枳DREB基因家族的鑒定及其對非生物脅迫的響應

摘要：為了解枳（Poncirus trifoliata）DREB基因家族參與非生物脅迫的調(diào)控機制，基于枳基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學方法對枳DREB基因家族成員（PtrDREB）進行全基因組鑒定，討論PtrDREB各基因的物種進化關(guān)系及各基因在不同組織中的表達模式，并用 qRT-PCR 技術(shù)檢測9個PtrDREB家族成員在非生物脅迫處理下的相對表達量。結(jié)果表明，從枳基因組中共鑒定出48個DREB成員，不均勻地分布在9條染色體上，這些DREB成員編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列長度范圍為144～639 aa，相對分子量范圍為15 638.35～76 776.34 u，等電點的范圍為4.72～9.62，均為親水性蛋白；34個PtrDREB亞細胞定位于細胞核中；48個PtrDREB基因分為5個亞族；DREB基因的啟動子順式作用元件含有大量光響應、植物激素、非生物脅迫及植物生長發(fā)育響應元件；DREB基因家族在不同組織中的表達具有明顯差異，在根、果實、葉片、胚珠、種子和幼芽中高表達的基因數(shù)目分別為17、13、4、4、6、8個；qRT-PCR數(shù)據(jù)表明，在經(jīng)過低溫、高溫和干旱處理后，9個PtrDREB基因中分別有8、6、1個基因上調(diào)表達，上調(diào)幅度分別為1.27～5.85、1.44～2.05、2.06倍，因此推測PtrDREB家族成員在非生物脅迫中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：枳；DREB基因家族；生物信息學；非生物脅迫

中圖分類號：S184；S666.401 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0053-11

收稿日期：2023-09-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：32160731）；江西省教育廳科學技術(shù)研究項目（編號：GJJ2201233）；贛南師范大學研究生創(chuàng)新基金（編號：YCX23A038）。

作者簡介：范麗珍（1995—），女，江西九江人，碩士研究生，主要從事柑橘功能基因挖掘與驗證方面的研究。E-mail：1035934736@qq.com。

通信作者：李興濤，博士，副教授，主要從事果樹逆境植物生理方面的研究。E-mail：lixt.gnnu@qq.com。

脫水反應元件結(jié)合蛋白（dehydration responsive element binding protein，DREB）屬于AP2/ERF家族，是一類存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)域由60～70個氨基酸組成，能特異性結(jié)合DRE/CRT元件，由此調(diào)控下游含DRE/CRT元件的抗逆性基因［1］。DREB家族蛋白在植物中廣泛存在，目前人們已經(jīng)分別在擬南芥［2］、水稻［2］、玉米［3］、大豆［4］和甘藍［5］中鑒定到57、57、49、73、91個DREB基因成員。Nakano等將擬南芥DREB基因家族分為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6等6個亞族，每個亞族的DREB基因發(fā)揮不同的生理功能［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物應對干旱、低溫及高鹽等脅迫的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在擬南芥中過表達小麥TaDREB3基因，能夠提高小麥對高溫、鹽的耐受性，在鹽、高溫處理下，分別有83%、55% TaDREB3-AI轉(zhuǎn)基因擬南芥存活，而在相同條件下，野生型擬南芥分別僅有20%、21%存活［6］。在擬南芥中超表達結(jié)縷草ZjDREB1.4基因可以顯著增強擬南芥對低溫、高溫的耐性［7］，在水稻中過表達擬南芥AtDREB1A基因可以增強水稻對干旱和低溫的脅迫［8］。Shi等研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3能夠提高擬南芥對鹽、干旱和低溫脅迫的耐受性以及對丁香假單胞菌的抗性［9］。在菊花中過表達CmDREB6基因后，提高了菊花的耐熱性，2種轉(zhuǎn)基因菊花株系的存活率分別為85%和50%，而野生型菊花僅有3.8%的存活率［10］；在菊花中過表達擬南芥AtDREB1A基因也可以增強菊花對熱脅迫的耐受性，在高溫處理下有70.8%的轉(zhuǎn)基因植株存活，而野生型植株僅有16.3%存活［11］。對黃瓜進行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)CsDREB07、CsDREB33、CsDREB41基因的相對表達量與對照相比分別上調(diào)了2.95、2.37、2.06倍［12］。目前，對DREB基因的研究主要集中于擬南芥和其他植物，關(guān)于多年生果樹的研究較少。

