小麥花藥液體漂浮培養(yǎng)體系優(yōu)化及黃淮麥區(qū)高花藥培養(yǎng)力基因型篩選

摘要：為進(jìn)一步優(yōu)化和提高小麥單倍體誘導(dǎo)效率，以中麥895、鄭麥7698、萬(wàn)豐269等為材料，研究不同低溫預(yù)處理時(shí)間、胚狀體共培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基附加成分對(duì)小麥花藥液體漂浮培養(yǎng)體系的影響，并利用該體系對(duì)42份黃淮麥區(qū)小麥品種（系）的花藥培養(yǎng)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，小麥花藥培養(yǎng)效率隨著低溫預(yù)處理時(shí)間呈先上升后下降的趨勢(shì)，處理1～5 d時(shí)培養(yǎng)效率最佳；胚狀體共培養(yǎng)時(shí)間與綠苗分化率間呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，共培養(yǎng)25～35 d轉(zhuǎn)出胚狀體的綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率較高，隨后逐漸降低，55 d后基本喪失綠苗分化能力；培養(yǎng)基附加成分對(duì)花藥培養(yǎng)效率的影響同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，添加3 mg/L AgNO3或60 mmol/L山梨醇能有效提高胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率，AgNO3效果優(yōu)于山梨醇。42份黃淮麥區(qū)小麥品種（系）的花藥培養(yǎng)特性差異明顯，篩選出鄭麥0856、徐麥856、鄭麥1354、鄭麥1936、周麥32、鄭麥6687和07H508等7個(gè)高花藥培養(yǎng)力材料。本研究結(jié)果可為小麥單倍體育種提供參考依據(jù)，篩選的高花藥培養(yǎng)力基因型在黃淮麥區(qū)單倍體育種、DH群體構(gòu)建或遺傳轉(zhuǎn)化研究等方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：小麥；液體漂浮培養(yǎng)；低溫預(yù)處理；共培養(yǎng)時(shí)間；培養(yǎng)基附加成分；綠苗產(chǎn)率；基因型

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.103.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）16-0087-07

單倍體育種技術(shù)自20世紀(jì)70年代以來(lái)廣泛用于小麥育種中，在國(guó)內(nèi)外已育成百余個(gè)小麥品種，在生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用［1］。小麥單倍體植株可以通過(guò)花藥培養(yǎng)、小孢子培養(yǎng)和小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交法等途徑獲得，其中花藥培養(yǎng)是最主要的途徑之一［2-7］。小麥花藥培養(yǎng)受基因型、接種時(shí)期、脫分化培養(yǎng)基及其附加成分、培養(yǎng)條件等多種因素的影響，其中基因型是主要限制因子［8］。趙林姝等對(duì)74個(gè)冬小麥品種（系）進(jìn)行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)基因型間差異明顯，存在基因型依賴性［9］。宋運(yùn)賢等研究表明，低溫預(yù)處理2 d后愈傷組織誘導(dǎo)率最高，有利于花藥培養(yǎng)［10］。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入適量的山梨醇或AgNO3有利于提高愈傷組織分化率和綠苗率［11-12］。小麥花藥脫分化培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、浸潤(rùn)式培養(yǎng)、液體漂浮培養(yǎng)等，研究表明液體培養(yǎng)能夠得到更多的愈傷組織和綠苗，可有效提高小麥花藥培養(yǎng)效率［13］。目前，Broughton等利用小麥花藥液體培養(yǎng)體系，每年可產(chǎn)生2萬(wàn)余株花粉植株［14-15］。Lantos等建立一套適于匈牙利冬小麥的花藥液體培養(yǎng)體系，可用于大規(guī)模生產(chǎn)DH植株［16］。國(guó)內(nèi)，趙林姝等采用花藥液體漂浮培養(yǎng)體系取得了較好的效果，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)白苗增多的現(xiàn)象［17-19］。因此，不斷完善優(yōu)化花藥培養(yǎng)體系，篩選農(nóng)藝性狀優(yōu)良且高花藥培養(yǎng)力親本材料，對(duì)提高小麥花藥培育工作有重要的意義。本研究擬通過(guò)對(duì)低溫預(yù)處理時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)基附加成分進(jìn)行優(yōu)化，并利用優(yōu)化后的體系對(duì)42份黃淮麥區(qū)小麥品種（系）進(jìn)行花藥培養(yǎng)特性鑒定，評(píng)價(jià)、篩選高花藥培養(yǎng)力親本材料，以期為黃淮麥區(qū)小麥的單倍體育種及相關(guān)研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中麥895、鄭麥7698、萬(wàn)豐269、鄭麥9023、百農(nóng)207等5個(gè)品種用于培養(yǎng)體系的優(yōu)化，于2020年9月盆栽于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院10號(hào)日光溫室，溫度白天22～25 ℃、夜晚18～20 ℃，光—暗周期為 18 h—6 h，適時(shí)澆水施肥和防治病蟲(chóng)害。鄭麥0856、鄭麥0943、鄭麥9134、鄭麥6687、新麥26、中麥895、鄭麥7698、鄭麥366、鄭麥9023等42份黃淮麥區(qū)小麥品種（系），于2020年10月12日種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地試驗(yàn)地，行長(zhǎng)2 m，行距0.2 m，手鋤開(kāi)溝撒播，每份材料種植2行，常規(guī)田間管理。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法

