外源褪黑素提高馬鈴薯幼苗UV-B輻射耐性的轉錄組學分析

摘要：隨著人類活動對大氣層臭氧的破壞，導致到達地面的UV-B輻射增強，而嚴重的UV-B輻射會直接導致馬鈴薯產量、品質大幅度降低。馬鈴薯作為云南省重要的糧食作物，由于云南省具有特殊的地理位置，使馬鈴薯面臨的UV-B輻射較為嚴峻。為探究褪黑素對增強馬鈴薯耐UV-B輻射的分子機制，以馬鈴薯品種合作88為試驗材料，對外源褪黑素處理UV-B輻射下的馬鈴薯葉片進行轉錄組測序，并進行基因本體（gene ontology，GO）功能聚類分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能聚類分析。結果表明，褪黑素可以促進馬鈴薯植株中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成及精氨酸、脯氨酸代謝，提高內質網上蛋白質的加工水平，促進抗氧化物質編碼基因的表達，激活UVR8等UV-B輻射的響應基因，從而緩解UV-B輻射對馬鈴薯植株的危害。綜上所述，適量濃度的褪黑素對提高馬鈴薯耐UV-B輻射有積極作用，研究結果可為馬鈴薯抗UV-B輻射機制解析提供新的證據，并為其抗UV-B輻射研究提供一定的分子基礎。

關鍵詞：馬鈴薯；UV-B輻射；褪黑素；轉錄組；GO功能分析；KEGG分析

中圖分類號：S532.01 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0064-08

收稿日期：2023-08-22

基金項目：海梅榮-科研發(fā)展基金（編號：KX900078000）。

作者簡介：劉 瑩（1999—），女，新疆喀什人，碩士研究生，主要從事作物生理生態(tài)與產量品質形成方面的研究。E-mail：1430441802@qq.com。

通信作者：海梅榮，博士，教授，碩士生導師，主要從事作物生產生理方面的研究。E-mail：2250029499@qq.com。

近年來，隨著科技及工業(yè)等人類生產活動的發(fā)展，導致大氣中的臭氧層變薄，臭氧含量減少。臭氧減少后會導致到達地表的紫外線B（UV-B）輻射量大大增加，從而對作物產生一定危害［1］。目前，UV-B輻射的加劇已經成為公認的全球十大環(huán)境問題之一［2］。根據Mckenzie的預測，再過30～40年，臭氧層的恢復也難以到達20世紀80年代的水平［3］。而臭氧層的減少和UV-B輻射的增加呈現1 ∶2的關系。已有研究發(fā)現，UV-B輻射增加會導致植物生長受到抑制［4］，從而降低植物生物量［5］，破壞植物的細胞結構，減少植物的凈光合作用，誘導植物中的毒性氧自由基增加，降低植物的抗氧化酶活性，導致植物膜脂過氧化，嚴重時甚至會改變細胞代謝，導致植物細胞死亡［6-8］。

前人研究發(fā)現，褪黑素可以調節(jié)植物的生長發(fā)育、調控光合效率及葉片衰老，增強植物對冷熱、滲透壓、干旱、重金屬等脅迫的耐受性［9-11］。根據前期生理試驗結果，褪黑素可以緩解UV-B輻射對馬鈴薯生長的抑制作用，但是目前關于增強UV-B輻射后褪黑素對馬鈴薯分子水平影響的研究較少。因此，本試驗擬通過外源施加褪黑素，研究褪黑素對增強UV-B輻射下馬鈴薯耐UV-B輻射的分子機制，從而為馬鈴薯抗UV-B輻射的機制解析提供新的證據，并為其抗UV-B輻射的研究提供一定的分子基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地及試驗品種

本研究在云南農業(yè)大學試驗基地大棚進行盆栽試驗，試驗材料為合作88。

1.2 試驗設計

待馬鈴薯幼苗生長至株高15 cm左右時進行處理。試驗所選的UV-B輻射強度、褪黑素濃度、處理方式均基于前期生理試驗結果［12］。當UV-B輻射強度為2.5 kJ/（m2·d），外源褪黑素濃度為 25 μmol/L 時，緩解效果最優(yōu)，因此選擇該處理條件下的馬鈴薯葉片進行轉錄組測序。共設計如下4個處理：CK為對照；T1處理，25 μmol/L褪黑素；T2處理，2.5 kJ/（m2·d）UV-B輻射；T3處理，25 μmol/L褪黑素+2.5 kJ/（m2·d）UV-B輻射。使用在線數據分析平臺（https：//www.omicshare.com）進行差異基因的分析、基因功能注釋、基因本體（gene ontology，GO）以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析及關鍵通路分析，篩選與抗UV-B輻射相關的響應基因。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序結果統計

