十字花科作物根腫病研究進展

摘要：根腫病是由蕓薹根腫菌侵染引起的一種土傳病害，是制約十字花科蔬菜、油料作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素之一。根腫病具有發(fā)病面積廣、傳播途徑多、防治難度大等特點，除了直接導(dǎo)致作物減產(chǎn)外，根腫病病原的休眠孢子能在土壤中長時間存活，造成田塊長期帶菌，從而影響后續(xù)十字花科作物種植?；趪鴥?nèi)外研究人員在根腫病病原的生活史、致病機制和根腫病綜合防治等方面取得的重要研究進展，本文綜述了影響休眠孢子萌發(fā)的生物因素及蕓薹根腫菌的初侵染與再侵染過程，蕓薹根腫菌的基因組特征與效應(yīng)蛋白功能，蕓薹根腫菌的生理小種鑒定，基于監(jiān)測預(yù)警、農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治的根腫病綜合防治技術(shù)研發(fā)現(xiàn)狀，同時探討了當(dāng)前根腫病研究中存在的問題和未來的發(fā)展方向，以期為根腫病綜合防治關(guān)鍵技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用提供借鑒。

關(guān)鍵詞：根腫病；蕓薹根腫菌；休眠孢子；致病機制；綜合防治

中圖分類號：S436.3；S435.654 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0001-07

收稿日期：2023-09-04

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（22）3159］；江蘇省重點研發(fā)計劃（社會發(fā)展）項目（編號：BE2022788）。

作者簡介：余方偉（1986—），男，浙江臺州人，博士，副研究員，主要從事甘藍抗病機制及遺傳育種研究。E-mail：yfw@jaas.ac.cn。

通信作者：王神云，博士，研究員，主要從事甘藍抗病、抗逆機制及遺傳育種研究。E-mail：wangshenyun@jaas.ac.cn。

十字花科作物既是日常蔬菜的重要組成部分，也是植物油脂的重要原料，在全國各地普遍栽培，并且在出口創(chuàng)匯中占有重要地位。蔬菜產(chǎn)業(yè)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019年我國種植面積和出口量排行前十的蔬菜之一來自于十字花科蕓薹屬［1］。十字花科作物在生產(chǎn)過程中面臨多種病害的侵襲，由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）引起的根腫病是其重要病害之一，在全球多個國家均有不同程度發(fā)生，造成年平均10%～15%的產(chǎn)量損失［2-3］。根腫病傳播速度快，在我國多個省份均有分布，常年危害面積320萬～400萬hm2，占十字花科作物栽培面積的1/3以上［4］。除了直接導(dǎo)致作物減產(chǎn)外，蕓薹根腫菌的休眠孢子能在土壤中存活達20年之久［5］，因此在休眠孢子污染的田塊上種植十字花科作物將有極大減產(chǎn)風(fēng)險。本文綜述了國內(nèi)外研究人員在蕓薹根腫菌的生活史、基因組、效應(yīng)蛋白、生理小種鑒定和根腫病綜合防治方面取得的重要研究進展，并就存在的問題和未來的發(fā)展方向進行探討。

1 蕓薹根腫菌的生活史

不同于其他植物病原，蕓薹根腫菌是一種專性寄生于植物細胞內(nèi)的原生生物，主要通過吞噬寄主植物的細胞器來獲取養(yǎng)分［6］。休眠孢子萌發(fā)是蕓薹根腫菌侵染的起始階段，以往研究發(fā)現(xiàn)，一些非寄主和寄主植物的根系分泌物能刺激休眠孢子萌發(fā)［7］。值得一提的是，這些根系分泌物的作用效果并不是寄主特異的，與寄主植物歐洲油菜（Brassica napus）和白菜（B. rapa var. glabra Regel）的根系分泌物相比，非寄主植物黑麥草（Lolium perenne）的根系分泌物促進休眠孢子萌發(fā)的效果更明顯［7］。然而，近期研究結(jié)果表明，土壤細菌菌群而非植物根系分泌物才是刺激休眠孢子萌發(fā)的直接因素，其中寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）及無色桿菌屬（Achromobacter）成員的富集與休眠孢子萌發(fā)率的提高呈正相關(guān)［8］。

