外源NO對香菇熱脅迫的緩解機制研究

摘 要：為探究外源NO對香菇熱脅迫的緩解機制，以香菇L135菌株為試驗材料，研究外源添加NO對香菇菌絲高溫脅迫下氧化損傷的緩解效應。結果表明，高溫脅迫明顯抑制了香菇菌絲的生長，導致菌絲蜷曲甚至斷裂，添加適宜濃度（800 μmol·L-1）的NO供體（SNP）處理可以有效緩解熱脅迫條件下的形態(tài)傷害；外源添加SNP處理組與未添加處理組相比，菌絲細胞內過氧化氫及丙二醛的含量均顯著下降，熱激48和72 h分別下降了17.48%、35.24%和16.70%、19.87%，且胞內超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性均顯著提高。綜上，添加800 μmol·L-1的外源NO能夠有效緩解香菇熱脅迫，為進一步闡明食用菌抗高溫脅迫機制奠定了理論基礎。

關鍵詞：香菇；一氧化氮；緩解；熱脅迫

中圖分類號：S646.1+2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）09-096-06

Alleviation mechanism of exogenous nitric oxide on heat stress of Lentinus edodes

LU Xinxin， XU Pengliang， ZOU Ming， TAN Xiufang， LIU Yicheng， MA Haitao， JIN Rongxian

（Institute of Edible Fungi， Xinxiang Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453000， Henan， China）

Abstract： To investigate the mechanism of exogenous NO alleviating heat stress in Lentinula edodes， L. edodes strain L135 was used as the experimental material to study the alleviating effect of exogenous NO on oxidative damage of L. edodes hyphae under high temperature stress. The results show that high temperature stress significantly inhibited the growth of L. edodes mycelia， caused mycelia curl or even break， SNP treatment with appropriate concentration（800 μmol·L-1）could effectively alleviate the morphological damage caused by heat stress; the levels of H2O2 and MDA content in mycelial cells decreased significantly in the group treated with exogenous SNP compared with the group treated without SNP， heating shock 48 and 72 h decreased by 17.48%， 35.24% and 16.70%， 19.87% respectively， and the intracellular activities of superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD）and catalase（CAT）activity were significantly increased. In conclusion， the addition of 800 μmol·L-1 exogenous NO can effectively alleviate heat stress in L. edodes， laying a theoretical foundation for further elucidating the mechanism of high-temperature stress resistance in edible fungi.

Key words： Lentinula edodes; Nitricoxide; Alleviate; Heat stress

收稿日期：2023-09-25；修回日期：2024-04-22

基金項目：河南省食用菌產(chǎn)業(yè)技術體系（HARS-22-08-Z1）；新鄉(xiāng)市科技攻關計劃（GG2021027）

作者簡介：魯欣欣，女，研究實習員，主要從事食用菌新品種選育和栽培技術研究。E-mail：xxl1663@126.com

通信作者：靳榮線，女，副研究員，主要從事菌類栽培和育種研究。E-mail：jinrongxian@163.com

香菇[Lentinula edodes（Berk.）Pegler]又稱香蕈、花菇等，隸屬真菌界擔子菌門蘑菇亞門蘑菇綱蘑菇亞綱蘑菇目類臍菇科微香菇屬[1]，是我國廣泛栽培的食用菌之一，因其口感好、氣味香、味道鮮美，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用功能，越來越受到消費者的喜愛[2-4]。據(jù)2022年中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，香菇年產(chǎn)量1 295.48萬t，占食用菌總產(chǎn)量的30.68%，位居第一位。但香菇的生長發(fā)育受溫度影響較大[5]，菌絲適宜生長溫度為24～26 ℃，溫度過高容易造成菌絲活力減弱或凋亡甚至導致菌棒腐爛，此外，在高溫環(huán)境下，還容易導致子實體畸形或繼發(fā)性不出菇等問題[6]，嚴重影響香菇的產(chǎn)量和品質，損害菇農(nóng)的經(jīng)濟效益。因此，增強香菇菌絲的耐熱性，探究其耐熱機制對香菇的栽培生產(chǎn)具有重要意義。

