水產(chǎn)源芽孢桿菌抑菌活性、對(duì)抗菌藥物和消毒劑耐受性的研究

摘要：為篩選出具有抑菌性，且對(duì)抗菌藥物和水體消毒劑具有耐受性的優(yōu)良益生菌，通過牛津杯法測(cè)定了24株水源芽孢桿菌對(duì)常見6株水產(chǎn)病原菌［溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus） VA1株和VA2株，副溶血弧菌（V. parahaemolyticus，VP）、哈維氏弧菌（V. harveyi，VH）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）］的抑菌活性；運(yùn)用K-B紙片法探究了24株芽孢桿菌對(duì)6種常用水產(chǎn)抗菌藥物（多西環(huán)素、氟苯尼考、新霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和復(fù)方新諾明）的敏感性；并采用稀釋涂布法測(cè)試了24株芽孢桿菌對(duì)8種常用水產(chǎn)消毒劑（聚維酮碘溶液、戊二醛苯扎溴銨溶液、復(fù)合碘溶液、苯扎溴銨溶液、濃戊二醛溶液、過硫酸氫鉀、漂白粉和高錳酸鉀）的耐受性。結(jié)果表明：體外抑菌試驗(yàn)中，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis） BV1、BV2、BV3對(duì)6種致病菌均表現(xiàn)出顯著的抑制作用；藥敏試驗(yàn)中，10株芽孢桿菌（BV1、BT1、BS2、BS4、BS6、BS9、BS10、BH3、BC1和BA1）均對(duì)新霉素耐藥；消毒劑耐受性試驗(yàn)中，大多數(shù)的菌株對(duì)特效改底王、漂白粉以及高錳酸鉀的常規(guī)消毒劑量顯示出耐受性，但是聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛的常規(guī)消毒劑量對(duì)菌株都有一定的抑制效果。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，選取BV1作為5種具有抑制效果的消毒產(chǎn)品的定量試驗(yàn)菌株，結(jié)果顯示，高濃度的消毒劑會(huì)嚴(yán)重影響芽孢桿菌的活性，對(duì)于貝萊斯芽孢桿菌BV1來說，聚維酮碘、戊二醛和苯扎溴銨和濃戊二醛的消毒濃度不超過 2 mg/L；復(fù)合碘和苯扎溴銨的消毒濃度不超過1 mg/L。水產(chǎn)源的貝萊斯芽孢桿菌BV1有較強(qiáng)的抗病原菌能力，對(duì)抗菌藥物有一定耐藥性，對(duì)常見的消毒產(chǎn)品抗性較好，可以作為潛在益生菌株用于后續(xù)水產(chǎn)益生菌制劑的開發(fā)利用。此外，常用消毒劑用于水體潑灑的劑量最好不要超過建議使用劑量，以防影響益生菌的活性。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)動(dòng)物；芽孢桿菌；病原菌；抗菌藥物；消毒產(chǎn)品；抗性

中圖分類號(hào)：S917.1；S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）15-0187-08

收稿日期：2023-08-23

基金項(xiàng)目：江蘇省政策引導(dǎo)類計(jì)劃（蘇北科技專項(xiàng)）（編號(hào)：SZ-LYG202133）；江蘇省高等學(xué)?；A(chǔ)科學(xué)（自然科學(xué)）研究面上項(xiàng)目（編號(hào)：22KJB240001）；江蘇省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（編號(hào)：HS2020003）；江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：孫云貴（1998—），男，山西晉中人，碩士研究生，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫研究。E-mail：Sunyungui@outlook.com。

通信作者：高迎莉，博士，講師，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫研究。E-mail：yingli.gao@jou.edu.cn。

我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在過去幾十年里取得了驚人的發(fā)展。1978—2021年間，中國(guó)的人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品總產(chǎn)量從332.3萬t增長(zhǎng)至5 394.1萬t，增長(zhǎng)幅度巨大；2021年的養(yǎng)殖水產(chǎn)品總產(chǎn)量更是占據(jù)了全球水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量的60%以上，對(duì)全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)作出了巨大貢獻(xiàn)［1-2］。然而，隨著產(chǎn)量的增加，疾病防控和環(huán)保等方面也面臨著諸多挑戰(zhàn)。