目前，蕓薹根腫菌生活史的具體過程還存在爭議［9］。近年來，Liu等借助掃描電子顯微鏡、熒光染料和共聚焦顯微鏡，研究并完善了根腫病病原的初侵染和再侵染過程（圖1）［9］。在初侵染階段，休眠孢子萌發(fā)釋放一個橢圓形或梨形、雙鞭毛的初級游動孢子。初級游動孢子吸附在寄主植物根毛或根表皮細胞上形成包囊，然后通過在管腔（rohr）內(nèi)形成的棘桿（stachel）穿透寄主植物細胞壁［10］。在寄主細胞內(nèi)，類似變形蟲的病原經(jīng)過核分裂形成多核的初級原質(zhì)團，然后發(fā)育成可以形成游動孢子囊的多核原質(zhì)團，再在發(fā)生胞質(zhì)分裂后產(chǎn)生單核游動孢子囊。每個單核游動孢子囊在相繼發(fā)生核分裂和胞質(zhì)分裂后產(chǎn)生次級游動孢子。次級游動孢子之間發(fā)生接合，產(chǎn)生二倍體合子［9］。在再侵染階段，次級游動孢子在根皮層細胞內(nèi)發(fā)育成單核次級原質(zhì)團，經(jīng)有絲分裂和營養(yǎng)生長發(fā)育成多核次級原質(zhì)團，最后經(jīng)減數(shù)分裂形成單核休眠孢子［9］。受害植物出現(xiàn)矮化、葉片萎蔫、根系腫大癥狀，病根含有大量的休眠孢子（圖2）。根腫病病原在侵染寄主過程中同時存在不同的發(fā)育形態(tài)，因而呈現(xiàn)出發(fā)育不同步現(xiàn)象，隨著時間的推移，休眠孢子占比增加［9］。休眠孢子的細胞壁含有幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組分，但不含有殼聚糖和纖維素［11］。此外，休眠孢子富含脂滴［12］，可能有助于其在土壤中長期存活。

2 蕓薹根腫菌的基因組與效應(yīng)蛋白

基因組包含病原的重要遺傳信息，對于致病機制的解析具有重要意義。然而，蕓薹根腫菌必須依賴感病植物進行擴繁，這給其基因組DNA的提純帶來諸多困難，一定程度上推遲了該病原的基因組研究。Schwelm等基于454 DNA測序和Illumina短讀長測序技術(shù)，率先完成了單孢分離株e3的全基因組測序，獲得了蕓薹根腫菌的基因組（24 Mb）［13］。該基因組由165個重疊群（contig）組成，具有基因總數(shù)少（9 730個預(yù)測的蛋白編碼基因）、基因密度高、重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子占比低（5.4%）等特點［13］。進一步分析發(fā)現(xiàn)，蕓薹根腫菌在多個代謝途徑上呈現(xiàn)出活體營養(yǎng)型病原的特征：硫和氮吸收相關(guān)基因缺失；組氨酸、色氨酸、蘇氨酸、精氨酸、賴氨酸及硫胺素生物合成基因缺失；脂肪酸合酶基因缺失，不能