生物體在受到高溫脅迫時，會引起活性氧（ROS）大量累積，氧化其生物膜，生成脂質過氧化產(chǎn)物，從而破壞生物體的正常新陳代謝，對細胞產(chǎn)生損傷。丙二醛（MDA）是細胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，會對生物膜產(chǎn)生嚴重損傷[7]。為維系胞內的活性氧水平，進化出來一系列的抗氧化系統(tǒng)，其中酶促系統(tǒng)包括一系列抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等，可以有效清除活性氧，緩解脅迫對細胞造成的損傷[8]，但抗氧化酶的響應方向和程度會由于研究的生物種類、組織及其脅迫時間和程度的不同而不同[9]。在植物中，NO是一種重要的信號分子，不僅可以調節(jié)植物生長發(fā)育，還能調控植物對生物和非生物脅迫的響應[10]。大量研究表明，NO作為一種信號分子能夠通過調節(jié)抗氧化酶（SOD、POD、CAT等）活性增強植物的抗逆性，如抗高溫脅迫，抗鹽脅迫等[11-13]。NO在熱脅迫下也參與食用菌的熱脅迫響應，但與植物相比，NO在真菌中的功能及調控機制的相關研究較少。孟利娟等[14]研究表明，通過外源添加NO可以緩解白靈側耳的氧化損傷，提高SOD和CAT活性及菌絲耐熱性。

近些年熱脅迫對食用菌影響的研究受到廣泛關注，其中對糙皮側耳[15]、雙孢蘑菇[16]等食用菌報道較多，對香菇的研究極少。筆者以外源添加NO供體SNP對熱脅迫下香菇菌絲生長及抗氧化脅迫能力的影響進行研究，以期為進一步闡明食用菌抗高溫脅迫機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與主要試劑 供試菌株香菇L135，由福建省三明市真菌研究所選育，為低溫晚熟型品種，具有菇形圓正、子實體肉厚、菌柄短、易形成花菇等特點。

SNP（NO供體）購自上海碧云天生物技術股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 CYM固體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，酵母粉2 g，MgSO4 0.5 g，KH2PO4 0.4 g，K2HPO4 1 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1000 mL；CYM液體培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，酵母粉2 g，MgSO4 0.5 g，KH2PO4 0.4 g，K2HPO4 1 g，葡萄糖20 g，水1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 最適SNP濃度篩選 試驗于2023年3－6月在新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所進行。將供試菌株接種于CYM培養(yǎng)基中，分別在不同溫度下（30、32、35、38、40 ℃）進行熱脅迫處理，觀察菌絲生長情況，確定致死溫度。然后配制SNP終濃度分別為0、400、600、800、1000 μmol·L-1的CYM培養(yǎng)基，混合均勻后倒平板，每個濃度3次重復，用5 mm打孔器在供試菌株菌落邊緣處打孔，接種于固體培養(yǎng)基平板中央，在25 ℃下培養(yǎng)7 d，然后置于致死溫度下進行熱脅迫處理，觀察菌絲生長恢復情況，采用十字交叉法對菌絲生長速度進行測定。

1.2.2 顯微鏡下香菇菌絲球形態(tài)變化 用直徑為5 mm的打孔器取6個供試菌株菌塊轉移至200 mL無菌CYM液體培養(yǎng)基內，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 d，然后在震蕩培養(yǎng)箱中25 ℃、140 r·min-1震蕩培養(yǎng)7 d，繼續(xù)在40 ℃下分別震蕩培養(yǎng)0、48、72 h，培養(yǎng)結束后收集菌絲球樣品，以不添加SNP的培養(yǎng)基為對照組，每個處理設置3個重復，以未經(jīng)處理（0 h）的樣品作為對照，最后將菌絲球樣品制片后在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

1.2.3 生理指標測定 每個處理分別稱取1 g新鮮菌絲后提取粗酶液，按照索萊寶公司提供的檢測試劑盒操作說明書分別測定H2O2和MDA含量及SOD、CAT和POD活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗采用完全隨機法進行取樣，所得數(shù)據(jù)用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析和相關性分析，利用EXCEL 2019進行柱狀圖繪制。

2 結果與分析

2.1 最適SNP濃度篩選

將香菇菌絲接種于CYM培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)7 d后轉移至不同溫度（30、32、35、38、40 ℃）下進行熱脅迫處理，結果表明，隨著溫度的升高，菌絲生長速率受到的抑制逐漸增強，在40 ℃時菌絲完全停止生長，因此將40 ℃作為最終熱脅迫溫度。