目前，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖主要通過抗生素來預(yù)防和治療水產(chǎn)疾病。但抗生素的大量使用，會(huì)導(dǎo)致抗生素耐藥菌株的產(chǎn)生，這些抗生素耐藥菌還可能將耐藥質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移給有益菌和其他細(xì)菌，使其攜帶抗生素耐藥質(zhì)粒，致使抗生素抑菌和殺菌效果越來越弱的同時(shí)，還會(huì)對(duì)人類健康和環(huán)境安全產(chǎn)生不利的影響［3］。近年來，為了防止抗生素的濫用，我國(guó)對(duì)水產(chǎn)抗生素的使用要求變得愈發(fā)嚴(yán)格。2022年3月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好2023年水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖技術(shù)推廣“五大行動(dòng)”工作的通知》中提到“骨干基地要實(shí)現(xiàn)用藥量、特別是抗生素使用量同比持續(xù)降低”。翌年6月，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部又發(fā)布《夏季水產(chǎn)技術(shù)指引》，規(guī)定“不得向池塘潑灑抗生素，不得低劑量?jī)?nèi)服抗生素預(yù)防疾病，不得使用違禁藥物；嚴(yán)格遵循《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1號(hào)、2號(hào)》中規(guī)定水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物?！币虼?，為了踐行發(fā)展環(huán)境友好型水產(chǎn)養(yǎng)殖，尋找高效且綠色的抗生素替代品迫在眉睫。

益生菌作為水產(chǎn)病害防控管理中抗生素替代的策略之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中備受關(guān)注［4］。20世紀(jì)80年代，芽孢桿菌（Bacillus toyoi）始用于日本鰻鱺（Anguilla japonica）的養(yǎng)殖中，降低病原菌引起的死亡，開啟了益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的新局面［5］。益生菌能抑制病原菌、促進(jìn)宿主生長(zhǎng)，其環(huán)境友好、安全有效等優(yōu)點(diǎn)在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中已引起廣泛關(guān)注。然而，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的實(shí)際使用狀況、存在的問題（如同時(shí)使用抗生素及化學(xué)消毒劑等）、面臨的挑戰(zhàn)以及今后的發(fā)展方向仍需要深入探究［6］。在生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶使用益生菌的方法主要依賴于經(jīng)銷商提供的指導(dǎo)或自身在養(yǎng)殖中積累的經(jīng)驗(yàn)。有些養(yǎng)殖戶基于節(jié)約成本，減量使用益生菌，或擔(dān)心效力不足，同時(shí)使用抗生素及化學(xué)消毒劑，致使益生菌的施用效果不佳［7］。因此，測(cè)定益生菌對(duì)常用的養(yǎng)殖水體消毒劑以及已批準(zhǔn)使用的用于病害防治的水產(chǎn)養(yǎng)殖獸藥（如多西環(huán)素、氟苯尼考、新霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和復(fù)方新諾明等）的耐受性，是選用益生菌菌株、水體消毒劑及抗菌藥物的重要參考。

本試驗(yàn)選取前期從養(yǎng)殖蝦塘中分離的芽孢桿菌菌株，以期篩選出具有較強(qiáng)抑菌性、對(duì)抗菌藥物和水體消毒劑耐受較好的優(yōu)良益生菌，為養(yǎng)殖過程中的益生菌的選擇和使用，以及開發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物益生菌制劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芽孢桿菌菌株 2021年5—8月，筆者所在實(shí)驗(yàn)室從江蘇連云港養(yǎng)殖蝦塘的蝦體、底泥和水體中分離并鑒定24株芽孢桿菌（表1）。

