低溫脅迫下工業(yè)大麻中大麻二酚含量和差異表達基因分析

摘要：為研究低溫脅迫條件下龍大麻6號大麻二酚（CBD）積累的變化規(guī)律和合成途徑分子調(diào)控機制，以不同低溫脅迫和常溫條件處理大麻葉片為材料，測定CBD含量，同時對上述材料進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對不同低溫脅迫和常溫條件處理大麻葉片CBD含量變化，發(fā)現(xiàn)0 ℃處理組（T1）CBD含量最高，其他低溫處理組5 ℃處理組（T2）、15 ℃處理組（T3）、20 ℃處理組（T4）大麻葉中CBD含量比常溫組（CK）CBD含量低。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中CBD合成途徑關鍵基因差異表達分析顯示，0 ℃處理組CBD合成途徑中大部分關鍵基因表達量都顯著上調(diào)，同時其他溫度脅迫條件下CBD合成途徑中大部分關鍵基因表達量也都有變化。0 ℃能夠顯著提高龍大麻6號CBD的合成，提高植株體內(nèi)CBD合成途徑中關鍵基因表達量，從而使其更好地適應低溫環(huán)境。

關鍵詞：大麻；大麻二酚；低溫脅迫；差異表達基因

中圖分類號：S563.301 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0072-13

收稿日期：2023-11-17

基金項目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務費項目（編號：CZKYF2023-1-B007）。

作者簡介：王文重（1979—），女，博士，副研究員，主要從事工業(yè)大麻遺傳育種研究。E-mail：wenwen0331@163.com。

通信作者：張利國，博士，研究員，主要從事麻類遺傳基礎研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

大麻（Cannabis sativa L.）是一種高附加值的多用途經(jīng)濟作物，屬于?？拼舐閷伲瑥V泛分布于世界各地，在我國有著悠久的栽培歷史［1-3］。目前國內(nèi)已審定或認定或登記的大麻品種，都是工業(yè)大麻，不含或含有極低神經(jīng)成癮性物質(zhì)，不具毒品利用價值［4］。工業(yè)大麻中存在多種大麻素，主要在大麻葉和花中，大麻二酚（cannabidiol，CBD）是其中已被聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織認可的健康成分，研究表明，CBD無致幻成癮性，且具有抗驚厥痙攣、癲癇、鎮(zhèn)痛、焦慮、抗菌抗炎、抗麻醉和神經(jīng)系統(tǒng)保護等藥理功效，廣泛應用于醫(yī)藥和化妝品領域［5-7］。在CBD產(chǎn)業(yè)帶領下，工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)有望在未來幾年實現(xiàn)強勁增長，到2025年CBD產(chǎn)業(yè)預計將達到千億美元級別［8］。低溫是影響植物正常生長的主要障礙之一，大多數(shù)植物對低溫較為敏感，一旦遭遇低溫脅迫，將導致生長受限，產(chǎn)量下降影響植物的生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物的合成［9］。溫度是調(diào)控植物生長發(fā)育和代謝物質(zhì)積累的重要條件，國內(nèi)外關于溫度對工業(yè)大麻生長和CBD積累研究的相關報道較少。黑龍江省地處我國北方，春季播種時間溫度較低，對大麻的生長和CBD含量會造成一定的影響。因此需要開展大麻對低溫脅迫響應方面的研究，了解大麻在CBD含量變化規(guī)律和合成途徑分子機制。目前，黑龍江省工業(yè)大麻原料來源多樣，溫度與CBD含量、原料產(chǎn)率存在密切的關系，掌握溫度與大麻CBD有效成分含量之間的關系，也為今后利用植物基因工程技術(shù)提高工業(yè)大麻的品質(zhì)奠定研究基礎，將有效提升花葉用工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的市場競爭力與經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

試驗大麻品種為龍大麻6號，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供。CK代表常溫（25 ℃）處理組；T1代表0 ℃（處理1）處理組；T2代表5 ℃（處理2）處理組；T3代表15 ℃（處理3）處理組；T4代表20 ℃（處理4）處理組。