從頭合成脂肪酸［13］。蕓薹根腫菌還具備干擾寄主激素穩(wěn)態(tài)的潛在能力：PbGH3的異源表達產(chǎn)物能在離體條件下結(jié)合生長素和茉莉酸；異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因和細胞分裂素氧化酶基因的編碼產(chǎn)物可能影響寄主的細胞分裂素穩(wěn)態(tài)；PbBSMT的編碼產(chǎn)物具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可使水楊酸發(fā)生甲基化［13-14］。就細胞壁降解酶而言，在蕓薹根腫菌中，僅極少部分的預(yù)測蛋白質(zhì)含有與植物細胞壁組分降解或修飾相關(guān)的結(jié)構(gòu)域［13］。此外，有13個預(yù)測的幾丁質(zhì)合酶基因存在于e3基因組上［13］。Stjelja等借助PacBio長讀長測序數(shù)據(jù)，進一步提高了組裝質(zhì)量，最終獲得了近乎完整的e3基因組（25.1 Mb）［15］。該基因組包含了由19個重疊群組成的核基因組和 114 663 bp 的線粒體基因組，核基因組編碼了9 231個預(yù)測的蛋白質(zhì)，而線粒體基因組則包含32個蛋白編碼基因、28個結(jié)構(gòu)RNA編碼基因和19個開放閱讀框［15］。隨著高通量測序技術(shù)的不斷普及，越來越多的蕓薹根腫菌基因組被公布，目前NCBI共收錄了50個該病原的基因組組裝數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/？taxon=37360）。

基因功能研究是揭示病原致病機制的重要方式。2015年之前，已有部分蕓薹根腫菌基因被克隆［16］；自2015年以來，隨著該病原基因組研究的興起［13］，促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)通路基因［17］、免疫親和蛋白基因［18］、E3泛素連接酶基因［19］、蛋白磷酸酶基因［20］和糖轉(zhuǎn)運蛋白基因［21］又得到系統(tǒng)鑒定。然而，受限于根腫病病原的獨特生活方式，上述基因的功能驗證難以在其本體上開展。

病原在與寄主互作過程中會分泌一些小RNA、次生代謝物和效應(yīng)蛋白來促進侵染。蕓薹根腫菌e3的預(yù)測蛋白質(zhì)組中存在553個分泌蛋白［13］，對這些潛在的效應(yīng)蛋白進行研究可為其致病機制解析提供新視角。目前，關(guān)于蕓薹根腫菌效應(yīng)蛋白大規(guī)模篩選的研究已見諸多報道［22-23］，但僅有少數(shù)效應(yīng)蛋白的功能被揭示（表1）。Pro1具有絲氨酸蛋白酶活性，能促進蕓薹根腫菌休眠孢子萌發(fā)［24］。PbBSMT在受蕓薹根腫菌侵染的寄主根系中大量表達，其編碼產(chǎn)物具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可使水楊酸發(fā)生甲基化，形成水楊酸甲酯［13-14］。與野生型相比，過表達PbBSMT的擬南芥（Arabidopsis thaliana）株系具有較低的本底水楊酸積累，因此對根腫病的易感性增強［25-26］。SSPbP53是一個半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，能與擬南芥半胱氨酸蛋白酶AtXCP1互作，從而促進根腫病發(fā)生，而AtXCP1基因突變降低了根腫病的發(fā)病程度［27］。PBZF1通過與擬南芥SnRK1.1激酶互作來促進蕓薹根腫菌侵染［28］。PbChiB2和PbChiB4能夠結(jié)合幾丁質(zhì)，抑制幾丁質(zhì)觸發(fā)的植物免疫反應(yīng)［29］。

3 蕓薹根腫菌的生理小種鑒定

根據(jù)對不同寄主植物的致病性差異，蕓薹根腫菌可分成多個生理小種（pathotype）。多年以來，Williams clubroot differential（WCD）［30］、European clubroot differential（ECD）［31］、Somé clubroot differential（SCD）［32］鑒別系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于蕓薹根腫菌的生理小種鑒定。但在21世紀(jì)初，隨著抗根腫病品種逐漸應(yīng)用到生產(chǎn)中，原有的生理小種鑒別系統(tǒng)已經(jīng)難以滿足需求，隨后又相繼建立了Canadian clubroot differential（CCD）［33］和Sinitic clubroot differential（SCD）［34］鑒別系統(tǒng)。由于上述鑒別系統(tǒng)都是建立在病情指數(shù)評價的基礎(chǔ)上，實際操作時往往耗時費力。為了簡化鑒定流程，國際上一些研究組嘗試在分子水平上區(qū)分其生理小種，成功找到了WCD鑒別系統(tǒng)中4號［35］、5號［36］、7號［37］生理小種的特異序列。此外，Tso等基于RNase H2-dependent PCR（rhPCR）和SNaPshot技術(shù)對CCD鑒別系統(tǒng)中的5X和3H生理小種進行了分子鑒定［38］。自然條件下，不同菌株存在混合生長現(xiàn)象［39］，因此建議先進行根腫病病原的單孢分離，以提高生理小種鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 根腫病綜合防治