1.1.2 病原菌菌株 實(shí)驗(yàn)室保存的6株水產(chǎn)常見致病菌，見表2。

1.1.3 藥敏紙片 藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，其含量以及藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)見表3。根據(jù)《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年2號(hào)》名單，氟苯尼考粉（水產(chǎn)用）、恩諾沙星粉（水產(chǎn)用）、鹽酸多西環(huán)素粉（水產(chǎn)用）、硫酸新霉素粉（水產(chǎn)用）以及維生素C磷酸酯鎂鹽酸環(huán)丙沙星預(yù)混劑是已批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用的抗菌藥物。

1.1.4 消毒劑 本試驗(yàn)所用水產(chǎn)養(yǎng)殖常用消毒劑分別是聚維酮碘溶液、戊二醛苯扎溴銨溶液、復(fù)合碘溶液、苯扎溴銨溶液、濃戊二醛溶液、過硫酸氫鉀、漂白粉和高錳酸鉀，詳見表4。根據(jù)《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年2號(hào)》名單，戊二醛苯扎溴銨溶液（水產(chǎn)用）、濃戊二醛溶液（水產(chǎn)用）、含氯石灰（水產(chǎn)用）、苯扎溴銨溶液（水產(chǎn)用）、復(fù)合碘溶液（水產(chǎn)用）、聚維酮碘溶液（水產(chǎn)用）、過硫酸氫鉀復(fù)合物粉是已批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用的消毒劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外抑菌試驗(yàn) 采用牛津杯法［7］鑒定24株芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)常見致病菌的抑制效果，病原菌100 μL菌懸液（106 CFU/mL）涂布于TSB平板，牛津杯孔中加入40 μL的待測(cè)芽孢桿菌菌液，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑（mm），觀察抑菌效果。

1.2.2 抗菌藥物耐受性試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法（K-B 法）［8］確定芽孢桿菌對(duì)藥物的敏感性，根據(jù)藥敏紙片抑菌直徑范圍進(jìn)行藥物敏感性判定。待測(cè)芽孢桿菌活化后，制備108 CFU/mL菌懸液，吸取100 μL菌液涂布于平板上，每個(gè)平板貼附4個(gè)藥敏紙片，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.3 消毒劑耐受性試驗(yàn) 通過不同消毒劑對(duì)芽孢桿菌的抑菌作用，判斷芽孢桿菌對(duì)消毒劑的耐受性。芽孢桿菌活化后，分別制備106 CFU/mL菌懸液，在TSB平板上均勻涂布；在牛津杯孔中加入 40 μL 消毒劑（聚維酮碘溶液20 mg/L、戊二醛苯扎溴銨溶液20 mg/L、復(fù)合碘溶液20 mg/L、苯扎溴銨溶液20 mg/L、濃戊二醛溶液20 mg/L、過硫酸氫鉀20 mg/L、漂白粉20 mg/L、高錳酸鉀20 mg/L），28 ℃ 培養(yǎng)12～18 h，觀察芽孢桿菌對(duì)消毒劑的耐受性，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑在 8 mm 以下無抑菌作用，在8～10 mm之間為低敏感，＞10～15 mm為中度敏感，在15 mm以上為高敏感度。

進(jìn)一步探究不同濃度的敏感的消毒劑對(duì)芽孢桿菌存活的影響。芽孢桿菌活化后，制備106 CFU/mL菌懸液，不同消毒劑濃度設(shè)為0 （對(duì)照組，未添加消毒劑）、1、2、4、8、16 mg/L，分別添加到制備好的菌懸液中，重復(fù)3次。28 ℃ 60 r/min振蕩培養(yǎng)；并分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h取100 μL培養(yǎng)液于TSB平板涂布，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)單菌落數(shù)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 19.0進(jìn)行圖表繪制及分析，所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