試驗材料2021年種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所實驗室人工氣候溫箱內(nèi)，培養(yǎng)條件設定為相對濕度80%、光—暗周期14 h—10 h，全程充分供水。分別在0 ℃（處理1）、5 ℃（處理2）、15 ℃（處理3）、20 ℃（處理4）、CK（25 ℃）下進行培養(yǎng)。待植株長大至花期進行取樣，為了消除個體差異，選擇植株長勢、外觀表型、部位盡量一致的大麻葉取樣，每株大麻取5～8張葉片，3次生物學重復，用錫箔紙包好后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大麻二酚（CBD）含量測定

分別取不同環(huán)境下培養(yǎng)后的鮮大麻葉經(jīng)85 ℃烘3 h并粉碎后的大麻葉0.200 g，加入甲醇4 mL，采用常溫超聲提取，提取時間為10 min，靜置1 h。4 000 r/min 離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中進行定容。使用2 mL注射器裝樣過 0.45 μm 有機濾膜注射至液相進樣瓶，采用HPLC色譜條件分析CBD含量。

1.3 RNA的提取及cDNA文庫的合成

使用全式金生物技術(shù)有公司試劑盒分別提取處理組和對照組總RNA，并用Bioanalyzer 2100及Agilent RNA6000 Nano Kit對總RNA的完整性和純度進行分析。

測序由哈爾濱博泰生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeqTM X TEN測序儀進行測序。使用HISAT2將clean reads比對到參考基因組（https：//gofile-3663784363.cn4.quickconnect.cn/fsdownload/QZM0L6zNu/Cannatonic.genome.fasta.gz）。篩選差異表達基因條件為：表達差異倍數(shù) |log2FoldChange|>1，顯著性P<0.01。

1.4 qRT-PCR驗證

使用全式金生物技術(shù)有公司試劑盒提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用Primer 5軟件設計引物，采用Actin為內(nèi)參基因（表1）。

應用全式金公司熒光定量試劑盒進行熒光定量試驗，反應體系見表2。反應程序為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。應用2-ΔΔCT方法計算相對定量結(jié)果。相關基因qRT-PCR引物如表1所示。對篩選的關鍵基因進行 qRT-PCR，測定相對表達量，比熒光定量試驗結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)趨勢是否一致。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復3次，使用Excel軟件處理數(shù)據(jù)及對結(jié)果作圖，SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理大麻二酚（CBD）含量變化

由圖1可知，0 ℃處理后CBD含量最高，5 ℃處理后含量最低。處理溫度從5 ℃開始，隨著處理溫度升高，CBD含量逐漸增加，但15℃和20℃處理后，CBD含量差異不顯著。

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 數(shù)據(jù)整理 工業(yè)大麻植株經(jīng)過不同溫度處理之后，進行相應的轉(zhuǎn)錄組測序分析。對每個樣品的下機數(shù)據(jù)（Raw Data）分別進行統(tǒng)計，包括Q30（%）、模糊堿基和GC（%）。統(tǒng)計結(jié)果如表3所示，Q30均在90%以上，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可用于進一步分析。

2.2.2 差異基因表達及富集分析 edgeR以count計數(shù)為起始數(shù)據(jù)，經(jīng)過TMM標準化后，進行差異表達分析，結(jié)果如圖2所示。T1與對照組（CK）之間共有5 785個差異基因，其中4 106個上調(diào)基因，1 679 個下調(diào)基因；T2與對照組（CK）之間共有 4 707 個差異基因，其中2 513個上調(diào)基因，2 194個下調(diào)基因；T3與對照組（CK）之間共有48 440個差異基因，其中3 343個上調(diào)基因，1 497個下調(diào)基因；T4與對照組（CK）之間共有4 570個差異基因，其中992個上調(diào)基因，3 578個下調(diào)基因（圖2-A）。結(jié)果顯示，不同低溫處理后，T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）、T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）和T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）上調(diào)差異表達基因數(shù)大于下調(diào)差異表達基因數(shù)。T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）下調(diào)差異表達基因數(shù)遠遠大于上調(diào)差異表達基因數(shù)（圖2-A）。整體看，處理溫度從0 ℃逐漸升高至20 ℃，不同處理組與對照組相比上調(diào)基因數(shù)逐漸減少，下調(diào)基因數(shù)逐漸增加，其中T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）組下調(diào)基因數(shù)是上調(diào)基因數(shù)的3.6倍。在4個比較組中，T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組上調(diào)表達差異基因，與T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）組下調(diào)基因進行比較，結(jié)果顯示33個基因為共有的顯著差異基因（圖2-B）。T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組下調(diào)表達差異基因，與T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）組上調(diào)基因進行比較，結(jié)果顯示11個基因為共有的顯著差異基因（圖2-C）。這些結(jié)果表明，工業(yè)大麻在應對不同的低溫脅迫時，可以觸發(fā)相似的反應，同時處理1可能還存在獨特的反應和機制。