本研究擬用生物信息學方法對枳（Poncirus trifoliata）PtrDREB基因家族成員進行鑒定和系統(tǒng)性分析，用實時熒光定量qRT-PCR技術(shù)分析PtrDREB基因家族成員在低溫、高溫及干旱這3個非生物脅迫下的表達模式，以期為進一步研究PtrDREB基因家族的生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2022年6月至2023年8月在贛南師范大學國家臍橙工程研究中心進行。以枳橙品種作為研究試樣。待枳苗生長1年時，選擇生長良好的植株分別進行低溫［（0±0.5） ℃］、高溫［（38.0±0.5） ℃］和干旱（15%PEG-6000）逆境脅迫處理。收集處理0、3、6、12 h后的葉片，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃低溫保存待用，試驗設置3個生物學重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 枳DREB基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析 從CPBD（http：//citrus.hzau.edu.cn/index.php）中下載枳的全基因組數(shù)據(jù)。在UniProt數(shù)據(jù)庫中下載57個擬南芥DREB基因家族的氨基酸序列，并將其作為參考序列，對枳蛋白序列進行本地BLAST搜索，閾值設置為e×10-5。從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org）中下載DREB基因的隱馬爾科夫模型（PF00847），用HMMER軟件對枳蛋白數(shù)據(jù)庫進行搜索，獲取PtrDREB家族成員，對BLAST、HMMER的結(jié)果進行合并分析。通過CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term）、SMART（https：//smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）和PfamScan（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/）等工具進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的驗證，僅保留含有1個AP2結(jié)構(gòu)域，且第14位氨基酸為纈氨酸（V）、第19位氨基酸為谷氨酸（E）的蛋白序列，刪除沒有AP2結(jié)構(gòu)域及含有2個AP2及AP2-B3結(jié)構(gòu)域的序列［13］。根據(jù)枳DREB基因家族成員在染色體上的分布，對其進行命名。用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對PtrDREB家族成員進行理化性質(zhì)分析。通過Wolf Psorf（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html/）進行亞細胞定位的預測。

1.2.2 枳DREB基因家族成員的染色體定位、二級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 使用TBtools獲取枳染色體長度和PtrDREB基因在染色體上的位置信息，將染色體長度和PtrDREB基因位置信息上傳至M2G2（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0），繪制PtrDREB基因的染色體位置圖。用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）對PtrDREB蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測分析。基于擬南芥的57個AtDREB蛋白序列與鑒定的枳PtrDREB蛋白序列，使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 枳DREB基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)motif分析 將PtrDREB家族成員的基因序列和編碼序列（CDS）提交至GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）進行基因結(jié)構(gòu)的可視化分析。通過MEME（http：//meme-suite.org）分析PtrDREB蛋白的motif，數(shù)量設置為10，用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）進行可視化分析。

1.2.4 枳DREB基因家族成員的共線性分析和順式作用元件預測 用TBtools進行枳基因組的共線性分析，獲得PtrDREB基因家族的共線性關(guān)系。用TBtool軟件提取PtrDREB基因的啟動子上游 2 000 bp 的序列，將其提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件的預測。

1.2.5 枳DREB基因家族成員在不同組織的表達從CPBD中下載枳根、葉片、果實、芽和種子等組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取PtrDREB家族成員相應的表達量，使用R中的pheatmap包繪制PtrDREB表達量熱圖，基因相對表達量的上調(diào)、下調(diào)表示分別用紅色、藍色表示。