在體外抑菌試驗(yàn)中，不同芽孢桿菌對(duì)不同病原菌的抑制效果不同（圖1）。貝萊斯芽孢桿菌BV1、BV2和BV3對(duì)6種水產(chǎn)常見致病菌均具有明顯的抑制作用（圖2）；東洋芽孢桿菌BT1對(duì)6株常見的病原菌無抑制效果，僅對(duì)銅綠假單胞菌具有不明顯的抑制效果；不同的枯草芽孢桿菌對(duì)病原菌的抑制效果不一樣，其中BS3株的抑菌效果較好，可以抑制溶藻弧菌、哈維氏弧菌和嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)，而BS6株無法抑制6株病原菌的生長(zhǎng)；4株地衣芽孢桿菌BL1～BL4、2株海內(nèi)氏芽孢桿菌BH1和BH2以及?？谘挎邨U菌BH3均對(duì)6株病原菌無抑制效果；蠟樣芽孢桿菌BC1僅對(duì)1株溶藻弧菌和哈維氏弧菌具有不明顯的抑制效果；2株海水芽孢桿菌BA1和BA2的抑菌效果不如枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。

2.2 抗菌藥物耐受性試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，24株芽孢桿菌對(duì)多西環(huán)素與氟苯尼考均具有高度或中度敏感性；新霉素藥敏結(jié)果顯示，有10株芽孢桿菌（BV3、BT1、BS2、BS4、BS6、BS9、BS10、BH3、BC1和BA1）具有耐藥性，其他14株均具有中度敏感性；環(huán)丙沙星與恩諾沙星的藥敏結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌BS6對(duì)這2種藥顯示耐藥性，海口芽孢桿菌BH3對(duì)環(huán)丙沙星具有中度敏感性，其他菌株都顯示出對(duì)環(huán)丙沙星的高度藥物敏感性；復(fù)方新諾明藥敏試驗(yàn)表明，除了東洋芽孢桿菌BT1與蠟樣芽孢桿菌BC1菌株顯示耐藥性外，其他菌株對(duì)該藥都具有高度敏感性。

2.3 消毒劑耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 24株菌對(duì)消毒劑耐受結(jié)果 由圖4可知，過硫酸氫鉀、漂白粉以及高錳酸鉀對(duì)大多數(shù)的芽孢桿菌無抑制作用，除了漂白粉對(duì)東洋芽孢桿菌BT1、地衣芽孢桿菌BL2和BL4的抑制作用明顯，過硫酸氫鉀對(duì)3種貝萊斯芽孢桿菌BV1～BV3有中度的抑制作用。但是聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛的高消毒劑量對(duì)芽孢桿菌都有一定的抑制效果。

2.3.2 菌株BV1對(duì)5種消毒劑耐受結(jié)果 挑選抑菌效果、耐藥性以及對(duì)消毒劑耐受性較好的菌株BV1進(jìn)一步探究不同濃度的聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛對(duì)存活率的影響。由圖5-a可知BV1在未添加聚維酮碘消毒液的對(duì)照組（0 mg/L）中有自然消亡的過程，24 h活菌數(shù)量下降2個(gè)數(shù)量級(jí)。添加不同濃度的聚維酮碘后，試驗(yàn)組BV1菌數(shù)隨著時(shí)間推移均呈先線性減少而后再略回升趨勢(shì)，其中在1 h除 16 mg/L 試驗(yàn)組BV1數(shù)量表現(xiàn)出急劇下降趨勢(shì)外，其他各濃度組的活菌數(shù)下降趨勢(shì)均較緩，但下降程度大體高于對(duì)照組。4 mg/L試驗(yàn)組BV1數(shù)量介于8 mg/L和 16 mg/L 試驗(yàn)組間。12 h后，對(duì)照組和各試驗(yàn)組的活菌數(shù)量有所升高。

BV1對(duì)不同濃度戊二醛苯扎溴銨的耐受性試驗(yàn)結(jié)果（圖5-b）表明，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，未添加消毒劑的對(duì)照組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組；不同消毒劑濃度試驗(yàn)組的BV1活菌數(shù)隨著時(shí)間推移均呈線性減少，且戊二醛苯扎溴銨的濃度越高，BV1活菌數(shù)量下降越快，其中4、8、16 mg/L試驗(yàn)組的活菌數(shù)量分別在24、8、1 h降為0。