選取小孢子發(fā)育至單核中晚期的小麥幼穗，將穗子剝出后，用70%乙醇消毒 2 min，再用2%次氯酸鈉滅菌15～20 min，無(wú)菌水沖洗3次備用。分別將花藥接種于甘露醇預(yù)處理培養(yǎng)基上，子房接種到液體培養(yǎng)基上（參照Broughton等的培養(yǎng)基［14］），置于25 ℃暗培養(yǎng)5 d后將預(yù)處理后的花藥接種于含子房的液體培養(yǎng)基，（25±1） ℃暗培養(yǎng)直至出現(xiàn)胚狀體；將直徑為1～2 mm的胚狀體轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基中，（25±1） ℃，16 h光照/8 h黑暗進(jìn)行分化培養(yǎng)2～3周。參照以下公式計(jì)算花藥培養(yǎng)特性相關(guān)指標(biāo)［17］：胚狀體誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生的胚狀體/接種花藥數(shù)）×100%；綠苗分化率=（產(chǎn)生的綠苗數(shù)/轉(zhuǎn)分化胚狀體）×100%；綠苗產(chǎn)率=（產(chǎn)生的綠苗數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%；白苗分化率=（產(chǎn)生的白苗數(shù)/轉(zhuǎn)分化胚狀體）×100%；白苗產(chǎn)率=（產(chǎn)生的白苗數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

低溫預(yù)處理時(shí)間篩選。選取中麥895、鄭麥7698、萬(wàn)豐269、鄭麥9023和百農(nóng)207的適期幼穗，錫箔紙包裹插入盛有純凈水的燒杯中，4 ℃冰箱分別處理1、2、3、5、7、9 d，以未經(jīng)低溫處理（0 d）的幼穗為對(duì)照，篩選適宜的低溫處理時(shí)間。每個(gè)品種處理5穗，每穗接種花藥60枚。

胚狀體最佳培養(yǎng)時(shí)間篩選。選取中麥895、鄭麥7698、萬(wàn)豐269、鄭麥9023和百農(nóng)207的適期幼穗接種，將共培養(yǎng)25、30、35、40、45、50、55、60 d的胚狀體（1～2 mm）轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選最佳的培養(yǎng)時(shí)間。每個(gè)品種處理5穗，每穗接種花藥60枚。

適宜附加成分篩選。選取新麥26的適期幼穗，在現(xiàn)有液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的硝酸銀和山梨醇等附加成分，對(duì)比胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率等，篩選最佳的附加成分和濃度。每種處理5穗，每穗接種花藥60枚。

硝酸銀濃度設(shè)計(jì)：0、2、3、4、5、6 mg/L。

山梨醇濃度設(shè)計(jì)：0、20、40、60、80、100 mmol/L。

黃淮麥區(qū)小麥品種（系）花藥特性評(píng)價(jià)。利用優(yōu)化的體系（低溫預(yù)處理3 d+4 mg/L AgNO3），對(duì)42份黃淮麥區(qū)小麥品種（系）的花藥培養(yǎng)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。每份材料處理5穗，每穗接種花藥60枚。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行多重比較分析（最小顯著差異，LSD法）、相關(guān)性分析及回歸分析，使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行平均值計(jì)算及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)小麥花藥培養(yǎng)特性的影響