1.2.6 枳DREB基因家族成員在不同脅迫處理下的qRT-PCR分析 結(jié)合PtrDREB的組織表達分析和啟動子順式作用元件預測結(jié)果，選擇9個成員，利用Premier 5設計PtrDREB基因的 qRT-PCR 引物（表1）。總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成及qRT-PCR反應體系試驗均用杭州新景生物試劑盒（SIMGEN）完成，以柑橘ACTB［14］基因作為內(nèi)參基因，在Light-Cycler 480（Roche，Basel，瑞士）儀器上進行PCR，流程如下：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品重復測定3次，基因的相對表達量用 法［15］計算，在DPS軟件中用Duncans新復極差法進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，最后用Sigmaplot 14.0軟件繪制相對表達量圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枳DREB基因家族的鑒定和結(jié)構(gòu)分析

通過對枳基因組的分析，共鑒定到48個PtrDREB基因家族成員，將其命名為PtrDREB1～PtrDREB48（表2）。枳PtrDREB基因的蛋白質(zhì)編碼氨基酸數(shù)量在144～639 aa之間，相對分子量最大的為76 776.34 u，最小的為15 638.35 u，平均相對分子量為28 059.64 u。48個PtrDREB基因的等電點范圍為4.72～9.62，其中21個（占比為43.75%）成員呈堿性（pH值>7），27個（占比為56.25%）成員呈酸性（pH值<7）。在48個PtrDREB蛋白中，大部分都是不穩(wěn)定蛋白，僅PtrDREB12、PtrDREB28、PtrDREB37屬于穩(wěn)定蛋白。該基因家族的蛋白脂溶指數(shù)為51.57～79.24。蛋白質(zhì)的疏水性分析結(jié)果表明，48個PtrDREB蛋白具有高親水性，親水性指數(shù)（H）均小于0，屬于親水蛋白。亞細胞定位結(jié)果顯示，37個PtrDREB蛋白定位在細胞核，其他蛋白分別定位于細胞質(zhì)（3個）、葉綠體（5個）及線粒體（3個）。

PtrDREB蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，PtrDREB蛋白中α-螺旋（AH）、延伸鏈（ES）、β-折疊（BT）、無規(guī)則卷曲（RC）的占比分別為 18.67%～45.05%、3.74%～23.08%、1.65～8.33%、39.53%～69.35%，無規(guī)則卷曲的占比最高，是PtrDREB蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成部分（表2）。

2.2 枳DREB基因家族成員在染色體定位分析

根據(jù)PtrDREB基因的位置信息，獲得其在染色體上的定位（圖1），48個DREB基因分布在枳的9條染色體上，3號染色體上分布的PtrDREB基因最多，有18個，2號染色體上分布8個PtrDREB基因，7、9號染色體上各分布5個PtrDREB基因，5號染色體上分布4個PtrDREB基因。Chr2、Chr4、Chr6和ChrUn均包含2個PtrDREB基因。

2.3 枳DREB基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用鄰接法生成擬南芥（57個DREB蛋白）和枳（48個DREB蛋白）的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。將枳的48個DREB基因分為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6共6個亞族，枳最大的亞族為A-6，含有14個PtrDREB。在枳所有PtrDREB成員中，A-1、A-2、A-4、A-5亞族分別有4、10、12、8個成員；枳沒有A-3亞族成員，系統(tǒng)發(fā)育樹中A-3亞族僅含有擬南芥1個成員。

2.4 枳DREB基因家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

枳DREB基因內(nèi)含子、外顯子組成及PtrDREB蛋白的motif分析結(jié)果（圖3）顯示，34個（70.83%）PtrDREB基因不包含內(nèi)含子，12個PtrDREB基因（25%）包含1個內(nèi)含子，PtrDREB8基因含有3個內(nèi)含子，而PtrDREB22基因含有的內(nèi)含子最多，有5個，表明PtrDREB基因結(jié)構(gòu)相對保守。由圖3-B可以看出，motif 1存在于所有PtrDREB蛋白中，大多數(shù)PtrDREB蛋白都含有motif 2、motif 3和motif 4，motif 5存在于A-1、A-4亞族中，此外A-5亞族的PtrDREB6、PtrDREB21、PtrDREB33基因中也含有motif 5，motif 6僅在A-1亞族和PtrDREB13、PtrDREB45基因中發(fā)現(xiàn)，而motif 9是PtrDREB44、PtrDREB48基因所特有的。