BV1對(duì)不同濃度復(fù)合碘的耐受性試驗(yàn)結(jié)果見圖5-c，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)未添加消毒劑組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組；不同消毒劑濃度試驗(yàn)組的BV1活菌數(shù)隨著時(shí)間推移均減少，其中，前6 h內(nèi)，1 mg/L與2 mg/L試驗(yàn)組的活菌數(shù)降低趨勢(shì)一致，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)活菌計(jì)數(shù)差異較??；4 mg/L試驗(yàn)組的活菌數(shù)在前2 h時(shí)間點(diǎn)內(nèi)活菌數(shù)無差異，且無降低趨勢(shì)，但在2 h后活菌數(shù)急劇降低。8 mg/L與16 mg/L試驗(yàn)組的活菌數(shù)下降較快。

BV1對(duì)不同濃度苯扎溴銨的耐受性結(jié)果如圖 5-d 所示，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，未添加消毒劑對(duì)照組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組，不同消毒劑濃度試驗(yàn)組的BV1活菌數(shù)隨著時(shí)間推移均減少，且苯扎溴銨的濃度越高，BV1活菌數(shù)量下降越快。4、8、16 mg/L試驗(yàn)組的BV1活菌數(shù)量均在1 h內(nèi)迅速下降2個(gè)數(shù)量級(jí)。

BV1對(duì)不同濃度濃戊二醛的耐受性試驗(yàn)結(jié)果見圖5-e，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，未添加消毒劑對(duì)照組（0 mg/L）活菌數(shù)均大于添加消毒劑組，不同消毒劑

濃度試驗(yàn)組的BV1活菌數(shù)隨著時(shí)間推移均減少，且濃戊二醛的濃度越高，活菌數(shù)量下降越快。8 mg/L和16 mg/L試驗(yàn)組的活菌數(shù)量均在12 h迅速下降2個(gè)數(shù)量級(jí)。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)比較了水產(chǎn)源芽孢桿菌對(duì)常見病原菌的抑菌能力，并進(jìn)一步檢測(cè)了芽孢桿菌對(duì)抗菌藥物和消毒劑的耐受性，將抑菌能力強(qiáng)、對(duì)抗菌藥物以及對(duì)常見消毒劑耐受性好的芽孢桿菌菌株篩選出來作為潛在益生菌，進(jìn)而篩選出最適合實(shí)際應(yīng)用的潛在益生菌菌株。

3.1 芽孢桿菌抑菌株的篩選

芽孢桿菌作為益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中由來已久。芽孢桿菌廣泛存在于水生環(huán)境中，常作為益生菌制劑的主要成分改善水體和維持養(yǎng)殖水環(huán)境微生物穩(wěn)態(tài)，抑制病原菌的生長(zhǎng)［8］；芽孢桿菌還可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生信號(hào)分子，使宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生具有殺菌活性的有效分子，上調(diào)宿主免疫系統(tǒng)的活性，增強(qiáng)其對(duì)病原體的殺菌能力［9］。

對(duì)病原體的拮抗作用是益生菌篩選的一項(xiàng)重要指標(biāo)［10］。在益生菌初篩過程中，由于時(shí)限或效益的考慮，往往以單種或少量細(xì)菌作為指示菌進(jìn)行篩選［11-13］。然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌病原體種類繁多，諸如弧菌（Vibrio spp.）、氣單胞菌（Aeromonas spp.）、愛德華氏菌（Edwardsiella spp.）、黃桿菌（Flavobacterium spp.）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）和微球菌（Pseudomonas spp.）等［14］。其中，弧菌和氣單胞菌較為常見。

貝萊斯芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體、魚類的生長(zhǎng)性能以及減少動(dòng)物疾病方面具有良好的效果［15］。Li等的研究表明，從健康的日本沼蝦體內(nèi)分離出的貝萊斯芽孢桿菌CPA1-1，在濃度達(dá)到104 CFU/mL時(shí)，對(duì)維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌等具有良好的抑菌效果［16］。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌BV1、 BV2和BV3對(duì)選定的6種病原菌均具有中等程度以上的抑菌效果，與Li等的結(jié)果［16］相似，進(jìn)一步證明了貝萊斯芽孢桿菌對(duì)弧菌屬和氣單胞菌屬細(xì)菌具有良好的抑制效果。

