甜瓜KASP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及指紋圖譜構(gòu)建

摘 要：為豐富甜瓜分子標(biāo)記類(lèi)型，并為后續(xù)甜瓜種質(zhì)、品種及種子純度鑒定提供簡(jiǎn)便、高效的檢測(cè)方法，分別在甜瓜每條染色體上挑選6個(gè)核心SNP位點(diǎn)，共72個(gè)標(biāo)記，通過(guò)KASP技術(shù)對(duì)11份甜瓜種質(zhì)進(jìn)行基因分型，確定了45對(duì)具有較好分型效果的標(biāo)記，標(biāo)記設(shè)計(jì)成功率為62.5%。從45對(duì)分型較好的標(biāo)記中挑選25個(gè)基因型分簇集中的最優(yōu)標(biāo)記，對(duì)31份甜瓜種質(zhì)進(jìn)行基因分型，明確了各種質(zhì)在25個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性，通過(guò)聚類(lèi)分析，分成了3組，并構(gòu)建了31份甜瓜種質(zhì)的指紋圖譜，為甜瓜種質(zhì)資源利用和種子純度鑒定提供了參考。

關(guān)鍵詞：甜瓜；KASP；SNP ；指紋圖譜

中圖分類(lèi)號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）09-009-09

Development of melon KASP markers and construction of fingerprints

XIAO Yuzhen1， ZHANG Ruiqing1， ZHANG Yuexing1， DAI Xue1， ZHANG Yong1， WANG Zhongyuan1， YU Rong2， HOU Yinjie1， ZHANG Xian1， WEI Chunhua1

（1.College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. Institute of Horticulture， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan 750000， Ningxia， China）

Abstract： To enrich spectrum of molecular markers in melon and offer a straightforward and efficient protocol for the subsequent identification of melon germplasm， variety， and seed purity， this investigation identified six pivotal single-nucleotide polymorphism（SNP）loci distributed across the melon genome， encompassing a total of 72 markers. Utilizing the KASP（kompetitive allele-specific PCR）assay， these markers were employed to genotype 11 melon germplasm accessions， resulting in the identification of 45 marker pairs exhibiting superior typing performance. The success rate of marker design reached 62.5%， and from these 45 pairs， the most optimal markers for the 25 identified genetic clusters were selected， and the polymorphisms of 31 muskmelon germplasm were divided into 3 groups， and the fingerprints of 31 muskmelon germplasm were constructed to provide reference for the utilization of muskmelon germplasm resources and seed purity identification.

Key words： Melon; KASP; SNP; Fingerprints

收稿日期：2024-05-29；修回日期：2024-07-19

基金項(xiàng)目：2023年西甜瓜良種聯(lián)合攻關(guān)；寧夏農(nóng)林科學(xué)院高質(zhì)量發(fā)展和生態(tài)保護(hù)科技創(chuàng)新示范項(xiàng)目（NGSB-2021-7）

作者簡(jiǎn)介：肖玉珍，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槲鞴咸鸸戏N質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail：2391367158@qq.com

通信作者：張 顯，男，教授，研究方向?yàn)槲鞴咸鸸戏N質(zhì)資源收集、評(píng)價(jià)與利用。E-mail：zhangxian@nwsuaf.edu.cn

魏春華，男，副教授，主要從事西瓜甜瓜育種研究。E-mail：xjwend020405@nwafu.edu.cn

甜瓜（Cucumis melo L.）不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且種植地區(qū)廣泛、模式多樣，栽培歷史悠久[1]。在超市里經(jīng)?？吹礁鞣N各樣的甜瓜品種，其具有解暑和保護(hù)肝臟的功能，因此深受人們喜愛(ài)[2]。中國(guó)甜瓜種質(zhì)資源豐富，栽培與馴化歷史悠久，據(jù)考證至少在3000年以上，目前以設(shè)施栽培為主[3]。對(duì)甜瓜種質(zhì)資源形態(tài)性狀的了解程度，將直接影響其育種的進(jìn)程和水平。

