不同生長階段香菇栽培料木質(zhì)纖維素降解利用研究

摘 要：為深入了解香菇生長發(fā)育過程中栽培料木質(zhì)纖維素的變化，對不同生長階段香菇栽培料中木質(zhì)纖維素含量及其相關降解酶活性進行了測定，利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X-射線衍射法（XRD）和顯微鏡觀察研究了木質(zhì)纖維素微觀結(jié)構(gòu)分子基團、纖維素相對結(jié)晶度（CrI）和纖維表面形態(tài)的變化。結(jié)果表明，在香菇生長發(fā)育過程中，栽培料中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量顯著下降，木質(zhì)纖維素含量（w，后同）由85.27%降低至52.23%，其與相應的降解酶系活性負相關，木質(zhì)纖維素降解與纖維破壞程度呈現(xiàn)一定的相關性。FTIR結(jié)果顯示，不同生長階段香菇栽培料中木質(zhì)纖維素特征官能團峰值發(fā)生變化，木質(zhì)素降解速率高于半纖維素、低于纖維素。隨著香菇的生長發(fā)育，栽培料中CrI顯著降低，纖維素晶體結(jié)構(gòu)受到了一定程度的破壞。結(jié)果表明，香菇首先利用栽培料中非木質(zhì)纖維素組分供菌絲生長，同時分泌胞外降解酶破壞纖維結(jié)構(gòu)，將大分子組分降解為小分子組分，從而滿足其生長所需，高木質(zhì)纖維素降解酶活性對應高木質(zhì)纖維素降解率。該研究結(jié)果可為促進香菇栽培料中木質(zhì)纖維素的降解利用提供依據(jù)。

關鍵詞：香菇；木質(zhì)纖維素；胞外酶；結(jié)晶度；紅外光譜；纖維形態(tài)

中圖分類號：S646.1+2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）09-102-07

Study on the degradation and utilization of lignocellulose in cultivation materials of Lentinus edodes at different growth stages

LI Shunfeng， LIU Li’na， XU Fangfang， TIAN Guangrui， CUI Guomei， GAO Shuaiping， WEI Shuxin， WANG Anjian

（Research Center of Agricultural Processing Science and Technology， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to deeply understand the characteristics of lignocellulose variation in Lentinus edodes culture during the growth and development periods， the lignocellulose content and its related degrading enzyme activity in cultivation materials of L. edodes at different growth stages were determined. The changes of molecular groups of lignocellulose， relative crystallinity index（CrI）of cellulose and fiber surface morphology were also studied and observed by Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）， X-ray diffraction（XRD）， and microscope. The results showed that the content of cellulose， hemicellulose and lignin decreased significantly during the growth of L. edodes. The content of lignocellulose decreased from 85.27% to 52.23%， which was negatively correlated with the activity of the corresponding degrading enzyme， and the degradation of lignocellulose showed a certain correlation with the degree of fiber damage. The FTIR results showed that the absorbance of characteristic functional groups of lignocellulose in different growth stages had changed， and the degradation rate of lignin was higher than hemicellulose and lower than cellulose. With the growth of L. edodes， the CrI in cultivated materials decreased significantly， and the crystal structure of cellulose was destroyed to some extent. The results showed that the L. edodes was used the non-lignocellulosic components in cultivation materials for mycelium growth firstly， and secreted extracellular degrading enzymes to destroy the fiber structure and degrade the macromolecular components into small molecular components at the same time， thus meeting its growth needs. The high activity of lignocellulose degrading enzymes corresponds to the high degradation rate of lignocellulose， and the results can provide a basis for improving the degradation and utilization of lignocellulose in L. edodes cultivation materials.

Key words： Lentinus edodes; Lignocellulose; Extracellular enzymes; Crystallinity; FTIR spectra; Fiber morphology

收稿日期：2024-01-06；修回日期：2024-04-17

基金項目：河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新項目（2023ZC079）；河南省重點研發(fā)專項（231111112500）；河南省科技攻關計劃項目（232102110278）；河南省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊專項（2023TD41）

作者簡介：李順峰，男，副研究員，主要從事食用菌保鮮加工與栽培生理等研究工作。E-mail：lishunfeng2000@163.com

通信作者：王安建，男，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工研究工作。E-mail：309294051@qq.com