枯草芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中研究最多且應(yīng)用最廣泛的益生菌，在改善水生動(dòng)物的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)、免疫和抗病能力等方面有顯著的效果［17］。研究發(fā)現(xiàn)，隨著接種枯草芽孢桿菌濃度的提高，枯草芽孢桿菌對(duì)溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌的拮抗作用越明顯［18］。趙倩等的研究表明，枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、維氏氣單胞菌均具有較強(qiáng)抑菌作用［19］。本研究中，枯草芽孢桿菌BS1、BS2、BS10對(duì)溶藻弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌和銅綠假單胞菌均具有一定程度的抑菌效果，抑菌效果比貝萊斯芽孢桿菌稍差。

3.2 芽孢桿菌耐藥菌株的篩選

芽孢桿菌對(duì)大多數(shù)的抗生素是敏感的［20］，為了避免使用抗生素時(shí)將水體或魚體中的益生菌殺死，所以在使用抗生素前進(jìn)行抗菌藥物敏感性測(cè)試非常必要。本次抗菌藥物耐藥試驗(yàn)中，所有芽孢桿菌對(duì)多西環(huán)素和氟苯尼考均具敏感性，敏感率比較高的還有環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和恩諾沙星，這與目前已有關(guān)于枯草桿菌藥敏結(jié)果［21］類似。本試驗(yàn)的所有菌株對(duì)新霉素表現(xiàn)出耐藥或者中度敏感，這與豬源腸道益生菌的篩選試驗(yàn)中的新霉素耐藥研究結(jié)果［22］表現(xiàn)一致。

迄今為止，對(duì)于各種致病細(xì)菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物的傳染性疾病的控制，抗菌藥物無疑仍然是首選藥物［23］，但是還未對(duì)這些菌是否具有新霉素抗性基因進(jìn)行鑒定，并且該基因是否存在于質(zhì)粒上仍有待于后續(xù)研究。就目前結(jié)果來看，如果這些潛在益生菌的耐藥基因是內(nèi)在的，不可轉(zhuǎn)移的，那么在使用芽孢桿菌抑制細(xì)菌的同時(shí)，配合新霉素可能會(huì)達(dá)到更好的抑菌效果。

3.3 芽孢桿菌消毒劑耐受株的篩選

芽孢桿菌消毒劑耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示，硫酸氫鉀、漂白粉以及高錳酸鉀對(duì)大多數(shù)的芽孢桿菌無抑制作用，但是聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛對(duì)芽孢桿菌都有一定的抑制作用。因此，結(jié)合病原菌的抑菌結(jié)果、抗菌藥物的藥敏結(jié)果以及消毒劑的定性耐受性結(jié)果，選取貝萊斯芽孢桿菌BV1進(jìn)一步研究對(duì)聚維酮碘、戊二醛苯扎溴銨、復(fù)合碘、苯扎溴銨以及濃戊二醛5種不同濃度消毒劑的耐受性。

聚維酮碘又名乙烯吡咯烷酮碘，為廣譜、高效消毒劑，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等都具有抑制或殺滅作用［24］。高曉華等的研究結(jié)果表明，水產(chǎn)用聚維酮碘對(duì)解淀粉芽孢桿菌G1（Bacillus amyloliquefaciens strain G1）、凝結(jié)芽孢桿菌92（Bacillus coagulans strain 92）、短小芽孢桿菌95（Bacillus pumilus strain 95）和乳酸芽孢桿菌H3（Lactobacillus sp.strain H3）的最小抑菌濃度為128～512 mg/L［25］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，貝萊斯芽孢桿菌BV1對(duì)聚維酮碘的耐受性具有一定的濃度相關(guān)性，當(dāng)聚維酮碘使用濃度達(dá)到 16 mg/L 時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響貝萊斯芽孢桿菌BV1的活性。與高曉華等的研究結(jié)果相比較，推測(cè)貝萊斯芽孢桿菌對(duì)聚維酮碘的耐受性可能更差，因此，如果使用聚維酮碘消毒水體，濃度不應(yīng)大于2 mg/L。