4.1 菌源量監(jiān)測與根腫病風(fēng)險預(yù)警

菌源量是決定根腫病發(fā)生、危害程度的關(guān)鍵因素。當(dāng)1 g土壤中的休眠孢子數(shù)量超過1 000個時，根腫病發(fā)生風(fēng)險較大［40］。Xing等進一步將根腫病發(fā)生風(fēng)險分為3個等級：輕風(fēng)險（<1×104個休眠孢子/g土）、中風(fēng)險（1×104個休眠孢子/g土～1×106個休眠孢子/g土）和重風(fēng)險（>1×106個休眠孢子/g土）［41］。為有效遏制根腫病的發(fā)生蔓延，建立一套可行的快速檢測技術(shù)和風(fēng)險預(yù)警機制尤為重要。目前，蕓薹根腫菌休眠孢子的檢測多采用熒光定量PCR。Wallenhammar等基于rDNA序列建立了土壤中休眠孢子的檢測體系，該體系的檢測下限為500個休眠孢子/g土［42］。Chai等基于18S rDNA序列建立了畜禽糞便中休眠孢子的檢測體系［43］。關(guān)格格等基于ITS序列建立了土壤和種子中休眠孢子的檢測體系，其對土壤樣品的檢測下限為1 000個休眠孢子/g土，對種子的檢測下限為1×105個休眠孢子/g種子［44］。Xing等基于rDNA序列建立的休眠孢子檢測體系的靈敏度為10個休眠孢子/mL、100個休眠孢子/g土、1 000個休眠孢子/g根、1 000個休眠孢子/g種子［41］。柴阿麗等基于18S rDNA序列建立了休眠孢子檢測體系，其對土壤和基質(zhì)的檢測下限均為10個休眠孢子/g［40］。雖然目前熒光定量PCR在蕓薹根腫菌休眠孢子定量檢測方面的應(yīng)用較為普遍，但該方法對不同土壤樣本的檢測能力不同，也不能有效區(qū)分孢子的活力。相比之下，微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）對不同土壤樣本的測試結(jié)果更為穩(wěn)定，但當(dāng)土壤樣本中的休眠孢子濃度過高（≥107個休眠孢子/g土）時，該方法的準(zhǔn)確性降低［45］。另外，Al-Daoud等通過使用疊氮溴化丙錠預(yù)處理來抑制無活力孢子來源的基因組DNA的擴增，從而建立了有活力孢子的檢測方法［46］。