低溫預(yù)處理對(duì)5個(gè)小麥品種花藥培養(yǎng)特性的影響各不相同（表1）。中麥895和百農(nóng)207的胚狀體誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)，萬(wàn)豐269則呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，3個(gè)品種幼穗低溫預(yù)處理3 d胚狀體誘導(dǎo)率最高；鄭麥7698和鄭麥9023的胚狀體誘導(dǎo)率雖然也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但其最大值出現(xiàn)在低溫預(yù)處理5 d，且與對(duì)照差異極顯著；鄭麥7698、萬(wàn)豐269、鄭麥9023和百農(nóng)207等4個(gè)品種幼穗低溫預(yù)處理3 d的綠苗分化率均顯著或極顯著高于對(duì)照，達(dá)到最大值，中麥895在低溫預(yù)處理5d綠苗分化率最大值，與對(duì)照差異顯著；中麥895、萬(wàn)豐269和百農(nóng)207等3個(gè)品種幼穗低溫預(yù)處理3 d的綠苗產(chǎn)率均極顯著高于對(duì)照且達(dá)到最大值，鄭麥7698和鄭麥9023低溫預(yù)處理5 d的綠苗產(chǎn)率達(dá)到最大值，與對(duì)照差異極顯著；鄭麥7698和百農(nóng)207的幼穗經(jīng)低溫預(yù)處理的白苗分化率和白苗產(chǎn)率均呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì)，其余3個(gè)品種則各不相同。中麥895幼穗低溫預(yù)處理9 d產(chǎn)生的白苗極顯著高于對(duì)照，萬(wàn)豐269幼穗低溫預(yù)處理1、2、3、9 d產(chǎn)生的白苗極顯著高于對(duì)照，其他各處理與對(duì)照差異均不顯著。綜合比較低溫預(yù)處理對(duì)小麥品種花藥培養(yǎng)特性的影響發(fā)現(xiàn)，在低溫預(yù)處理 1～5 d時(shí)能獲得較好的花藥液體漂浮培養(yǎng)效果，適當(dāng)?shù)牡蜏仡A(yù)處理有利于胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率的提高。

2.2 胚狀體培養(yǎng)時(shí)間對(duì)小麥花藥綠苗分化率的影響

由圖1可知，基因型間差異導(dǎo)致品種間胚狀體的發(fā)育速度不同，液體共培養(yǎng)期間胚狀體轉(zhuǎn)出起始時(shí)間雖略有差異，但總體上綠苗分化率隨著共培養(yǎng)時(shí)[CM（21]間的延長(zhǎng)大致呈下降趨勢(shì)。在共培養(yǎng)25～35d之間，中麥895、鄭麥7698和萬(wàn)豐269的綠苗分化率整體保持在相對(duì)較高的水平，鄭麥9023和百農(nóng)207在共培養(yǎng)30 d轉(zhuǎn)出胚狀體的綠苗率也高于其他時(shí)間。除鄭麥7698外，其余4個(gè)品種的綠苗分化率在共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到55 d后趨近于0。

由表2相關(guān)性分析結(jié)果可知，綠苗分化率與共培養(yǎng)時(shí)間之間存在顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。綜合比較不同時(shí)間轉(zhuǎn)出的胚狀體綠苗分化率變化趨勢(shì)，可以發(fā)現(xiàn)胚狀體轉(zhuǎn)出的最佳時(shí)間為25～35 d。由于不同品種胚狀體發(fā)育速度不同，轉(zhuǎn)出的起始時(shí)間不同。

2.3 附加成分對(duì)小麥花藥培養(yǎng)特性的影響

由圖2可知，隨著培養(yǎng)基中AgNO3濃度的增加，胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中，當(dāng)添加3 mg/L AgNO3時(shí)，胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率都達(dá)到最大值，分別為333.33%、7.20%和24.45%。白苗分化率則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，當(dāng)添加 3 mg/L AgNO3時(shí)，白苗分化率最低，為11.04%，與添加4 mg/L AgNO3的結(jié)果無(wú)顯著差異。

胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率隨著培養(yǎng)基中山梨醇濃度的增加整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，白苗分化率則呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)（圖3）。當(dāng)添加60 mmol/L山梨醇時(shí)，胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率均達(dá)到最大值，分別為178.33%、3.09%、5.55%，白苗分化率也相對(duì)較低（19.18%）。添加100 mmol/L山梨醇時(shí)的白苗分化率最低（17.88%），但胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率也均處于較低的水平。

綜合比較不同濃度AgNO3和山梨醇處理后品種的花藥培養(yǎng)特性，發(fā)現(xiàn)AgNO3的最佳濃度為 3 mg/L，山梨醇的最佳濃度為60 mmol/L，且培養(yǎng)基中添加AgNO3的效果明顯優(yōu)于山梨醇。

2.4 黃淮麥區(qū)小麥品種（系）花藥培養(yǎng)特性評(píng)價(jià)

利用優(yōu)化的小麥花藥液體漂浮培養(yǎng)體系對(duì)42份黃淮麥區(qū)小麥品種或高代品系進(jìn)行花藥特性評(píng)價(jià)。在供試的42份材料中，13份無(wú)胚狀體產(chǎn)生，占供試材料總數(shù)的30.95%，分別為12H356、鄭麥9188、鄭麥1926、鄭麥1905、鄭麥2008、鄭麥6694、存麥5號(hào)、存麥8號(hào)、存麥21、艾麥24、太學(xué)12、昌麥20和濟(jì)麥44（表3）。其他29份材料可誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，誘導(dǎo)率在9.24%～443.33%之間，平均值為126.66%，基因型間胚狀體誘導(dǎo)率存在差異。其中鄭麥0989的胚狀體誘導(dǎo)率最高，為443.33%，其次為漯麥40，為436.00%，鄭麥2018最低。

在29份產(chǎn)生胚狀體的材料中，綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率分布范圍分別為0～33.78%和0～61.67%，平均值分別為8.61%和15.09%，材料間差異明顯（表3）。綠苗分化率低于10%的材料有14份，占可產(chǎn)生胚狀體材料的48.28%，綠苗分化率高于20%的材料有8個(gè)，其中鄭麥6687的綠苗分化率最高（33.78%），其次為周麥32、07H508、鄭麥1936、濟(jì)麥22、徐麥856、鄭麥0856和鄭麥1354。綠苗產(chǎn)率低于10%的材料有10份，占可產(chǎn)生胚狀體材料的34.48%，綠苗產(chǎn)率高于20%的材料有12個(gè)，其中徐麥856的綠苗產(chǎn)率最高，為61.67%。參考趙林姝等將同時(shí)在愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率上分別達(dá)到 12% 、20% 及 8% 以上作為具有高培養(yǎng)力的標(biāo)準(zhǔn)［9］，篩選出鄭麥0856、徐麥856、鄭麥1354、鄭麥1936、周麥32、鄭麥6687和07H508等7個(gè)高培養(yǎng)力材料。

與綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率類(lèi)似，各材料間白苗分化率和白苗產(chǎn)率也表現(xiàn)出明顯差異（表3）。29份材料中，白苗分化率和白苗產(chǎn)率分布范圍分別為4.31%～53.00%和 0.96%～173.33%，平均值為17.56%和31.60%。白苗分化率大于10%的材料有27個(gè)，眾麥1號(hào)的白苗分化率最高（53.00%），其次為鄭麥2016、周麥27、07H508和鄭麥0989，而鄭麥2001和漯麥40的白苗分化率較低（表3）。白苗產(chǎn)率大于10%的材料有25個(gè)，鄭麥0989的白苗產(chǎn)率最高（173.33%），其次為鄭麥9189、周麥27、眾麥1號(hào)、鄭麥2016和周麥22，而鄭麥2018、鄭麥2001、鄭麥6687和濟(jì)麥22的白苗產(chǎn)率較低。