競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）技術(shù)是基于SNP和Indel位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的一款自動(dòng)化、高通量檢測(cè)的分子標(biāo)記[4]。其基于標(biāo)記末端位點(diǎn)的差異，采用雙色熒光檢測(cè)1個(gè)SNP位點(diǎn)的2種基因型，可對(duì)基因組DNA樣品中的目標(biāo)SNP進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因分型檢測(cè)[5]。作為新一代的SNP檢測(cè)技術(shù)，KASP基因分型技術(shù)具有較高的準(zhǔn)確性、較強(qiáng)的位點(diǎn)適應(yīng)性以及適合大樣本檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在遺傳穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、特異性、靈活度、試驗(yàn)成本和檢測(cè)效率方面都具有一定的優(yōu)勢(shì)[6]，是國(guó)際上動(dòng)植物遺傳育種主流的SNP分型工具之一，先后建立了小麥、水稻等多種作物基因組KASP標(biāo)記庫(kù)，這些標(biāo)記技術(shù)在作物遺傳育種研究中具有極高的應(yīng)用價(jià)值[7]。陸海燕等[8]研究表明，KASP標(biāo)記可在玉米種質(zhì)資源分析、連鎖群構(gòu)建以及雜種優(yōu)勢(shì)群劃分等方面發(fā)揮重要作用。Makhoul等[9]開(kāi)發(fā)了高度可重復(fù)、穩(wěn)定的KASP檢測(cè)方法，可預(yù)測(cè)來(lái)自高度同源小麥染色體區(qū)域的根生物量QTL單倍型。Steele等[10]通過(guò)比較120個(gè)不同水稻種質(zhì)的全基因組序列，確定了合適的位點(diǎn)，產(chǎn)生了最佳的KASP設(shè)計(jì)，作為靈活有效的分析工具，對(duì)行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的食品真?zhèn)螠y(cè)試具有可利用的價(jià)值。Cheon等[11]成功構(gòu)建了包含205個(gè)KASP標(biāo)記的遺傳圖譜，在81個(gè)KASP標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育分析中，13個(gè)韓國(guó)粳稻品種表現(xiàn)出密切的遺傳關(guān)系。Chen等[12]開(kāi)發(fā)了71 311個(gè)玉米的KASP-SNP標(biāo)記，并定位在16 161個(gè)基因上。

甜瓜育種近年來(lái)由于重復(fù)使用骨干親本、缺乏新的基因資源以及不夠規(guī)范的市場(chǎng)經(jīng)營(yíng)，使甜瓜品種鑒定難度增大，單單依靠田間表型性狀鑒定很難區(qū)分[13]。分子標(biāo)記，特別是微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）在品種鑒定中發(fā)揮著重要作用[14]。目前，在甜瓜中，大部分種質(zhì)資源及品種的指紋圖譜由SSR標(biāo)記構(gòu)建[15-17]，其缺點(diǎn)是多態(tài)性低、操作步驟繁瑣、不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且對(duì)于大批量樣品檢測(cè)耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、人工成本高[18]。因此，開(kāi)發(fā)基于KASP技術(shù)的SNP標(biāo)記用于甜瓜品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建具有重要意義。筆者利用KASP技術(shù)篩選出一套能夠準(zhǔn)確鑒別甜瓜品種的核心KASP-SNP分子標(biāo)記，并構(gòu)建甜瓜種質(zhì)的SNP指紋圖譜，以期為甜瓜品種保護(hù)和鑒定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的31份甜瓜種質(zhì)均來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)西甜瓜種質(zhì)資源與遺傳育種團(tuán)隊(duì)，均為自交系。全部甜瓜材料用55 ℃溫湯浸種，在25 ℃培養(yǎng)箱中催芽后，于2023年10月播種在西北農(nóng)林科技大學(xué)科研溫室50孔穴盤(pán)內(nèi)，每個(gè)種質(zhì)播3粒種子，進(jìn)行正常的水肥管理，保證能夠出芽出苗。甜瓜種質(zhì)名稱如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 待甜瓜幼苗長(zhǎng)到2葉1心后，取其嫩葉1 g左右放入冷凍磨樣管中，加入1 mL 2% CTAB，放入65 ℃烘箱中加熱30 min，加入800 μL體積比為24∶1的氯仿和異戊醇，離心抽取上清液之后再加入2/3體積的異丙醇，上下顛倒之后再離心，用酒精洗滌2次，加入蒸餾水溶解DNA，在4 ℃保存?zhèn)溆?。然后使用紫外分光光度?jì)測(cè)定每份DNA的濃度，用于PCR反應(yīng)。