香菇是我國食用菌栽培量和產(chǎn)量最大的食用菌，我國70%以上省份均栽培香菇。香菇是典型的木腐菌，其生長所需營養(yǎng)要靠栽培基質(zhì)提供，以木屑為主栽料的代料栽培是香菇栽培的最主要形式。香菇栽培基質(zhì)以木屑為主，輔以麥麩或米糠，這些原料中均含有大量的木質(zhì)纖維素，其含量接近80%，是香菇生長發(fā)育的主要營養(yǎng)源，為香菇生長發(fā)育提供必需的大分子碳源，木質(zhì)纖維素的充分降解和利用對香菇的生長發(fā)育至關重要[1-2]。木質(zhì)纖維素由木質(zhì)素、半纖維素和纖維素三部分組成，它們相互纏繞形成一道天然屏障，嚴重阻礙了木質(zhì)纖維素的降解和利用[3-4]。木質(zhì)纖維素是大分子物質(zhì)，只能在被分解成小分子物質(zhì)后才能被食用菌吸收利用。

食用菌在生長發(fā)育過程中菌絲不斷向其周圍環(huán)境中分泌多種胞外酶[5-6]，將栽培基質(zhì)中的纖維素等大分子物質(zhì)降解成為小分子物質(zhì)，以便吸收利用。胞外酶是食用菌生長發(fā)育的關鍵因素之一，由于其分泌量有限，且分泌具有階段性，導致栽培基質(zhì)的利用率受到一定限制，影響產(chǎn)量的提高。有研究通過添加外源酶類，利用生物轉(zhuǎn)化促進栽培基質(zhì)降解的，提高食用菌對栽培基質(zhì)的利用率[7-8]?，F(xiàn)有研究多集中在香菇栽培中胞外酶活性的變化方面，鮮見對香菇不同生長階段的胞外酶活性變化與木質(zhì)纖維素降解的聯(lián)合研究報道[9-11]。因此，為了提高栽培基質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化率，筆者通過檢測香菇不同生長時期栽培料中木質(zhì)纖維素的降解以及相關降解酶活性的變化，并采用X-射線衍射檢測纖維素結(jié)晶度以及電子顯微鏡對栽培料纖維形態(tài)變化進行觀察，旨在深入了解不同生長期香菇栽培料中木質(zhì)纖維素的變化特征，為提高栽培料利用率和解析栽培料中木質(zhì)纖維素降解利用機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

櫟木屑和香菇CCL10菌種由洛陽雙惠菌業(yè)有限公司提供；麩皮購自新鄉(xiāng)市明陽面粉廠；栽培料配方：木屑78%、麩皮20%、石膏1%、石灰1%，基質(zhì)含水量55%。

1.2 方法

1.2.1 香菇栽培與取樣 按照河南省地方標準《春栽香菇代料栽培技術(shù)規(guī)程》（DB41/T 2048―2020）和河南省農(nóng)學會團體標準《香菇全產(chǎn)業(yè)鏈標準化生產(chǎn) 第5部分：優(yōu)質(zhì)香菇出菇管理技術(shù)規(guī)程》（T/HAASS 0006―2023）進行香菇的栽培與管理。香菇栽培試驗于2022年3―6月在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地進行，分別于接種后50 d（菌絲長滿菌袋：滿袋期，S1）、70 d（完成轉(zhuǎn)色：轉(zhuǎn)色期，S2）、80 d（出現(xiàn)菇蕾：現(xiàn)蕾期，S3）、115 d（第1茬菇采收完成：子實體采收期，S4）4個時期進行取樣。在每個生長時期各隨機挑選9個栽培袋，每3個栽培袋培養(yǎng)料揉碎混勻后作為1個樣品，以滅菌后未接種香菇菌種的栽培料記為S0，用于后續(xù)相關指標測定。

1.2.2 木質(zhì)纖維素含量測定 參照Van等[12]與Van[13]的方法測定并計算纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。

1.2.3 X-射線衍射分析 取適量過60目篩網(wǎng)的不同生長階段香菇栽培料粉末，均勻平鋪在有凹槽的玻璃片上，將玻璃片放在X-射線衍射儀的掃描臺上，分析纖維素的相對結(jié)晶度。使用Cu Kα射線，電壓和電流分別為40 kV和40 mA，掃描范圍5°～50°，掃描速度為5°·min-1，獲得X-射線衍射圖[14-15]。采用Segal等[15]的方法計算纖維素相對結(jié)晶度（Crystallinity Index，CrI）。

1.2.4 傅里葉變換紅外光譜分析 稱取過60目篩網(wǎng)的不同生長階段香菇栽培料粉末各10 mg，與2 g經(jīng)過干燥的KBr在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片后用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1（儀器分辨率4 cm-1）下掃描采樣64次[16]。所得結(jié)果用Omnic 9.2軟件分析。

