當陽魚腥草花葉病病原分子鑒定

摘 要：明確當陽魚腥草花葉病致病菌種類，為當陽魚腥草花葉病的田間防治提供依據。采集魚腥草花葉葉片提取當陽魚腥草典型病樣的總RNA，利用sRNA深度測序，結合生物信息學分析初步確定病原菌，利用該病毒外殼蛋白（CP）特異性引物進行RT-PCR檢測，所得序列進行BLAST比對和系統(tǒng)進化樹構建，以進一步確定病原菌種類。利用sRNA深度測序和生物信息學初步確定魚腥草花葉病致病菌為黃瓜花葉病毒（CMV），特異性引物擴增得到878 bp特異性條帶，經BLAST比對發(fā)現其與已發(fā)表的CMV序列高度同源，相似性最高達97.84%。通過CMV病毒CP基因的核苷酸序列構建系統(tǒng)進化樹可得魚腥草花葉病病毒屬于CMV 亞組II。引起魚腥草花葉病的病原屬于黃瓜花葉病毒II亞組，研究結果為魚腥草花葉病防治提供了理論基礎。

關鍵詞：魚腥草；黃瓜花葉病毒；sRNA深度測序；RT-PCR

中圖分類號：S649 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）09-054-05

Molecular identification of mosaic disease on Houttuynia cordata Thumb. in Dangyang

ZHOU Jie1， WU Fanghua2， YAN Fei3， QI Chuandong1， GUO Fengling1， WU Jinping1

（1. Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Vegetable Ecological Cultivation on Highland， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Agricultural Service Center of Lianghe Town， Dangyang City， Yichang 444114， Hubei， China; 3. Institute of Plant Virology， Ningbo University， Ningbo 315211， Zhejiang， China）

Abstract： The identification of pathogenic bacteria species causing Houttuynia cordata mosaic disease in Dangyang will provide a theory basis for the field control of the disease. The mosaic leaves of Houttuynia cordata were collected to extract the total RNA of typical mosaic disease samples， and sRNA deep sequencing was conducted. Based on bioinformatics analysis， the pathogen was initially identified. Using the virus coat protein（CP）specific primers for RT-PCR detection， the obtained sequences were subjected to BLAST alignment and a phylogenetic tree construction to further identify the pathogen. Using sRNA deep sequencing and bioinformatics analysis， it was initially determined that the causative virus of Houttuynia cordata mosaic disease was cucumber mosaic virus（CMV）. Specific primers amplified a specific band of 878 bp， which was found to be highly homologous to published CMV sequences through BLAST alignment， with a similarity of 97.84%. By constructing a phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of CMV virus CP gene， it can be concluded that Houttuynia mosaic virus belongs to subgroup II of CMV. This result provides a theoretical basis for the prevention and treatment of Houttuynia cordata mosaic disease.

Key words： Houttuynia cordata; Cucumber mosaic virus; sRNA sequencing; RT-PCR

收稿日期：2023-12-28；修回日期：2024-04-17

基金項目：湖北省農業(yè)科技創(chuàng)新中心項目（2021-620-000-001-007）；國家特色蔬菜產業(yè)技術體系（CARS-24-G-17）

作者簡介：周 潔，女，助理研究員，主要從事特色蔬菜資源挖掘與利用工作。E-mail：384881257@qq.com

吳方華，男，正高級農藝師，主要從事魚腥草、大蒜等特色蔬菜栽培技術研究與應用。E-mail：2683028688@qq.com

通信作者：郭鳳領，女，研究員，主要從事特色蔬菜資源挖掘與利用工作。E-mail：444769935@qq.com

吳金平，女，研究員，主要從事特色蔬菜資源挖掘與利用工作。E-mail：274184394@qq.com

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）又名折耳根，是三白草科蕺菜屬多年生草本植物，其含有多酚、多糖、甾醇類和黃酮類化合物等[1]，具有清熱解毒等功效，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物[2]。隨著生活水平的不斷提高，人們對健康食品的追求也逐步提升，魚腥草作為一種健康蔬菜也隨之進入市場，因此單靠采集野生魚腥草已不能滿足市場需求。據湖北宜昌當陽兩河鎮(zhèn)農業(yè)服務中心統(tǒng)計，當陽兩河鎮(zhèn)1998年開始試種魚腥草，到2023年種植面積已超過1400 hm2，年產量8.8萬t，全產業(yè)鏈產值達到18.88億元，是中國蔬菜流通協(xié)會授予的全國首個“中國魚腥草之鄉(xiāng)”。