濃戊二醛是新一代醛類消毒劑，具有很強(qiáng)的廣譜殺菌能力，是當(dāng)前醛類消毒劑中應(yīng)用較廣的一種消毒劑。張峰峰等的研究表明，戊二醛的濃度在低于0.5 mg/L時(shí)，對(duì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)和亞硝酸鹽的去除率無顯著影響［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌BV1對(duì)濃戊二醛的抗性具有濃度相關(guān)性，混合液濃度升高時(shí)，BV1活菌數(shù)量減少，因此平時(shí)如果使用濃戊二醛消毒水體，濃度不應(yīng)大于2 mg/L，這樣不會(huì)影響B(tài)V1的活性，與張峰峰的試驗(yàn)結(jié)果一致。

戊二醛和苯扎溴銨均可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用殺菌消毒制劑，是水產(chǎn)動(dòng)物病害防治生產(chǎn)中的常用漁藥，被用來防治車輪蟲、聚縮蟲等纖毛蟲病及細(xì)菌性疾病等，苯扎溴銨和戊二醛配合使用效果更加顯著，生產(chǎn)中常將二者合用［27-28］。貝萊斯芽孢桿菌BV1對(duì)戊二醛和苯扎溴銨的抗性具有濃度相關(guān)性，混合液濃度升高時(shí)，BV1活菌數(shù)量減少。因此，建議使用戊二醛和苯扎溴銨混合液消毒水體，濃度不應(yīng)大于2 mg/L，這樣不會(huì)影響B(tài)V1的活性。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的復(fù)合碘為碘酸混合液，是將碘、碘化物、鹽酸及磷酸混合制成的水溶液，具有更好的消毒效果；苯扎溴銨別名新潔爾滅，是一種季銨鹽類陽離子表面活性消毒劑，可高濃度聚集于菌體表面，影響細(xì)菌的新陳代謝，由此其抑菌濃度較低，效果較好［27］。貝萊斯芽孢桿菌BV1對(duì)復(fù)合碘和苯扎溴銨的抗性較差，當(dāng)兩者使用濃度超過 2 mg/L 時(shí)，BV1的活菌數(shù)量會(huì)隨著時(shí)間迅速減少，因此為了達(dá)到水體消毒效果，同時(shí)不影響B(tài)V1的活性，復(fù)合碘和苯扎溴銨的濃度不應(yīng)超過1 mg/L。

養(yǎng)殖過程中不可避免地會(huì)使用消毒產(chǎn)品，從本試驗(yàn)可知，如果水體中殘留超過閾值濃度的消毒劑會(huì)對(duì)益生菌的活性產(chǎn)生影響，因此合理選擇消毒產(chǎn)品的濃度對(duì)保持益生菌的活性非常重要。其次，益生菌對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性研究也需要進(jìn)一步深入。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌BV1可以作為潛在益生菌株用于后續(xù)水產(chǎn)益生菌制劑的開發(fā)利用；同時(shí)，在益生菌的篩選過程中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS10除抑菌效果較差外，在抗菌藥物耐藥性試驗(yàn)和消毒劑耐受性試驗(yàn)中均表現(xiàn)良好，可以考慮作為復(fù)合益生菌的備選。

3.4 結(jié)論

通過體外抑菌試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)和消毒劑耐受性試驗(yàn)，從24株芽孢桿菌中篩選出1株具有強(qiáng)抑菌性、對(duì)抗菌藥物和消毒劑耐受性較好的貝萊斯芽孢桿菌（BV1），并且本試驗(yàn)探究出的適配抗菌藥物和消毒劑濃度可作為實(shí)際養(yǎng)殖或科研的參考，以期為水產(chǎn)疫病的防控作出貢獻(xiàn)。

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