1.2.5 木質(zhì)纖維素酶活性的測定 酶液提?。乎r樣冷凍后進行冷凍粉碎，稱取2 g樣品粉末加入10 mL去離子水，上下振搖30 min，經(jīng)尼龍過濾后，10 000 r·min-1離心15 min（4 ℃），收集上清液用于酶活性測定[5]。

酶活性測定：按照Huang等[17]的方法測定羧甲基纖維素酶活性，參照管婉等[18]的方法測定β-葡萄糖苷酶活性；參照劉芹等[19]的方法測定木聚糖酶活性、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶活性。

1.2.6 纖維形態(tài)觀察 將不同生長階段香菇栽培料放入試管內(nèi)，加入雙氧水和冰醋酸混合液（體積比1∶1），混合液沒過試樣2 cm左右，置于水浴鍋中沸水煮至樣品變白，呈透明狀。將煮好的試樣用蒸餾水沖洗數(shù)遍至不呈酸性為止，再加入適量蒸餾水至試管，振蕩，使試樣全部分離成單根纖維[14，20-21]。吸取此纖維懸浮液滴于載玻片上，利用光學顯微鏡和MSShot圖像處理系統(tǒng)對纖維進行拍照觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行整理計算，采用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行組間顯著性差異分析，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用OriginPro 2021和Excel 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長階段香菇栽培料的木質(zhì)纖維素含量

由表1可以看出，與未接種香菇栽培料（S0）相比，不同生長階段的香菇栽培料中木質(zhì)纖維素含量均顯著降低。從S0至子實體采收（S4），香菇栽培料中纖維素含量降低了29.29%，其降解主要發(fā)生在轉(zhuǎn)色期（S2）之前，含量由S0的47.42%降低至S2的38.52%，此時期的纖維素降解率占整個生長周期的64.07%，之后纖維素的降解速率減緩；總纖維素含量變化趨勢與纖維素含量一致，其降解主要發(fā)生在S2之前；而半纖維素和木質(zhì)素含量在不同生長階段呈現(xiàn)出勻速下降的趨勢，至S4階段其含量分別降低了52.00%和49.22%。

2.2 不同生長階段香菇栽培料的纖維素相對結(jié)晶度

為了更好地反映不同生長階段香菇栽培料纖維素結(jié)構(gòu)的變化，采用X-射線衍射表征不同生長階段香菇栽培料纖維素晶型的變化。從圖1可以看出，不同生長階段香菇栽培料均具有典型的纖維素X-射線衍射特征，典型特征晶面（1 0 1）、（1 0 [1]）、（0 0 2）和（0 4 [0]）分別主要出現(xiàn)在15.1°、16.4°、22.3°和32.2°位置。不同生長階段香菇栽培料在不同衍射角度有不同的衍射強度，隨著香菇的生長，纖維素結(jié)晶區(qū)（0 0 2）晶面衍射峰的衍射強度呈逐漸降低的趨勢，說明栽培后香菇栽培料中纖維素結(jié)晶度有所下降，這可能是由于在香菇生長過程中分泌的胞外酶破壞了結(jié)晶區(qū)的纖維素，進而導致結(jié)晶區(qū)晶面衍射強度降低。

纖維素相對結(jié)晶度（CrI）可以較好地反映不同生長階段香菇栽培料木質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，由表2可知，不同生長階段香菇栽培料纖維素相對結(jié)晶度隨香菇生長而逐漸減小，表明結(jié)晶區(qū)纖維素被香菇降解和利用。

2.3 不同生長階段香菇栽培料的木質(zhì)纖維素紅外光譜特征

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）能夠提供有關官能團的存在、組成和某些特定結(jié)構(gòu)特征的信息，不同生長階段香菇栽培料中木質(zhì)纖維素FTIR如圖2所示。從圖2可以看出，不同生長階段香菇栽培料中木質(zhì)纖維素的FTIR譜帶吸光度具有一定的差異，表明木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)及含量發(fā)生了變化。由于香菇栽培料的復雜性，F(xiàn)TIR指紋區(qū)（800～1800 cm-1）的大部分波段對其都有貢獻。為了簡化FTIR譜帶波段的解釋及準確地反映木質(zhì)纖維素變化，采用總纖維素的4個特征吸收波段和木質(zhì)素的2個特征吸收波段進行分析，具體波段信息為：1735 cm-1為半纖維素C=O伸縮振動、1382 cm-1為纖維素和半纖維素C-H變形振動、1158 cm-1為纖維素和半纖維素的C-O-C伸縮振動、896 cm-1為纖維素C-H變形振動、1512 cm-1為木質(zhì)素芳香環(huán)C=C骨架振動、1206 cm-1為木質(zhì)素芳香環(huán)上C-O伸縮振動。圖2顯示，與S0相比，隨著香菇的生長，栽培料的光譜強度在1735、1382、1158、896、1512、1206 cm-1等波段逐漸增大。