目前，關于魚腥草藥用價值方面的研究較多。已有研究發(fā)現，其所含魚腥草素具有抗炎和抗病毒的功效[3]，黃酮類物質具有祛痰止咳等功效[4]。此外，魚腥草提取液對南瓜白粉病也具有一定的防治效果[5]。關于魚腥草種植過程中的病害鑒定及防控多為白絹病、炭疽病等真菌病害的報道[6-7]。由于魚腥草利用根莖無性繁殖導致病害增多[8]，加上集約化種植，近年來魚腥草花葉病在當陽市兩河鎮(zhèn)呈現明顯的加重趨勢，據當陽市兩河鎮(zhèn)農技推廣中心調查數據，2021年間嚴重的田塊發(fā)生率在70%以上，給當地魚腥草種植業(yè)造成不良影響。目前，國內關于魚腥草病毒病的研究較少，湖北省農業(yè)科學院經濟作物研究所特色蔬菜課題組在對兩河鎮(zhèn)魚腥草種植基地調查的過程中發(fā)現，該病的田間癥狀主要表現為部分葉片深綠色斑駁，葉片變厚，葉脈深綠。筆者擬通過sRNA高通量測序和RT-PCR技術對當陽魚腥草花葉病病原進行鑒定，明確該病害致病菌類型，以期為魚腥草田間病毒病的防控提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年3－4月于當陽市兩河鎮(zhèn)魚腥草示范基地隨機采集具有典型花葉病癥的葉片9份和健康的魚腥草葉片1份，每份10片葉子，共累積10份樣品保存?zhèn)溆?，液氮速凍后置?80 ℃冰箱保存。

分子生物學試劑盒：總RNA提取利用RNA提取試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA），反轉錄利用全式金TransScript? Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，DNA純化回收利用全式金瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 魚腥草總RNA的提取和測序 將準備的葉片樣品（10份）分別在液氮中充分研磨，參照Trizol試劑RNA提取試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）說明書步驟提取各個樣品的總RNA，其中9份病樣總RNA由諾禾致源生物科技有限公司進行sRNA深度測序，在Illumina NovaSeq 6000平臺上以PE150 bp進行高通量測序，采用CLC Genomic Workbench 11以默認參數（QIAGEN，Hilden，Germany）進行數據分析。

1.2.2 魚腥草花葉病毒的RT-PCR檢測 根據深度測序后的比對結果設計引物，用于RT-PCR檢測和驗證sRNA測序結果，以健康的魚腥草葉片作為陰性對照，選取1號魚腥草花葉病樣進行RT-PCR檢測。以總RNA為模板，參照全式金TransScript? Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作說明逆轉錄合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增的模板。PCR引物為黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）CP基因通用檢測引物（CMVCPuF 5'-TCTCATGGATG CTTCTCCGCG -3'，CMVCPuR 5'-CCGTAAGCTGGACAACC-3'）[9]。PCR反應體系為10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.2 μL，Green Tap Mix 5 μL，加ddH2O 3.6 μL。循環(huán)體系為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并參照全式金瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書對目標產物進行回收純化，送至武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI核酸數據庫內進行BLAST比對。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用MEGA 7.0軟件對擴增得到的CMV CP基因序列構建系統(tǒng)進化樹，采用鄰接法（Neighbor-joining），分支置信度（bootstrap）設置為1000構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 魚腥草花葉病田間癥狀

當陽市兩河鎮(zhèn)魚腥草示范基地中魚腥草花葉病的癥狀主要表現為葉片褪綠黃化斑駁、葉脈黑褐色，主要集中在葉片邊緣，嚴重時擴展至整片葉片，部分葉片厚度增加或呈現點狀或條狀壞死，部分葉片萎黃，整株沒有明顯矮化現象（圖1）。

2.2 魚腥草花葉病的sRNA深度測序

為鑒定魚腥草上可能存在的病原，選取表現典型癥狀的魚腥草植株進行高通量測序，共得到總計32 126 252條原始數據（reads），采用Blastn或Blastx與GenBank登錄序列進行比對分析，得到110 501條拼接序列（contigs），這些拼接序列的長度范圍在15～18 773 bp，進一步將這些序列與目前已登錄的所有病毒序列進行比對，僅比對到3個病毒相關的拼接序列，長度分別是3427、3282、2461 bp，經Blastn序列比對分別匹配到黃瓜花葉病毒的RNA1（KX883818）、RNA2（KX883817）和RNA3（EU665002）。根據以上結果，初步判斷引起魚腥草花葉病的病毒為黃瓜花葉病毒。

2.3 魚腥草花葉病毒的RT-PCR檢測

為了驗證sRNA測序分析的結果，利用特異性引物對CMV的CP基因序列進行測序分析，以健康無病的魚腥草葉片為陰性對照，以CMV病毒為陽性對照。結果顯示，1號魚腥草樣品中擴增得到大小為878 bp的片段，陽性對照也可得到該片段，而健康魚腥草葉片樣品中并未得到該目標條帶（圖2）。

