)（科技攻關(guān)）（編號(hào)：222102110266、232102111016）；河南科技學(xué)院高層次人才科研項(xiàng)目（編號(hào)：103020222001/025）。

作者簡(jiǎn)介：楊 蕊（1980—），女，河南新鄉(xiāng)人，博士，講師，從事植物病理學(xué)及植物病害生物防治方面的研究。E-mail：yrui2017@hist.edu.cn。

通信作者：陸寧海，博士，副教授，從事植物病害分子流行學(xué)和生物防治研究。E-mail：gsninghai@163.com。