2.5 枳DREB基因家族成員的共線性分析

從PtrDREB基因家族中共檢測到9對片段復制基因（圖4），其中A-1、A-5亞族各有1對，分別是PtrDREB14-PtrDREB46、PtrDREB32-PtrDREB41，A-2、A-4亞族各有2對，分別是PtrDREB2-PtrDREB39、PtrDREB4-PtrDREB39和PtrDREB3-PtrDREB40、PtrDREB5-PtrDREB40，而PtrDREB9-PtrDREB24、PtrDREB29-PtrDREB35、PtrDREB34-PtrDREB37共3對基因則屬于A-6亞族 另外在1號染色體上檢測到2對串聯(lián)重復基因PtrDREB4-PtrDREB2、PtrDREB3-PtrDREB5，在3號染色體上有1對串聯(lián)重復基因PtrDREB15-PtrDREB27。這些存在共線性關(guān)系的基因占PtrDREB基因的比例為37.5%。

本研究計算了PtrDREB串聯(lián)基因、片段重復基因的Ka/Ks（表3），以確定促進PtrDREB家族進化的選擇類型。9對片段重復基因?qū)Φ腒a/Ks為 0.11～0.26，4對串聯(lián)重復基因?qū)Φ腒a/Ks為0.14～0.25，所有基因?qū)Φ腒a/Ks均<1.00。上述結(jié)果表明 在PtrDREB基因的進化過程中可能發(fā)生了純化選擇。

2.6 枳DREB基因家族成員的順式作用元件分析

用PlantCARE對PtrDREB上游的2 000 bp序列進行分析，結(jié)果（圖5）表明，在48個PtrDREB基因中共預測到1 369個順式作用元件，主要包括植物激素響應元件、脅迫響應元件和植物生長發(fā)育元件。其中，417個（30.46%）元件參與對脫落酸、生長素、茉莉酸甲甲酯、赤霉素和水楊酸等激素的響應。在1 369個元件中，有258個（18.85%）元件參與對低溫、干旱及防御與脅迫等逆境脅迫的響應，19個PtrDREB含有1個或多個低溫響應元件。44個PtrDREB包含1～13個脫落酸響應元件，28個PtrDREB包含1～3個干旱響應元件，24個PtrDREB包含1～3個防御與脅迫響應元件?？傊樖皆治鼋Y(jié)果表明，所有PtrDREB基因中都至少有1種參非生物脅迫的順式作用調(diào)控元件。

2.7 枳DREB基因在不同組織的表達分析

根據(jù)枳根、葉、芽等不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制PtrDREB基因在組織中的相對表達量熱圖。圖6結(jié)果顯示，17個PtrDREB在根中高表達，13個PtrDREB在果實中高表達，PtrDREB基因在葉、胚珠中高表達的數(shù)量最少，都只有4個，相對表達量最高的分別是PtrDREB37、PtrDREB43；在枳種子、芽中高表達的基因分別有6、8個。