為了明確與香菇栽培料化學成分相關官能團的變化趨勢，表3列出了碳水化合物（纖維素和半纖維素）/木質(zhì)素比值的相對強度。由表3可知，在不同生長階段香菇栽培料的碳水化合物/木質(zhì)素（I1382/I1512和I1158/I1512）比值的升高說明總纖維素的降解速率低于木質(zhì)素，I1735/I1512比值升高、I1206/I1735比值降低說明木質(zhì)素降解速率高于半纖維素，而I896/I1512比值降低則說明木質(zhì)素降解速率低于纖維素，且現(xiàn)蕾（S3）后纖維素相對含量相較于木質(zhì)素無顯著變化，說明此時木質(zhì)素和纖維素降解速率相當。

2.4 不同生長階段香菇栽培料的纖維形態(tài)特征

經(jīng)顯微鏡觀察，不同生長階段香菇栽培料放大40倍的纖維形態(tài)無明顯變化（圖3）；將纖維放大至100倍觀察（圖3），S0纖維壁和內(nèi)腔結(jié)構(gòu)完整、光滑，接種香菇菌種至菌絲滿袋（S1）后纖維壁出現(xiàn)裂紋，隨著香菇的生長纖維壁上的裂紋逐漸增多且裂口增大。纖維壁裂紋越多、裂口越大，說明纖維受破壞越嚴重，更易被香菇吸收利用進而促進香菇的生長發(fā)育。

2.5 不同生長階段香菇栽培料的木質(zhì)纖維素降解酶活性

香菇對木質(zhì)纖維素的降解主要依靠胞外酶的作用來完成，胞外酶種類較多，與香菇栽培料中木質(zhì)纖維素降解相關的有纖維素酶系、半纖維素酶系和木質(zhì)素酶系等，其中羧甲基纖維素酶和β-葡萄糖苷酶屬于纖維素酶系，木聚糖酶屬于半纖維素酶系，木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶屬于木質(zhì)素酶系。香菇栽培料中5種酶的活性變化如圖4所示。由圖4可以看出，香菇各生長發(fā)育階段的胞外酶活性的變化不盡相同。隨著香菇菌絲的生長，栽培料中羧甲基纖維素酶活性在S2時達到最高（7.36 U·g-1），之后酶活性逐漸降低，這一結(jié)果與纖維素降低率（表1）相關。在香菇生長過程中β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活性逐漸升高，分別由S1時的0.97、2.56 U·g-1顯著升高至子實體采收（S4）時的1.98、8.54 U·g-1。木質(zhì)素過氧化物酶活性在現(xiàn)蕾期（S3）達到最高（3.63 U·g-1），之后顯著降低，而錳過氧化物酶活性則在S2時期顯著升高（3.43 U·g-1），之后緩慢升高。

3 討論與結(jié)論

代料栽培是香菇栽培的主要形式，香菇栽培料以木屑為主，輔以麩皮，這些原料均含有大量的木質(zhì)纖維素，經(jīng)降解后才能被香菇菌絲吸收利用。在本研究中，香菇原始栽培料中木質(zhì)纖維素含量高達85.27%，經(jīng)香菇生長發(fā)育后木質(zhì)纖維素含量降低至52.23%，降低了38.75%，說明香菇在生長過程中對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素進行了降解和利用，這一結(jié)果與于丹等[22]的結(jié)果相似。隨著香菇的生長發(fā)育，栽培料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量均顯著降低，且纖維上的裂紋和裂口逐漸增大，說明纖維被破壞程度與木質(zhì)纖維素降解呈一定的相關性。纖維素的降解主要發(fā)生在轉(zhuǎn)色期（S2）之前，而此時羧甲基纖維素酶活性達到最高（7.36 U·g-1），之后酶活性顯著降低，說明纖維素的降解與羧甲基纖維素酶活性正相關；半纖維素含量在不同生長階段均顯著降低，這一變化與木聚糖酶在不同生長階段的酶活性顯著升高一致；木質(zhì)素在不同生長階段亦均顯著降低，但其對應的木質(zhì)素降解酶活性變化并未與其變化呈現(xiàn)出一一對應關系，其中木質(zhì)素過氧化物酶活性在現(xiàn)蕾期（S3）時達到最高，錳過氧化物酶活性在S2時達到較高水平，劉芹等[19]對糙皮側(cè)耳木質(zhì)纖維素降解酶活性的研究也得到了類似的結(jié)果。由此推測，木質(zhì)素的降解在S2之前主要靠錳過氧化物酶降解，之后則由木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶共同作用來完成。總體來看，木質(zhì)纖維素含量與木質(zhì)纖維素降解酶活性呈負相關，即維持較高的木質(zhì)纖維素降解酶活性可以提高木質(zhì)纖維素的降解率。