2.2.3 差異基因的GO富集分析 對不同溫度處理工業(yè)大麻差異表達基因所具有的功能進行GO功能富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4組間的差異表達基因分別富集55、48、51、49條GO terms中，這些GO terms屬于三大功能類別：細胞成分（CC）、分子功能（MF）、生物進程（BP）。4組分析獲得的GO terms很相似。CC中最豐富的成分被歸類為膜（GO：0016020，membrane）、細胞膜組分（GO：0044425，membrane part）以及細胞（GO：0005623，cell）。在MF中富集最多的2條GO terms是催化活性（GO：0003824，catalytic activity）和結(jié)合（GO：0005488，binding）。在BP中富集最多的3條GO terms是代謝過程（GO：0008152，metabolic process）、細胞進程（GO：0009987，cellular process）和單一有機體過程（GO：0044699，single-organism process）（圖3）。

在工業(yè)大麻葉片相應溫度脅迫處理的基因功能富集中，在BP分類中排在前20的GO terms中主要與合成和代謝相關，包括單一生物過程（GO：0044699，single-organism process）、單生物代謝過程（GO：0044710，single-organism metabolic process）、氧化還原過程（GO：0055114，oxidation-reduction process），此外還有單生物細胞過程（GO：0044763，single-organism cellular process）、細胞或亞細胞成分的運動（GO：0006928 movement of cell or subcellular component）、有機氮化合物代謝過程（GO：1901564，organonitrogen compound metabolic process）、碳水化合物代謝過程（GO：0005975，carbohydrate metabolic process）、果膠分解代謝過程（GO：0045490，pectin catabolic process）（圖4）。

2.2.4 差異共表達基因的GO分析

T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組上調(diào)表達差異基因，與T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和 T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）組下調(diào)基因共表達的33個基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，CC中最豐富的成分被歸類為膜（GO：0016020，membrane），在MF中是氧化還原酶活性（GO：0016491，oxidoreductaseactivity），在BP中富集最多的是氧化還原過程（GO：0055114，oxidation-reduction process）（圖5-A）。T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組下調(diào)表達差異基因，與T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）、T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）組上調(diào)基因共表達的11個基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，CC中最豐富最多的2條GO terms是膜（GO：0016020，membrane）和細胞膜組成成分（GO：0016021，integral component of membrane），在MF中是氧化還原酶活性（GO：0016491，oxidoreductase activity），在BP中富集最多的是氧化還原過程（GO：0055114，oxidation-reduction process）（圖5-B）。

2.2.5 差異基因的KEGG富集分析

根據(jù)差異表達基因的KEGG富集分析結(jié)果，分別有139、136、134、127個代謝途徑參與了T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）、T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃），T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）和T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）組。主要包括玉米素生物合成（zeatin biosynthesis）、光合作用（photosynthesis）、植物MAPK信號通路（MAPK signaling pathway-plant）、代謝通路（metabolic pathways），還有次級代謝物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、黃酮和黃酮醇生物合成（flavone and flavonol biosynthesis）、戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway），戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉(zhuǎn)化（pentose and glucuronate interconversions）和錯配修復（mismatch repair）。本研究中由不同溫度處理后調(diào)控的排在前20的代謝途徑如圖6所示。這些結(jié)果表明，在不同溫度處理下，工業(yè)大麻的葉片會積極調(diào)整自身代謝以增加環(huán)境適應的能力。