1.2.2 KASP標(biāo)記的設(shè)計(jì) 根據(jù)西甜瓜種質(zhì)資源與遺傳育種團(tuán)隊(duì)甜瓜種質(zhì)重測(cè)序數(shù)據(jù)和Liu等[19]對(duì)297份野生、地方品種和改良甜瓜種質(zhì)進(jìn)行重測(cè)序獲得的2 045 412個(gè)優(yōu)質(zhì)SNP，利用軟件BWA比對(duì)到甜瓜基因組DHL92，通過(guò)GATK鑒定高質(zhì)量的SNPs；在甜瓜每條染色體上挑選6個(gè)核心SNP位點(diǎn)（在染色體盡量均勻分布），共12條染色體，通過(guò)張軍利博士開(kāi)發(fā)公布的腳本程序SNP_Primer_Pipeline2-master（https：//github.com/pinbo/SNP_Primer _Pipeline）進(jìn)行KASP引物設(shè)計(jì)。引物由陜西中科羽瞳生物科技有限公司合成，一套KASP引物包括兩條正向競(jìng)爭(zhēng)性引物（F1/F2）和一條反向通用引物（R）。F1尾部添加能夠與FAM熒光結(jié)合的特異性序列，F(xiàn)2尾部添加能夠與HEX熒光結(jié)合的特異性序列。

1.2.3 PCR反應(yīng) 用蒸餾水溶解稀釋引物濃度至 100 μmol·L-1，并且按照如下體系配置引物混合物（Primer Mix）：正向引物Forward1和Forward 2各12 μL，反向引物30 μL，加蒸餾水至100 μL，配置完成后保存于4 ℃?zhèn)溆茫绻４孑^長(zhǎng)時(shí)間，則在-20 ℃條件下保存。試驗(yàn)采用96孔板，反應(yīng)孔體系如下：DNA 模板1.00 μL，Primer Mix 0.14 μL，2×KASP Mix（北京嘉程生物科技有限公司產(chǎn)品）5.00 μL，蒸餾水4.00 μL，配置完成后封膜，每組DNA樣品中設(shè)置2個(gè)陰性對(duì)照（NTC）。

將加樣完成的PCR板放入熒光定量檢測(cè)儀器中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，程序如下：95℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，61～55 ℃復(fù)性和延伸1 min，10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次降低0.6 ℃；95 ℃變性15 s，55 ℃退火40 s，35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)據(jù)，若分型不充分，則繼續(xù)擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃變性20 s，55 ℃退火40 s，每3個(gè)循環(huán)查看分型情況，直到分型明顯。

1.2.4 KASP基因分型 熒光定量PCR結(jié)束后，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudio 3，賽默飛）進(jìn)行分型及分析。顯示紅色、綠色和藍(lán)色的分簇，并且紅色和藍(lán)色的分簇分別靠近X軸和Y軸的為有效引物，顯示單一黑色的為無(wú)效引物。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)引物信息、熒光信號(hào)和分型結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每個(gè)SNP位點(diǎn)基因型。使用Excel2010中的插件QR4ofice制作圖譜二維碼。使用TBtools軟件的Show Genes on Chromosome進(jìn)行標(biāo)記在染色體位置的分析；采用MEGA X軟件10.2.6 wins64版本進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜KASP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

在甜瓜每條染色體上分別設(shè)計(jì)6個(gè)KASP-SNP標(biāo)記，共72個(gè)，其染色體分布如圖1所示。在甜瓜全基因組范圍共挑選的72個(gè)KASP-SNP標(biāo)記中，所有標(biāo)記的Tm值在57.018～61.641之間，兩條競(jìng)爭(zhēng)性引物的Tm值差值都為0。引物的序列長(zhǎng)度在20～46 bp之間，2條競(jìng)爭(zhēng)性引物的序列長(zhǎng)度差也都為0 bp，GC含量在32.00%～66.67%之間。

2.2 甜瓜KASP標(biāo)記的驗(yàn)證

在31個(gè)甜瓜種質(zhì)中初步挑選了11份種質(zhì)，開(kāi)展72個(gè)KASP標(biāo)記的分型效果驗(yàn)證。經(jīng)檢測(cè)，在72個(gè)KASP 標(biāo)記中，共有45個(gè)引物可分型成功，引物設(shè)計(jì)成功率為62.5%；但每條染色體上的引物成功率也有差異（表2），如5號(hào)和6號(hào)染色體上引物設(shè)計(jì)的成功率最高，達(dá)到了83.3%，而1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、9號(hào)和11號(hào)染色體上引物設(shè)計(jì)的成功率都為50%。

在具有多態(tài)性的標(biāo)記中，有25個(gè)相同基因型分簇集中的標(biāo)記，這類(lèi)標(biāo)記為最優(yōu)標(biāo)記（圖2-a，表3）；以及相同基因型分簇較分散的標(biāo)記（圖2-b），雖然擴(kuò)增之后有更加聚集的趨勢(shì)，但是這類(lèi)標(biāo)記后續(xù)進(jìn)行種質(zhì)資源或品種材料的遺傳多樣性分析時(shí)存在風(fēng)險(xiǎn)。無(wú)擴(kuò)增的標(biāo)記在不可使用的標(biāo)記中的占比最大（圖2-c）；還有相同基因型分簇分散或者交織在一起的標(biāo)記（圖2-d），這類(lèi)標(biāo)記雖然可以將樣本聚成3種基因型，但其過(guò)于分散或交織，使3種基因型的分型結(jié)果彼此之間距離太近，容易產(chǎn)生誤判，因此將其歸為無(wú)法使用；由于所選甜瓜種質(zhì)資源均為自交系，所以基因型分簇時(shí)雜合基因所占比例非常低。