在本次高通量測序中，對下機后經初步過濾得到的clean reads進一步進行更嚴格的過濾，得到高質量的基因序列，以39 028條基因作為參考，供后續(xù)信息分析。由表1可知，對12個樣本進行測序得到的已知基因數介于21 204～22 179個之間，新基因數介于2 968～3 085個之間。由表2可以看出，CK組已知的基因數為21 590 個，占測序總基因數的55.32%，發(fā)現的新基因數量為3 002個，檢測的總基因數為24 592個；T1處理的已知基因數為 21 937 個，占測序總基因數的56.21%，發(fā)現的新基因數為3 033個，檢測的總基因數為24 970個；T2處理的已知基因有21 964個，占測序總基因數的56.28%，發(fā)現的新基因有3 052個，檢測的總基因數為25 016個；T3 處理中，已知基因有21 907個，占測序總基因數的56.13%，發(fā)現的新基因有3 037個，檢測的總基因數為24 944個。

2.2 基因表達分析結果

2.2.1 所有樣品間基因表達水平分析 圖1-B為基因相對表達量的小提琴圖，一般用于基因豐度表達的可視化分析，可以展示任意位置的數據密度。綜合圖1-A、圖1-B可以看出，轉錄組測序數據檢測基因的表達靈敏度高，有利于差異表達基因的篩選。

2.2.2 不同處理間的差異表達基因分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）結果顯示，處理間差異顯著，表明所取樣本具有代表性（圖2-A）。為了獲得可靠的基因表達譜，選取log2（FC）＞1的reads進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）注釋。如圖2-B所示，從CK vs T1處理的比較組中共鑒定到287個基因上調表達，301個基因下調表達； 在CK vs T2處理組的差異表達基因中，有46個基因上調表達，41個基因下調表達；在CK vs T3處理組的差異表達基因中，有436個基因上調表達，584個基因下調表達；在T1處理vs T2處理組的差異表達基因中，有305個基因上調表達，568個基因下調表達；在T1處理vs T3處理差異表達基因中，有13個基因上調表達，15個基因下調表達；在T2處理vs T3處理組的差異表達基因中，有376個基因上調表達，351個基因下調表達。在CK vs T2處理、T2處理vs T3處理2組中，上調表達的基因數量略多于下調表達的基因數量；在CK vs T1處理、T1處理vs T3處理2組中，上調表達的基因數量略低于下調表達的基因數量；在CK vs T3處理、T1處理vs T2處理2組中，上調表達的基因數量明顯低于下調表達的基因數量。

2.3 馬鈴薯共同響應UV-B和褪黑素基因的分析

由圖3可以看出，在CK vs T1處理組中，上調表達的基因有287個，下調表達的基因有301個；在CK vs T2處理組中，上調表達的基因有46個，下調表達的基因有41個；在CK vs T1處理組、CK vs T2處理組中共同上調表達的基因有8個，共同下調表達的基因有13個。

2.3.1 CK vs T1處理和CK vs T2處理共同上調表達基因GO功能富集分析與KEGG功能富集分析 對在CK vs T1處理組、CK vs T2處理組中共同上調表達的8個基因進行GO功能富集分析，如圖4-A所示，在生物進程中，DEG主要參與代謝過程、細胞過程和單生物過程；在細胞組分中，DEG主要參與細胞、細胞組分、細胞器；在分子功能中，DEG主要參與催化活性、綁定和分子功能調節(jié)劑。

KEGG功能富集分析結果顯示，差異基因顯著富集在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代謝途徑（圖4-B）。對共同上調表達的基因中參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成的基因（編號：PGSC000/68nfq6NGi0SfAfhhvyMzZjyJcDoBvyEoioX1bolg3s=3DMG400012987）及精氨酸、脯氨酸代謝的基因（編號：PGSC0Z003DMG400009959）作熱圖分析（圖4-C），發(fā)現在UV-B輻射條件下，施加褪黑素后這2類基因高度表達，說明外源施加褪黑素能促進植物對纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成，并提高精氨酸、脯氨酸的代謝能力，從而對抗UV-B脅迫。

2.3.2 CK vs T1處理和CK vs T2處理共同下調表達基因GO功能富集分析與KEGG功能富集分析 對CK vs T1處理組和CK vs T2處理組中共同下調表達的13個基因進行GO功能富集分析。由圖5-A可以看出，在生物過程中，DEG主要參與細胞過程、生物過程的調控和生物調節(jié)等過程；在細胞組分中，DEG主要參與細胞、細胞組分、細胞器；在分子功能中，DEG主要參與核酸結合轉錄因子活性和催化活性。

進一步利用KEGG對下調表達的差異表達基因進行分析，圖5-B顯示，KEGG的功能富集在甘油脂代謝和代謝途徑。對甘油脂代謝相關的基因作了熱圖分析，圖5-C結果表明，CK中甘油酯代謝相關的基因高表達，其他處理組基因的相對表達量并不高，說明當有增強UV-B輻射或者在外源褪黑素出現的情況下，馬鈴薯植株中的甘油酯代謝被抑制。