將添加不同SNP濃度處理的菌絲在25 ℃培養(yǎng)7 d后進行熱脅迫處理（40 ℃、48 h），然后置于25 ℃下進行恢復培養(yǎng)，圖1與表2的結果表明，通過外源添加試驗，當添加的NO供體SNP濃度為800 μmol·L-1時，香菇菌絲在熱脅迫處理后仍可以恢復生長，且此時菌絲潔白濃密，恢復生長狀況最好，而在無外源添加SNP及在濃度400、600和1000 μmol·L-1下均不能恢復生長，由此說明添加適量的SNP可以有效緩解熱脅迫造成的香菇菌絲形態(tài)傷害，因此將NO供體SNP的最適濃度確定為800 μmol·L-1。

2.2 外源NO對熱脅迫下香菇菌絲球形態(tài)的影響

香菇菌絲球的形態(tài)變化能夠直觀看出香菇的生長狀況，在正常溫度環(huán)境下，菌絲球菌絲強壯茂密、向周圍呈發(fā)射狀。試驗結果如圖2所示，在無熱脅迫的情況下，液體培養(yǎng)下的香菇菌絲球生長狀況良好，向外呈發(fā)射狀生長且菌絲茂密，而隨著熱脅迫時間的延長，周圍菌絲逐漸蜷曲直至完全斷裂，說明熱脅迫對菌絲球的形態(tài)有重要影響，且隨著熱激時間延長而越來越嚴重。由圖2-E～F可以看出，在添加SNP處理后，菌絲隨著熱脅迫時間的延長并沒有出現(xiàn)嚴重斷裂現(xiàn)象，且對香菇菌絲球形態(tài)造成的傷害有所緩解，由此可以看出，外源添加800 μmol·L-1的SNP處理可以有效緩解香菇菌絲形態(tài)的蜷曲，使菌絲更強壯，有效抵抗熱脅迫造成的傷害，從而說明外源添加NO可以有效緩解熱脅迫對香菇菌絲球形態(tài)的傷害。

2.3 外源NO對熱脅迫下香菇菌絲體內H2O2和MDA含量的影響

H2O2含量是反映細胞氧化損傷的一個重要指標，由圖3可以看出，無論有無添加NO供體SNP，H2O2的含量都隨著熱脅迫處理時間的延長而顯著升高，說明熱脅迫后菌絲中ROS出現(xiàn)大量積累，熱脅迫會影響H2O2含量，從而使香菇菌絲受到一定程度的氧損傷。而在添加一定濃度的SNP（800 μmol·L-1）后，熱激48 h和72 h后H2O2的含量均分別顯著下降了17.48%和35.24%，由此可以看出，在NO供體SNP的作用下，熱脅迫造成的香菇體內H2O2含量升高受到了顯著抑制，能夠有效減緩高溫熱脅迫對香菇菌絲的氧損傷。

香菇菌絲體內MDA的含量變化能夠反映出熱脅迫后菌絲細胞膜的損傷程度，由圖4可以看出，在未添加SNP條件下，菌絲細胞內MDA的含量隨著熱脅迫時間的延長而大量積累，表明熱脅迫可能引起了菌絲細胞膜損傷，而添加SNP處理后，香菇菌絲細胞內MDA積累得到了顯著緩解，由此可以看出，添加NO供體SNP可以緩解熱脅迫引起的香菇菌絲體的氧損傷，降低由于熱激引起的MDA產(chǎn)物的含量，在一定程度上緩解了熱脅迫。

2.4 外源NO對熱脅迫下香菇菌絲體內抗氧化酶活性的影響

如圖5所示，高溫脅迫下，對照組和處理組香菇菌絲的SOD活性都隨著熱脅迫時間延長而顯著增強，可能是高溫脅迫導致了活性氧的大量產(chǎn)生，由此激活了酶促自由基清除系統(tǒng)，但是增加的幅度存在差異。在沒有熱激的情況下，添加外源NO的SOD活性是不加NO的2.02倍，可以看出不論有無熱脅迫的發(fā)生，外源添加NO對SOD活性都有顯著促進作用。在不添加外源NO條件下，對照組SOD活性為37.82 U·g-1，熱脅迫48 h后，活性提高至50.43 U·g-1，在熱脅迫72 h后，活性較48 h時顯著提高3.33%；在添加外源NO條件下，對照組酶活性為76.21 U·g-1，熱脅迫48 h后，活性比熱處理前顯著提高13.19%，在熱脅迫72 h后，活性較48 h顯著提高12.16%。由此可見，添加SNP可以顯著提高香菇菌絲體內抗氧化酶的活性，進而增強香菇菌絲耐熱性。