將所得序列進行BLAST比對，發(fā)現該序列與報道的50個CMV分離物CP基因序列核苷酸序列相似性為96.71%～97.84%。其中與CMV杭州番茄分離物的核苷酸序列（GenBank登錄號：DQ249298.1）相似性最高，達到97.84%，說明魚腥草花葉病樣品中分離得到的病毒為CMV病毒。將得到的魚腥草花葉病病毒命名為CMV-YXC，選取GenBank中具有代表性的CMV病毒CP基因的核苷酸序列構建系統(tǒng)進化樹（圖3）。結果顯示，魚腥草中分離的CMV病毒的CP基因序列與CMV II亞組的代表菌株日本西紅柿（GenBank登錄號：AB176847.1）及中國西紅柿分離物（GenBank登錄號：DQ249298.1）、韓國甘露子分離物（GenBank登錄號：LC487909.1）和中國萬壽菊分離物（GenBank登錄號：EU665002.1）等分布在進化樹同一分支。

3 討論與結論

當陽市兩河鎮(zhèn)是我國首個“魚腥草之鄉(xiāng)”，隨著魚腥草種植規(guī)模的不斷擴大，以根莖無性繁殖為主的魚腥草種植模式導致的種源帶菌問題也日益凸顯，尤其是魚腥草花葉病的發(fā)生越來越嚴重，對魚腥草嫩莖葉的采收和地下莖的生長均造成較大影響，給魚腥草產業(yè)的健康發(fā)展造成一定阻礙。

sRNA深度測序能夠在病毒濃度較低的情況下對植物組織中的病毒種類進行鑒定，相比常規(guī)的病毒檢測方法，sRNA深度測序技術具有適用性強、靈敏度高和獲取信息豐富的特點[10]。筆者通過對兩河鎮(zhèn)魚腥草花葉病樣的采集，結合sRNA深度測序和RT-PCR檢測分析，結果表明當陽市魚腥草花葉病的病原為CMV病毒。

目前，黃瓜花葉病毒CMV是已知寄主最多、分布最廣、危害性最大的植物病毒之一，是雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬的代表種，可侵染1000多種雙子葉植物和單子葉植物，是禾谷類作物、牧草、木本和草本觀賞植物、蔬菜及果樹上發(fā)生最廣、危害最大的病毒。在新疆喀什地區(qū)，該病毒和辣椒輕斑駁病毒PMMoV可復合侵染引起辣椒病毒病[11]，河南洛陽地區(qū)辣椒、菜豆、花生和番茄上均發(fā)現了該病毒[12]。CMV病毒根據寄主類型、致病性和外殼蛋白序列等分為CMV I和CMV II亞組[13]，2個亞組在我國均已有報道，但CMV I發(fā)生概率遠高于CMV II[12]，如首次在山西鵝絨藤上發(fā)現的花葉病病毒經鑒定屬于CMV I中的成員[14]，在云南茉莉花上分離的CMV-YYJMLH屬于亞組I中的IB亞組，與CMV云南辣椒分離物親緣關系最近[15]。而此次引起魚腥草花葉病的黃瓜花葉病毒經分析屬于CMV II，與中國和日本西紅柿上的分離物等親緣關系較近，并未鑒定得到CMV I。由此可見，目前當陽地區(qū)侵染魚腥草引起花葉病的病毒主要為黃瓜花葉病毒CMV II，由于CMV I的危害性和發(fā)生概率高于CMV II[16]，因此有必要繼續(xù)擴大當地魚腥草病毒病的檢測范圍和數量，做好當陽魚腥草示范基地的CMV監(jiān)測工作。

黃瓜花葉病毒在田間主要是通過蚜蟲、種子及汁液傳播[17]，而魚腥草以根莖無性繁殖為主，生產中建議預防為主，使用防蟲網，避免蚜蟲傳毒；同時培養(yǎng)壯苗，適期定植；合理施用有機肥，采用配方施肥技巧，加強管理。在發(fā)病早期，噴灑24%混脂酸·銅水劑700～800倍液，或30%壬基酚磺酸銅水乳劑600倍液、2%寧南霉素水劑500倍液、0.5%菇類卵白多糖水劑300倍液，或1.5%植病靈Ⅱ號乳劑1000倍液、10%混雜脂肪酸銅水劑100倍液等。為保障魚腥草產業(yè)的健康發(fā)展，在生產上加強對魚腥草蚜蟲等蟲害防控、減少田間農事操作對植株的損傷，同時加強魚腥草種苗病毒檢測，做好抗病品種篩選鑒定，利用組織培養(yǎng)等技術進行脫毒種苗生產相關研究，結合病毒防控和抗病無病種苗研發(fā)等多方面保障魚腥草產業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。

綜上所述，筆者的研究首次證實了魚腥草花葉病的病原屬于CMV 亞組II，同時有必要對該病的發(fā)生做好監(jiān)測工作，通過病毒防控和抗病種苗研發(fā)為魚腥草產業(yè)健康發(fā)展提供技術保障。

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