2.2.6 CBD合成途徑基因響應不同溫度脅迫

植物大麻素生物合成途徑分為3個催化步驟：（1）聚酮合成（polyketide formation）；（2）異戊烯化（prenylation）；（3）氧化環(huán)化（oxidative cyclization）。本研究中發(fā)現(xiàn)低溫脅迫也能夠誘導CBD合成途徑相關基因表達。橄欖醇合成酶（olivetol synthase，OLS）和橄欖酸環(huán)化酶（olivetolic acid cyclase，OAC）是聚酮合成途徑中的關鍵酶。在所有的顯著差異表達基因中，有3個基因被注釋為OLS，為T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組和T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）組共有的差異基因CsCAN_00G0063150，低溫脅迫后顯著上調(diào)表達?；駽sCAN_00G0217670和CsCAN_00G0066890在受到低溫脅迫時下調(diào)表達（圖7）?；駽sCAN_00G0063150，CsCAN_00G0066890和CsCAN_00G0217670 GO富集為BP條目生物合成的過程（GO：0009058，biosynthetic process）?；駽sCAN_00G0063150還參與查爾酮生物合成過程（GO：0009715，chalcone biosynthetic process）和大麻素生物合成過程（GO：1901696，cannabinoid biosynthetic process）。

在所有的顯著差異表達基因中，1個OAC（CsCAN_00G0220930）為4個溫度處理共有的差異基因，還有另外1個OAC（CsCAN_00G0204700）為T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組和T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）組共有的差異基因，上述基因在受到低溫脅迫之后均顯著上調(diào)表達。

大麻戊烯基轉(zhuǎn)移酶1（cannabis sativa prenyltransferase 1，CsPT1）和烯戊烯基轉(zhuǎn)移酶4（cannabis sativa prenyltransferase 4，CsPT4）已被證明在大麻素生物合成途徑中催化產(chǎn)生大麻二酚酸（cannabigerolic acid，CBGA）的步驟，CBGA是產(chǎn)生大麻二酸（CBDA）和四氫大麻酚酸（THCA）的終點酶的底物。在所有的顯著差異表達基因中，有8個基因被注釋為PT，這些基因中沒有響應4個脅迫所共有的差異基因。在T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組和T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）組溫度脅迫處理下，有5個PT共有的差異基因，除CsCAN_00G0027410之外其他均顯著上調(diào)表達（圖7）。T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）溫度脅迫處理下，2個PT均下調(diào)表達。其中CsCAN_00G0202190屬于葉綠素生物合成過程（GO：0015995，chlorophyll biosynthetic process）。

大麻二酚合成酶（cannabidiolic acid synthase，CBDAS）催化CBGA單萜部分氧化環(huán)化，分別轉(zhuǎn)化為大麻二酸（cannabidiolicacid，CBDA）。在所有的顯著差異表達基因中，有29個基因被注釋為CBDAS。其中21個CBDAS響應T1-vs-CK（0 ℃/25 ℃）組溫度脅迫處理，10個CBDAS響應T2-vs-CK（5 ℃/25 ℃）組溫度脅迫，14個CBDAS響應T3-vs-CK（15 ℃/25 ℃）組溫度脅迫，13個CBDAS響應T4-vs-CK（20 ℃/25 ℃）組溫度脅迫。除CsCAN_00G0100790之外，其他28個基因GO富集為BP條目氧化還原過程（GO：0055114//oxidation-reduction process）。

2.2.7 差異基因的qRT-PCR驗證

為了驗證由RNA-seq測序獲得的基因表達模式的準確性，通過qRT-PCR檢測了CBD生物合成途徑中10個DEG的表達模式（圖8）。比較了用qRT-PCR檢測的基因的表達量在T1（0 ℃/25 ℃）、T2（5 ℃/25 ℃）、T3（15 ℃/25 ℃）和T4（20 ℃/25 ℃）4個比較組之間的相對表達情況。所選基因的qRT-PCR檢測的相對表達趨勢與RNA-seq檢測的表達趨勢一致，說明RNA-seq數(shù)據(jù)是可靠的，重復性好。

3 討論

首先，本研究探討了不同溫度處理下工業(yè)大麻植株CBD積累的規(guī)律，結(jié)果表明：與對照（25 ℃）相比，T1組（0 ℃）處理后CBD含量最高，表明0 ℃對大麻CBD含量有一定的影響。T2組（5 ℃）、T3組（15 ℃）和T4組（20 ℃）與對照常溫組（25 ℃）相比CBD含量均有所下降，其中T2組（5 ℃）CBD含量最低。隨著處理溫度的升高，從5 ℃到20 ℃，CBD含量緩慢上升，但始終低于常溫對照組。由此可見，0 ℃短時處理后會提高大麻CBD含量，但短時 5～20 ℃之間，短時處理會減低大麻CBD含量?？赡芘c植物體對溫度的適應機制有關，在5～20 ℃這個溫度范圍內(nèi)，持續(xù)較低溫度使得工業(yè)大麻生長變慢，低溫抑制地上部生長，使得干物質(zhì)積累量減少［10-11］。