過氧化氫酶是清除活性氧的重要抗氧化酶之一，圖6表明，無論有無高溫脅迫，添加SNP對SOD活性都有顯著的促進作用，高溫熱脅迫下效果更加明顯。在不添加外源NO的條件下，CAT活性隨著熱脅迫時間的延長呈先上升后下降的趨勢，熱激48 h和72 h的活性均顯著高于未熱激，但熱脅迫72 h與48 h相比，酶活性顯著下降，這說明隨著熱激時間的持續(xù)，香菇菌絲體內的過氧化氫酶活性開始不斷降低，對過氧化氫的清除能力也在不斷下降；當添加外源NO處理后再進行熱脅迫，發(fā)現(xiàn)隨著熱脅迫時間的延長，CAT活性不斷顯著上升，且幅度高于未添加SNP處理，說明外源NO能夠有效保持CAT活性，在一定程度上緩解了香菇熱脅迫。

由圖7可以看出，在正常溫度條件下，有無添加SNP對POD活性影響不大，無顯著差異，且POD活性隨著熱脅迫時間延長呈顯著上升的趨勢，推測POD活性不斷增強可能是高溫脅迫導致了活性氧的大量產(chǎn)生，由此激活了酶促自由基清除系統(tǒng)。在添加SNP條件下，熱激48和72 h的POD活性分別是未熱激的2.72倍和5.39倍，不添加SNP處理的POD活性變化幅度明顯比添加組的增加幅度要小，分別為未熱激的2.30倍和3.34倍。由此說明SNP釋放的NO能夠有效增強香菇細胞內POD活性，在緩解香菇熱脅迫中發(fā)揮重要作用。

3 討論與結論

高溫脅迫會導致生物細胞大量積累活性氧，對其生長發(fā)育產(chǎn)生較大影響。由于香菇菌絲體不耐高溫，容易受到高溫傷害，因此高溫是對香菇生產(chǎn)影響最不利的環(huán)境因素之一，長時間高溫脅迫容易導致菌絲死亡，從而影響出菇。研究表明，在真菌中，NO作為信號分子參與抗氧化過程，同時參與調節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)，能夠調節(jié)生物體內抗氧化酶SOD、CAT、POD活性，降低活性氧水平，緩解氧化損傷，提高菌絲的耐熱性[17]。Kong等[18]在糙皮側耳的研究中發(fā)現(xiàn)，添加外源NO可以緩解熱脅迫導致的菌絲體氧損傷，在一定程度上緩解高溫脅迫。

筆者在本試驗中進一步探究了NO對香菇熱脅迫的緩解作用，證明了通過外源添加一定濃度的NO供體SNP，可以顯著提高香菇菌絲體對熱脅迫的耐受性。SNP濃度篩選試驗結果表明，800 μmol·L-1的SNP對香菇熱脅迫的抵抗最有效。從菌絲球的顯微形態(tài)試驗中可以得出，添加SNP后，香菇菌絲球形態(tài)的蜷曲得到了顯著緩解，菌絲相對于未添加SNP處理變得更加強壯，可以有效抵抗高溫脅迫對香菇菌絲造成的傷害。

高溫脅迫會造成活性氧過量積累，此時MDA和H2O2的含量增加，導致膜脂過氧化進而引發(fā)氧損傷，嚴重時會對細胞造成傷害甚至死亡。在本研究中，熱脅迫48 h和72 h后，SNP處理與單純熱激相比，H2O2和MDA含量均顯著下降，說明H2O2和MDA的積累情況得到了顯著緩解，表明外源添加SNP釋放的NO能夠有效降低高溫脅迫導致的膜脂過氧化程度，增強香菇對熱脅迫的耐受性。外源添加NO可以調節(jié)生物細胞內抗氧化酶的活性，對高溫脅迫作出應答[19-20]，在本研究中，高溫脅迫72 h內，SOD、CAT和POD 抗氧化酶活性顯著升高，響應高溫脅迫，表明外源添加NO供體SNP后，通過釋放信號分子NO調節(jié)高溫脅迫下香菇的抗氧化酶系統(tǒng)，顯著提高SOD、CAT、POD活性，緩解氧化損傷，增強菌絲體耐熱性，與前人的研究結果一致。