4.2 農(nóng)業(yè)防治

目前，根腫病的農(nóng)業(yè)防治包括以下方面。一是土壤調(diào)理。通過調(diào)節(jié)土壤酸堿度，創(chuàng)造不利于根腫病發(fā)病的土壤環(huán)境。二是遏制根腫病擴散，消減菌源。加強田間管理，農(nóng)用機械和設(shè)備使用后要及時清理、消毒。三是輪作。與其他非寄主作物進行2年以上的輪作可以降低土壤中蕓薹根腫菌的菌源量，從而減輕根腫病的危害［47］。四是適當(dāng)調(diào)整播期。調(diào)整播期，盡可能避開蕓薹根腫菌的最佳侵染時期，可以降低根腫病的危害程度。五是選育抗病品種。目前，已在油菜、白菜等作物中育成了一些抗根腫病品種，如華雙5R［48］、華油雜62R［49］和遼白28［50］。華雙5R含有PbBa8.1位點［48］，華油雜62R含有CRb位點［49］，遼白28含有Pba8.1、CRa、CRb和CRd等4個位點［50］。值得注意的是，由于自然條件下根腫病病原的生理小種組成復(fù)雜，同一品種或材料對根腫病的抗感性往往呈現(xiàn)出時空差異。黃小琴等發(fā)現(xiàn)，在供試的80個油菜品種中，有25個品種在四川省安縣、大邑、廣漢的根腫病抗性表現(xiàn)不一致；在四川安縣連續(xù)種植3年的22個油菜品種中，豐油精和高油48表現(xiàn)出不穩(wěn)定抗性，綿豐油5號和德名油1號呈現(xiàn)出抗性喪失趨勢，矮架早則表現(xiàn)為明顯抗性喪失［51］。李倩等發(fā)現(xiàn)，含有CRb位點的甘藍型油菜Bing409R對來自宜昌、枝江、德陽、彭州、廣漢、成都和黃山等地的蕓薹根腫菌具有良好的抗性，但對騰沖、保山、臨滄、德宏和恩施等地的蕓薹根腫菌表現(xiàn)出不同程度的易感性［49］。上述研究表明，在引入抗根腫病品種時，應(yīng)充分考慮其種植地域和抗性的穩(wěn)定性，通過合理布局來延長抗病品種的使用壽命。

4.3 生物防治

生物防治作為一種環(huán)境友好型的手段，越來越受到研究者的青睞，也是未來根腫病防治的一個重要發(fā)展方向。目前，根腫病生防菌主要來源于木霉屬（Trichoderma）和芽孢桿菌屬（Bacillus），通過不同的機制發(fā)揮作用。貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）F85和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）T113的基因組上存在多個合成抗菌肽的基因簇［52］?？咕呢S原素（fengycin）在枯草芽孢桿菌（B. subtilis）XF-1拮抗蕓薹根腫菌過程中發(fā)揮主要作用［53］。不同于芽孢桿菌屬細菌，木霉屬真菌則可能通過調(diào)節(jié)植物根際微生物群落和招募芽孢桿菌屬細菌等具有生防作用的細菌起作用［54］。植物內(nèi)生菌也展現(xiàn)出對根腫病的生防潛力：互生枝頂孢（Acremonium alternatum）不僅能減輕植物根系的根腫病癥狀，還能促進植物地上部分健康生長［55-56］；Heteroconium chaetospira則可以通過上調(diào)油菜茉莉酸、乙烯、生長素生物合成相關(guān)基因的表達來提高油菜對根腫病的抗性［57］；從油菜根部分離出的內(nèi)生細菌短小芽孢桿菌（B. pumilus，YN201305）和枯草芽孢桿菌YN201310對蕓薹根腫菌也具有明顯的裂解和抑制效果［58］。近年來，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些有助于休眠孢子消減技術(shù)研發(fā)的現(xiàn)象：Cryptodifflugia operculata、卡氏棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii）等土壤生物可以捕食蕓薹根腫菌休眠孢子［59］；疣果薺（Bunias orientalis）、大穗看麥娘（Alopecurus myosuroides）、虞美人（Papaver rhoeas）等植物被蕓薹根腫菌侵染后不出現(xiàn)根腫病癥狀［60］。

4.4 化學(xué)防治

氟啶胺、氰霜唑、多菌靈、五氯硝基苯、氟磺胺等化學(xué)藥劑對根腫病具有不同程度的防效［61］。蕓薹根腫菌或以不活躍的休眠孢子形式存在，或活躍于寄主細胞內(nèi)，其獨特的生活方式在一定程度上減弱了化學(xué)藥劑的作用效果。此外，過高的菌源量影響化學(xué)藥劑的防效［62］，而過量使用化學(xué)藥劑（如氟啶胺）又容易造成藥害［63］。以上因素可能綜合導(dǎo)致目前化學(xué)藥劑的防效不甚理想，因此如何研發(fā)根腫病特效藥劑及精準(zhǔn)施藥是根腫病化學(xué)防治需要解決的難題。