其次，試驗研究了低溫脅迫對工業(yè)大麻CBD含量的調(diào)控作用，通過不同溫度處理后對大麻葉片進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在T1-vs-CK組（0 ℃/25 ℃）上調(diào)基因數(shù)量最多，且差異表達基因上調(diào)數(shù)遠多于下調(diào)數(shù)。另外對于差異共表達基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，三大功能類別中膜（GO：0016020，membrane）、氧化還原酶活性（GO：0016491，oxidoreductase activity）和氧化還原過程（GO：0055114，oxidation-reduction process）富集最多。由于植物受到低溫脅迫時會促進細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，推測溫度處理可能影響了大麻細胞內(nèi)的氧化還原反應。植物次生代謝物的合成不僅是一類有用的天然產(chǎn)物，而且是植物抵抗環(huán)境脅迫防御系統(tǒng)的重要組成。轉(zhuǎn)錄組測序檢測到的DEG相關功能主要集中在膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、碳水化合物（蔗糖和淀粉）代謝、次生代謝產(chǎn)物合成等代謝通路。本研究對KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，植物MAPK信號通路（MAPK signaling pathway -plant）、次級代謝物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、代謝通路（metabolic pathways）等通路顯著富集，表明溫度處理影響了次生代謝。Shan等的研究表明，結(jié)縷草在低溫脅迫下（4 ℃）能夠激活植物體內(nèi)氧化應急反應、MAPK信號通路、類黃酮和異黃酮生物合成和萜類主干物質(zhì)生物合成等次生代謝產(chǎn)物通路富集顯著。

大麻素的前體實際上起源于2種不同的生物合成途徑：聚酮合成（polyketide formation）途徑和非甲羥戊酸途徑（MEP pathway）［12］。橄欖醇合成酶（OLS）和橄欖酸環(huán)化酶（OAC）是聚酮合成途徑中的關鍵酶，在它們的作用下產(chǎn)生橄欖酸（olivetolic acid，OLA）。脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）是MEP途徑中的第一個酶，在植物激素調(diào)控、逆境抗性和病原體防御等生理過程中發(fā)揮著重要作用［13］，MEP途徑最終合成焦磷酸香葉酯（geranyl diphosphate，GPP）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)有3個差異表達基因被注釋為OLS基因，2個差異表達基因被注釋為OAC基因，2個差異表達基因被注釋為DXS基因，上述7個差異表達基因在T1-vs-CK組（0 ℃ /25 ℃）均上調(diào)表達，且在4個處理組中表達量最高。由此可見，T1組（0 ℃）處理促進提高OLS、OAC和DXS基因的表達，進而提高CBD含量。大麻異戊烯轉(zhuǎn)移酶4（CsPT4）和1（CsPT1）是大麻素生物合成的限速酶，催化GPP和OLA產(chǎn)生大麻二酚酸（CBGA）［14］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共有8個差異表達基因被注釋為PT基因，6個差異表達基因在 T1-vs-CK組（0 ℃/25 ℃）上調(diào)表達，上調(diào)表達的基因數(shù)量明顯高于其他處理組。大麻二酚合成酶（CBDAS）催化CBGA單萜部分氧化環(huán)化，轉(zhuǎn)化為大麻二酸（CBDA）。本研究數(shù)據(jù)中共有29個差異表達基因被注釋為CBDAS基因，13個差異表達基因在T1-vs-CK組（0 ℃/25 ℃）上調(diào)表達，上調(diào)表達的基因數(shù)量明顯高于其他處理組。

4 結(jié)論

溫度與植物生長發(fā)育、有機物產(chǎn)量的積累密切相關，不同溫度處理后對大麻CBD的含量和調(diào)控通路產(chǎn)生了不同影響。本研究中，0 ℃能顯著增加工業(yè)大麻葉中CBD含量，其機理可能是通過影響合成通路中OLS、OAC、PT、DXS和CSDAS關鍵酶基因的表達進而提高CBD含量。

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