2.4 褪黑素提高馬鈴薯耐UV-B輻射的基因分析

2.4.1 褪黑素正調控提高馬鈴薯耐UV-B輻射的基因分析 由圖6可知 CK vs T2處理組中下調表達的基因有41個，T2處理vs T3處理組中上調表達的基因有376個，CK vs T2處理組中下調表達的基因與T2處理vs T3處理組中共同上調表達的基因有9個；CK vs T2處理組中上調表達的基因有46個，CK vs T2處理組中上調表達的基因與T2處理vs T3處理組中共同上調表達的基因有1個。

對在CKvsT2處理組中下調表達與在T2處理vs T3處理組中上調表達交集的9個基因進行GO功能富集分析，結果見圖7-A。在生物進程中，DEG主要參與細胞過程、多有機體過程和應激反應；在細胞組分中，DEG主要參與細胞、細胞組分、細胞器；在分子功能中，DEG主要參與催化活性和綁定。

進一步利用KEGG對差異表達基因進行分析，圖7-B顯示，KEGG功能富集在內質網中的蛋白質加工。對內質網中與蛋白質加工相關的基因作熱圖分析，由圖7-C可以看出，在CK組中內質網上的蛋白質加工相對活躍。施加外源褪黑素后，內質網上的蛋白質加工表現得最為活躍。在增強UV-B輻射的條件下，未施加外源褪黑素時，內質網上蛋白質加工的活躍程度小于增強UV-B輻射的條件下施加外源褪黑素處理的馬鈴薯植株。說明施加外源褪黑素能提高內質網上的蛋白質加工水平，從而提高馬鈴薯植株的抗逆性。

2.4.2 褪黑素負調控增加對馬鈴薯耐UV-B輻射的基因分析 由圖6可知，在T2處理vs T3處理組中，下調表達的基因有351個；在CK vs T2處理組中上調表達的基因與T2處理vs T3處理組中下調表達的基因有15個；在T2處理vs T3處理組中下調表達的基因有351個；在CK vs T2處理組、T2處理vs T3處理組中共同下調表達的基因有1個。

對在CK vs T2處理組中上調表達與T2處理vs T3處理組中下調表達間交集的15個基因進行GO功能富集分析。如圖8-A所示，在生物過程中，DEG主要參與細胞過程、單生物過程和代謝過程；在細胞組分中，DEG主要參與細胞、細胞組分等；在分子功能中，DEG主要參與催化活性和綁定。

KEGG功能富集分析結果（圖8-B）顯示，差異基因顯著富集在次級代謝產物合成途徑和精氨酸、脯氨酸代謝合成途徑，因此本研究對次生代謝產物合成的相關基因和精氨酸、脯氨酸代謝合成的相關基因作了熱圖分析。由圖8-C可以看出，T2處理中精氨酸、脯氨酸相關基因的表達優(yōu)于其他處理，說明當馬鈴薯植株受到UV-B脅迫時，可以通過自身合成精氨酸、脯氨酸來對抗脅迫。

2.4.3 褪黑素介導UV-B受體基因和抗氧化物質基因的表達 如圖9所示，UV-B受體UVR8等大量下游基因在T2處理組上調表達，部分在CK處理組上調表達，但在T1處理組下調表達，表明施加外源褪黑素會抑制UV-B受體基因的表達。在褪黑素介導馬鈴薯耐UV-B輻射的抗氧化系統中，大量抗氧化物相關基因參與增強UV-B輻射的表達。有18個基因在T2處理組上調表達，剩下的13個基因在T2處理組中下調表達但在T3處理中的相對表達量相對T2處理上調，表明褪黑素會促進抗氧化物質基因的表達。

3 討論

對CK vs T1處理組和CK vs T2處理組中共同上調表達的基因進行KEGG分析，差異基因顯著富集在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代謝途徑。在T1、T2處理組中，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代謝相關基因的上調表達量明顯高于CK組，T3處理組相較于T1、T2處理組的基因上調表達程度更高，表明外源褪黑素、UV-B輻射的增強都可以使纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成量上調，使精氨酸、脯氨酸代謝相關基因上調表達，且當2種處理條件加成時，其效果更大。氨基酸是蛋白質的構成單位，馬鈴薯在面對UV-B逆境脅迫時或許可以通過調控氨基酸的合成從而產生逆境蛋白來提高對逆境的耐受性。