FTIR結(jié)果表明，香菇不同生長階段栽培料的光譜強度在1735、1382、1158、896、1512、1206 cm-1等波段逐漸增大，Gallio等[23]在研究白蟻侵襲下巨桉木材的熱化學行為時也得到了類似的結(jié)果，并指出特征官能團吸光值的增大并非說明波數(shù)所代表的成分數(shù)量的增加，而是說明化學成分發(fā)生了變化，這也進一步說明由于香菇利用栽培料中木質(zhì)纖維素等成分用于自身的生長發(fā)育而導致栽培料中的化學成分發(fā)生了變化。木質(zhì)素與纖維素、半纖維素的特征吸收峰的峰高比值可用來判定木質(zhì)纖維素相對含量的高低[14]，采用I1512/I1735特征峰比值表征木質(zhì)素相對含量，采用I1735/I1512、I1382/I1512、I1158/I1512和I896/I1512特征峰比值表征纖維素和半纖維素相對含量。在本研究中，I1735/I1512比值升高，I1206/I1735和I896/I1512比值降低，說明半纖維素降解速率低于木質(zhì)素，纖維素降解速率高于木質(zhì)素，這一結(jié)果與隨著香菇生長發(fā)育木聚糖酶活性顯著升高、纖維素酶系和木質(zhì)素酶系活性呈先升高后降低的趨勢有關。I1382/I1512和I1158/I1512比值升高說明總纖維素的降解速率低于木質(zhì)素，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是雖然木質(zhì)素降解速率高于半纖維素、低于纖維素，但由于纖維素含量高，從而間接降低了總纖維素的降解速率。

纖維素的結(jié)構(gòu)既有結(jié)晶區(qū)域又有非結(jié)晶區(qū)域，其分子間的氫鍵相互作用與范德華力形成了具有獨特衍射現(xiàn)象的晶體結(jié)構(gòu)[24]。X-射線衍射結(jié)果表明，不同生長階段香菇栽培料均具有典型的纖維素X-射線衍射特征，說明纖維素結(jié)晶區(qū)未被完全破壞；纖維素相對結(jié)晶度（CrI）由未接種期（S0）的38.52%降低到子實體采收（S4）時的27.03%，且滿袋期（S1）時的CrI與S0時無顯著差異，CrI的降低主要在S2之后，說明S1時香菇主要利用的是非結(jié)晶區(qū)的纖維素，而此時木質(zhì)纖維素各組分的降解率及相應降解酶的活性均較低，由此推斷，S1前香菇主要利用的是非木質(zhì)纖維素成分，促進菌絲體生物量的積累，進而為后期分泌胞外酶、分解大分子木質(zhì)纖維素奠定生理基礎。同時，香菇栽培料中錳過氧化物酶和羧甲基纖維素酶的活性首先達到較高水平，說明香菇生長首先利用木質(zhì)素和非結(jié)晶區(qū)的纖維素，破壞結(jié)晶區(qū)纖維素的保護屏障，進而促進結(jié)晶區(qū)纖維素的降解，并最終降低纖維素結(jié)晶度。

根據(jù)以上結(jié)果，推測香菇首先以栽培料中非木質(zhì)纖維素組分供菌絲生長利用，然后分泌胞外木質(zhì)纖維素降解酶破壞纖維結(jié)構(gòu)，將大分子木質(zhì)纖維素組分降解為小分子組分，從而滿足其生長所需。筆者對香菇不同生長階段栽培料中木質(zhì)纖維素降解利用情況進行了研究，所得研究結(jié)果可為提高香菇栽培料的利用率和促進栽培料中木質(zhì)纖維素的降解利用提供理論支撐。

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