5 問題與展望

近年來，在氣候條件變化、種植模式變革、品種更新與布局等多重因素的影響下，根腫病在十字花科作物主產(chǎn)區(qū)時有發(fā)生，因此生產(chǎn)中迫切需要多樣化的防控技術(shù)來應(yīng)對根腫病。然而，與葉部病害研究相比，根腫病的研究總體上較為薄弱，難以有效支撐防控技術(shù)的研發(fā)。品種的抗性水平是決定根腫病發(fā)生程度的主要因素，而抗病品種的選育依賴于抗性資源的篩選與利用，白菜（AA基因組）、油菜（AACC基因組）等作物中常用的抗根腫病基因主要源自蕪菁（Brassica rapa，AA基因組），而甘藍類蔬菜（CC基因組）總體上缺乏根腫病抗性資源。自然條件下，蕓薹根腫菌變異和傳播速度快，生理小種組成復(fù)雜，而現(xiàn)有的抗根腫病品種往往只對1個或幾個生理小種具有抗性，存在較大的抗性失效風(fēng)險。

為實現(xiàn)根腫病的長效防控，建議進一步加強以下方面的研究。（1）深化蕓薹根腫菌致病機制研究，揭示效應(yīng)蛋白在蕓薹根腫菌與十字花科植物互作中的功能，發(fā)掘根腫病防控的新靶標(biāo)。（2）加強十字花科植物種質(zhì)資源篩選和利用，借助高通量測序技術(shù)，充分發(fā)掘根腫病抗性基因。Wang等從擬南芥Est-1生態(tài)型中鑒定到一個抗病基因WeiTsing，導(dǎo)入該基因可賦予擬南芥Col-0生態(tài)型和油菜（ZS11）良好的根腫病抗性［64］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，蕓薹根腫菌侵染誘導(dǎo)WeiTsing在抗根腫病擬南芥的中柱鞘中特異表達，WeiTsing蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過形成五聚體介導(dǎo)鈣離子流動，從而激活植物免疫信號通路［64］。這項研究不僅揭示了以擬南芥為代表的十字花科植物抵御蕓薹根腫菌侵染的新機制，也為該基因的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。Yang等采用PacBio長讀長測序技術(shù)和高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)，成功組裝了抗根腫病歐洲蕪菁ECD04的基因組［65］。該研究不僅揭示了蕓薹屬植物根腫病抗性基因的演化歷程，也為十字花科作物抗根腫病基因的克隆、相關(guān)標(biāo)記開發(fā)以及抗性育種提供了良好基礎(chǔ)。（3）鑒定感病基因，通過基因編輯等技術(shù)創(chuàng)制抗病新材料。病原常利用植物感病基因來促進侵染，而感病基因的敲除可以賦予植物廣譜、持久的抗病性。蕓薹根腫菌侵染引起寄主糖轉(zhuǎn)運蛋白基因SWEET11和SWEET12的表達量上調(diào)［66-67］。在擬南芥中，AtSWEET11和AtSWEET12雙突變可以減緩根腫病的發(fā)生［67］。甘藍類蔬菜缺乏抗根腫病資源，因此感病基因的發(fā)掘和利用對于其根腫病抗性的改良具有重要價值。（4）進一步完善根腫病的監(jiān)測預(yù)警技術(shù)，合理布局和科學(xué)利用抗病品種，延長抗病品種的使用壽命。（5）系統(tǒng)研究抗/感根腫病植物的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，解析其與根腫病發(fā)生的關(guān)系。植物的根際和葉際棲息著大量微生物，微生物之間彼此發(fā)生相互作用，微生物菌群的穩(wěn)態(tài)利于植物維持健康狀態(tài)。健康植株和發(fā)生根腫病植株的土壤微生物群落存在明顯差異［68］，因此，深入研究土壤微生物群落與蕓薹根腫菌的互作，對于基于根際微生態(tài)調(diào)節(jié)的根腫病防治技術(shù)研發(fā)具有重要意義。

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