對CK vs T2處理組中上調表達與T2處理vs T3處理組中下調表達交集的基因進行KEGG分析發(fā)現，T2處理組中的精氨酸、脯氨酸相關合成基因上調表達，但在T1、T3處理組中并沒有發(fā)現這種現象，表明增強UV-B輻射會使馬鈴薯幼苗中精氨酸、脯氨酸合成相關基因上調表達，而外源褪黑素的施加并不會上調精氨酸、脯氨酸相關基因的表達量。脯氨酸相對表達量在前面的試驗中進行過測定，發(fā)現在未增強UV-B的情況下，確實出現了施加外源褪黑素后其濃度降低的現象，結合分子生物學數據，發(fā)現在未增強UV-B時，施用外源褪黑素會抑制脯氨酸的合成，在增強UV-B輻射的條件下，未施加褪黑素的植株中脯氨酸含量低于施加外源褪黑素的植株，其原因可能是雖然施加外源褪黑素會使脯氨酸的合成基因下調表達，但有可能會間接激活其他途徑，從而合成脯氨酸，因為大量試驗證明，在脅迫環(huán)境中施加外源褪黑素有利于提高脯氨酸的含量［13-15］。精氨酸是參與植物眾多生理過程信號分子多胺和一氧化氮的前體物質，也是植物體內重要的氮素儲藏營養(yǎng)物質［16］。有研究發(fā)現，外源多胺能夠提高植物的光合色素水平，增強光合能力和抗氧化能力，從而提高植物的耐脅迫能力，保護植物不受逆境的傷害［17］。一氧化氮是一種脂溶性生物活性分子，能夠在細胞內擴散，從而誘導防御基因的表達，它通過對蛋白質進行翻譯后修飾及與其他信號分子的互作來調控植物的防御反應［18］。因此在增強UV-B輻射的條件下，馬鈴薯幼苗可以通過提高精氨酸、脯氨酸含量來應對輻射脅迫［19］。

在本試驗中，T2處理組受到增強UV-B輻射后，馬鈴薯植株會上調UVR8等相關基因的表達量，從而保護植株免受輻射的損傷，但在T1處理組這些基因都被下調表達了。研究發(fā)現，CK組中部分基因是上調表達的，表明馬鈴薯幼苗自身的內源褪黑素也可以上調部分UV-B受體基因的表達量，但是外源褪黑素的施加并不利于UVR8等相關基因的表達。2002年人們才發(fā)現UV-B受體UVR8的存在，編碼UVR8的七葉螺旋槳蛋白首先從擬南芥中的UV-B超敏突變體（uvr8-1）中被鑒定出來。在沒有UV-B輻射的情況下，UVR8以二聚體的形式存在于細胞質中，二聚體之間通過二聚體界面上帶電氨基酸間的鹽橋連接在一起，當UVR8中特定色氨酸吸收UV-B射線后，同型二聚體變?yōu)榛钚詥误w并與組成型光合蛋白1（COP1）相互作用以啟動UVR8依賴性信號傳導，UVR8的C端有27個氨基酸的區(qū)域與COP1的C端wd40重復結構域結合，在受到UV-B輻射后，COP1可引導UVR8進入細胞核，UVR8和COP1之間的相互作用也需要對靶基因進行正向調控，包括HY5、HY5同源基因（HYH），它們編碼轉錄因子，調控UVR8介導反應的1個基因子集［20］。目前，關于UVR8在植物體內的生理功能的研究主要包括抑制下胚軸的生長、促進花青素和類黃酮的積累等［21］。類黃酮是植物抵御UV-B輻射增強的主要物質，對類黃酮含量的測定結果也表明，增強UV-B輻射會使類黃酮含量升高，前面的分子數據分析結果表明，次生代謝產物的合成基因被上調表達，而類黃酮是重要的次生代謝產物。綜合分析發(fā)現，類黃酮含量升高的原因是次生代謝產物的合成基因被上調表達、UVR8和UV-B受體被激活從而調控與類黃酮合成相關的下游基因的表達。因此，在增強UV-B輻射的條件下，可激活UVR8等UV-B受體來應對UV-B輻射的加強。在T1、T2處理組中，大量抗氧化物基因都上調表達，如與抗壞血酸和谷胱甘肽合成相關的基因，在前面的試驗中測定抗壞血酸、谷胱甘肽的含量發(fā)現，在施加外源褪黑素、增強UV-B輻射處理下，其含量升高，表明施加外源褪黑素、增強UV-B輻射都可以提高馬鈴薯幼苗合成抗氧化物質的能力。在T2處理組中下調表達的基因在T3處理組中上調表達，說明在合成抗氧化物質時，施加外源褪黑素和增強UV-B輻射的作用可以互補。

4 結論

通過對GO功能聚類分析及KEGG功能聚類分析，發(fā)現褪黑素可以促進馬鈴薯植株中纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成量及精氨酸、脯氨酸的代謝，并可提高內質網上蛋白質的加工水平，促進抗氧化物質基因的表達，激活UVR8等與UV-B輻射相關的響應基因來促進馬鈴薯植株生長。

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