3 結(jié)論與討論

多數(shù)研究結(jié)果認(rèn)為，低溫預(yù)處理有利于提高小麥花藥培養(yǎng)效率［10］。本研究對(duì)黃淮麥區(qū)的5個(gè)冬小麥品種進(jìn)行低溫預(yù)處理時(shí)間篩選，結(jié)果顯示，適當(dāng)?shù)牡蜏仡A(yù)處理有利于提高品種的胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率，低溫預(yù)處理的最佳時(shí)間因基因型的不同而存在差異，如中麥895、萬(wàn)豐269和百農(nóng)207等3個(gè)品種低溫預(yù)處理3 d效果最佳，鄭麥7698和鄭麥9023則低溫預(yù)處理5 d的效果最佳，低溫預(yù)處理1～5 d時(shí)所有研究材料均能獲得較好的花藥液體漂浮培養(yǎng)效果。該結(jié)果與楊雪等使用固體培養(yǎng)基的研究結(jié)果［20］基本一致，但與同樣使用液體培養(yǎng)基的趙林姝等的結(jié)果［17］不一致，分析可能是由于所選材料的類(lèi)型和基因型的效應(yīng)導(dǎo)致的。該結(jié)果為解決實(shí)際工作中，使用花藥液體漂浮培養(yǎng)體系因接種能力的限制導(dǎo)致的當(dāng)天取樣材料不能及時(shí)進(jìn)行接種的問(wèn)題提供了參考。

崔國(guó)惠等的研究表明，小麥愈傷組織的綠苗分化率隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，最佳轉(zhuǎn)愈時(shí)間為接種后30～50 d內(nèi)，可以獲得更多綠苗［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，花藥脫分化過(guò)程中使用液體培養(yǎng)基時(shí)，共培養(yǎng)25～35 d時(shí)小麥綠苗分化率能夠保持在相對(duì)較高的水平。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，在液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加3 mg/L AgNO3或 60 mmol/L 山梨醇時(shí)，胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率均達(dá)到最佳，最佳濃度與前人的研究結(jié)果略有不同［11-12］。

基因型依賴性是限制小麥花培技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要因素之一，本研究利用優(yōu)化的體系對(duì)42個(gè)黃淮麥區(qū)品種的花藥培養(yǎng)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明不同基因型間胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率、綠苗產(chǎn)率、白苗分化率和白苗產(chǎn)率均差異明顯，與王煒等的研究結(jié)果［1，9，18］一致。與前人研究結(jié)果比較分析，發(fā)現(xiàn)鄭麥7698、濟(jì)麥22的愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率均高于文獻(xiàn)中報(bào)道的數(shù)據(jù)［18］，說(shuō)明本研究采用的花藥液體漂浮培養(yǎng)體系具有較好的效果。

花培育種中單純根據(jù)農(nóng)藝性狀配置的雜交組合往往不能獲得理想的愈傷組織誘導(dǎo)，韓曉峰等認(rèn)為親本之一具有較高的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率或較高的花藥培養(yǎng)配合力是提高小麥花培育種的關(guān)鍵［22］。篩選農(nóng)藝性狀優(yōu)良和培養(yǎng)力強(qiáng)的小麥基因型作為花藥培養(yǎng)的橋梁親本，可以有效提高花藥培養(yǎng)育種效率［8，23］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者相繼篩選出石4185、邯6172、河農(nóng)6425、新春9號(hào)、H307、寧春4號(hào)、定豐12號(hào)、隴春27號(hào)等高培養(yǎng)力材料，并用于單倍體育種工作［1，9，24］。本研究篩選出鄭麥0856、徐麥856、鄭麥1354、鄭麥1936、周麥32、鄭麥6687和07H508等7個(gè)高花藥培養(yǎng)力材料，其胚狀體誘導(dǎo)率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率均較高，且綜合性狀優(yōu)良，在單倍體育種、基因定位或遺傳轉(zhuǎn)化等方面均具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：222102110076）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金（編號(hào)：2020YQ39）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2022ZC73）。

作者簡(jiǎn)介：王永霞（1982—），女，河南修武人，博士，助理研究員，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：wangyongxia005@163.com。

通信作者：胡 琳，博士，研究員，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：hulin209@163.com。