2.8 枳DREB基因家族在不同非生物脅迫處理下的表達分析

結(jié)合PtrDREB基因家族在不同組織中的表達熱圖及啟動子順式作用元件的預測結(jié)果，在48個基因中選取9個成員，用qRT-PCR技術(shù)檢測低溫、高溫和干旱脅迫處理的PtrDREB相對表達量。由圖7可以看出，PtrDREB16、PtrDREB22、PtrDREB48的相對表達量在低溫處理6 h后分別上調(diào)了4.08、5.85、4.15倍，PtrDREB2、PtrDREB14、PtrDREB32、PtrDREB37和PtrDREB47的相對表達量在低溫處理12 h后達到峰值，上調(diào)幅度為1.94～3.26倍，僅PtrDREB38的相對表達量沒有上調(diào)。在高溫脅迫處理后，PtrDREB2、PtrDREB16、PtrDREB32的相對表達量分別上調(diào)了2.02、2.02、1.44倍，其他基因的表達水平總體變化不大。在干旱脅迫處理后，PtrDREB47的相對表達量在干旱處理3、12 h達到峰值，分別上調(diào)2.06、2.02倍，另外8個PtrDREB基因的相對表達量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。

3 討論

Nakano等分別構(gòu)建了擬南芥、水稻ERF基因家族的無根系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)進化關(guān)系，擬南芥、水稻DREB基因家族均被劃分為6個亞族［2］。在本研究中，系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果同樣為6個亞族，但是48個PtrDREB只有5個亞族，A-3亞族缺少枳DREB基因家族成員，在番茄與擬南芥的進化樹中，同樣發(fā)現(xiàn)番茄也缺少A-3亞族的成員［16］，本研究結(jié)果與之一致?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，少數(shù)PtrDREB基因含有1～5個內(nèi)含子，不含內(nèi)含子的PtrDREB基因占比高達70.83%，在其他物種中也發(fā)現(xiàn)DREB基因不含有內(nèi)含子的成員占比很高，如黃瓜（78.18%）［12］、大豆（68.3%）［4］、馬鈴薯（87.69%）［17］以及甘藍型油菜（79.8%）［18］。一個沒有內(nèi)含子或者內(nèi)含子數(shù)量少的基因，其轉(zhuǎn)錄速度比內(nèi)含子數(shù)多的基因快，沒有內(nèi)含子的基因無需進行剪接，能夠更快地產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物［19］，70.83% PtrDREB基因不含有內(nèi)含子，可能是應對快速響應逆境脅迫的進化行為。依據(jù)枳DREB基因的復制事件分析可知，PtrDREB家族成員中存在9對染色體片段復制和3對染色體串聯(lián)復制，說明在枳DREB基因進化過程中，染色體片段復制是其進化的一個重要過程。

大量研究發(fā)現(xiàn)，DREB基因在植物響應逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。過表達DREB基因可以增強擬南芥［20-22］、水稻［23-24］、煙草［25-26］、馬鈴薯［27-28］等多種植物抗旱、耐低溫、抗凍和耐鹽的表達特性。本研究利用實時熒光定量技術(shù)檢測3個逆境脅迫條件（分別是低溫、高溫和干旱脅迫）下9個PtrDREB基因的相對表達量，發(fā)現(xiàn)與對照相比，PtrDREB2、PtrDREB14、PtrDREB16、PtrDREB22、PtrDREB32、PtrDREB37、PtrDREB47和PtrDREB48共8個基因響應低溫脅迫，PtrDREB2、PtrDREB14、PtrDREB16、PtrDREB22、PtrDREB32和PtrDREB47共6個基因響應高溫脅迫，僅PtrDREB47基因積極響應干旱脅迫，進一步說明枳PtrDREB基因家族參與非生物脅迫響應。本研究對枳DREB基因家族進行鑒定及其表達分析，為進一步探索枳DREB基因參與逆境響應的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究基于枳基因組數(shù)據(jù)庫，用生物信息學對枳DREB基因家族進行全基因組鑒定和分析，鑒定出48個DREB基因，利用實時熒光定量技術(shù)檢測其中9個基因響應非生物脅迫的相對表達量。研究結(jié)果顯示，PtrDREB基因家族分布在9條染色體上，被劃分為5個亞族，18個基因發(fā)生了基因復制事件，qRT-PCR結(jié)果顯示，9個PtrDREB基因?qū)Φ蜏?、高溫和干旱等脅迫都有響應，推測枳DREB基因家族可能參與了非生物脅迫的應答。

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