綜上所述，高溫脅迫明顯抑制了香菇菌絲的生長，導致菌絲蜷曲甚至斷裂，添加800 μmol·L-1的SNP可以有效緩解熱脅迫條件下導致的形態(tài)傷害，細胞內H2O2和MDA含量顯著下降，而SOD、CAT和POD活性顯著提高，表明添加外源NO供體SNP通過激活抗氧化系統(tǒng)能夠有效緩解香菇的熱脅迫，研究結果對香菇熱脅迫生理機制的研究及栽培種植具有重大意義。

參考文獻

[1] 李玉，李泰輝，楊祝良，等．中國大型菌物資源圖鑒[M]．鄭州：中原農(nóng)民出版社，2015．

[2] 陳章娥．香菇的應用價值與前景展望[J]．現(xiàn)代食品，2023，29（6）：26-28．

[3] 連希希，孫佳寧，孫伶俐，等．香菇多糖的研究進展[J]．化學與生物工程，2022，39（2）：1-5．

[4] 張淇淇，周良，朱俊豪，等．香菇的藥用價值及其產(chǎn)品開發(fā)前景[J]．長江蔬菜，2020（2）：38-43．

[5] 周莎莎，王剛正，羅義，等．生長素及其類似物增強香菇耐高溫性的研究[J]．菌物學報，2018，37（12）：1723-1730．

[6] 曹現(xiàn)濤，邊銀丙，肖新軍，等．高溫脅迫對香菇菌絲生長及其抗哈茨木霉能力的影響[J]．食用菌學報，2015，22（4）：81-85．

[7] 劉宇，宋希強，史佑海，等．高溫脅迫下海南杜鵑和白花杜鵑的生理響應比較分析[J]．分子植物育種，2018，16（17）：5827-5834．

[8] FAN Q J，LIU J H．Nitric oxide is involved in dehydration/drought tolerance in Poncirus trifoliata seedlings through regulation of antioxidant systems and stomatal response[J]．Plant Cell Reports，2012，31（1）：145-154．

[9] SCHüTZENDüBEL A，NIKOLOVA P，RUDOLF C，et al．Cadmium and H2O2-induced oxidative stress in Populus × canescens roots[J]．Plant Physiology and Biochemistry，2002，40（6/8）：577-584．

[10] SHI H T，LI R J，CAI W，et al．Increasing nitric oxide content in Arabidopsis thaliana by expressing rat neuronal nitric oxide synthase resulted in enhanced stress tolerance[J]．Plant and Cell Physiology，2012，53（2）：344-357．

[11] 李秀，鞏彪，徐坤，等．外源NO對高溫脅迫下姜葉片活性氧代謝的影響[J]．園藝學報，2014，41（2）：277-284．

[12] DOMINGOS P，PRADP A M，WONG A，et al．Nitric Oxide： A multitasked signaling gas in plants[J]．Molecular Plant，2015，8（4）：506-520．

[13] MANAI J，KALAI T，GOUIA H，et al．Exogenous nitric oxide （NO）ameliorates salinity-induced oxidative stress in tomato （Solanum lycopersicum）plants[J]．Journal of Soil Science and Plant Nutrition，2014，14（2）：433-446．

[14] 孟利娟，孔維威，鄔向麗，等．外源一氧化氮提高白靈側耳菌絲耐熱性生化途徑分析[J]．菌物學報，2015，34（4）：632-639．

[15] 張美敬，劉秀明，鄒亞杰，等．側耳屬食用菌高溫脅迫條件優(yōu)化研究[J]．菌物學報，2HmWgmTa+jkCVeASBk1vx9g==015，34（4）：662-669．

[16] 王倩，黃建春，卜樂男，等．雙孢蘑菇對高溫脅迫的響應及耐熱機理[J]．菌物學報，2021，40（6）：1400-1412．

[17] 陳一多，張震，姜華，等．真菌中一氧化氮生物合成、降解及功能的研究進展[J]．微生物學報，2013，53（1）：6-14．

[18] KONG W W，HUANG C Y，CHEN Q，et al．Nitric oxide alleviates heat stress-induced oxidative damage in Pleurotus eryngii var tuoliensis[J]．Fungal Genetics and Biology，2012，49（1）：15-20．

[19] EGBICHI I，KEYSTER M，LUDIDI N．Effect of exogenous application of nitric oxide on salt stress responses of soybean[J]．South African Journal of Botany，2014，90：131-136．

[20] FAN H F，DU C X，DING L，et al．Exogenous nitric oxide promotes waterlogging tolerance as related to the activities of antioxidant enzymes in cucumber seedlings[J]．Russian Journal of Plant Physiology，2014，61（3）：366-373．