2.3 聚類(lèi)分析圖

根據(jù) KASP 分型結(jié)果，筆者將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成不同位點(diǎn)的基因型，運(yùn)用 MEGA X軟件對(duì) 31份材料進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果如圖 3所示。在距離為0.2～0.4之間，將參試品種劃分為3個(gè)類(lèi)群，第一個(gè)類(lèi)群有23份種質(zhì)材料，包括天玉（Cm015）、M14（Cm020）、M117（Cm014）等，說(shuō)明這些種質(zhì)的遺傳關(guān)系相近，且除云甜（Cm026）外，其余22份種質(zhì)都為長(zhǎng)毛甜瓜亞種，其幼嫩果皮子房上被密而長(zhǎng)的茸毛，包括大部分果型大、耐貯藏的商品甜瓜。第二類(lèi)群為Y101（Cm025）和黑甜瓜（Cm011），而在選育的時(shí)候，他們的育種方向都是短毛甜瓜亞種，這一類(lèi)群甜瓜的特點(diǎn)為口感鮮美，生長(zhǎng)周期短。第三類(lèi)群為CC4（Cm008）、M1-43（Cm031）、IranH（Cm010）、QianLVNO.1（Cm002）、2014-32（Cm027）和2014-B326（Cm030），而第三類(lèi)群又被分為了短毛甜瓜亞種和長(zhǎng)毛甜瓜亞種2個(gè)亞類(lèi)。

2.4 指紋圖譜構(gòu)建

利用 KASP 分型最優(yōu)的25個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建了甜瓜31個(gè)種質(zhì)的指紋圖譜，如表4所示，因所選用的材料都是甜瓜自交系，所以大部分都為純合基因，在25個(gè)SNP標(biāo)記中，CmSNP10和CmSNP17中除了2個(gè)分型失敗的種質(zhì)，其余均為純合基因，且基因型一致；CmSNP22和 CmSNP25均為純合基因，但是有兩種不同的基因型。CmSNP1、CmSNP2、CmSNP3和CmSNP19中都只有一個(gè)雜合基因，其余都為純合基因。CmSNP18在Cm011中是雜合基因（TC），其他種質(zhì)在該位點(diǎn)的基因型均為純合（CC）。CmSNP5和CmSNP6中只有純合基因型1和雜合基因，沒(méi)有純合基因型2。根據(jù)位點(diǎn)基因型信息，將每個(gè)品種指紋圖譜轉(zhuǎn)化為二維碼（圖4），方便品種的真實(shí)性鑒定和推廣。

3 討論與結(jié)論

甜瓜栽培歷史悠久，早在2000多年前的秦漢時(shí)期，已在帝都長(zhǎng)安近郊邵平店和湖南長(zhǎng)沙馬王堆發(fā)現(xiàn)了薄皮甜瓜的蹤跡[20]。甜瓜育種時(shí)，明確種質(zhì)資源和育種材料的遺傳背景至關(guān)重要。21世紀(jì)初，法國(guó)學(xué)者Pitrat[21]提出了“栽培甜瓜的種下分類(lèi)評(píng)述”，結(jié)合其描述，中國(guó)甜瓜材料大致來(lái)源于5個(gè)變種，包括薄皮甜瓜中的梨瓜變種（var. chinensis）和越瓜變種（var. conomon）、厚皮甜瓜中的粗皮變種（var. cantalupensis）、網(wǎng)紋變種（var. reticulatus）和冬甜瓜變種（var. inodorus）。幾年后，Pitrat[22]又在另一篇文章中提出薄皮甜瓜是甜瓜 （Cucumis melo L.）的一種變異類(lèi)型， 對(duì)應(yīng)于植物學(xué)分類(lèi)的短毛亞種 （ssp. agrestis），而厚皮甜瓜則對(duì)應(yīng)長(zhǎng)毛亞種（ssp.melo）。筆者通過(guò)對(duì)31份甜瓜材料進(jìn)行聚類(lèi)分析的結(jié)果表明，天玉（Cm015）和M14（Cm020）等都聚在同一個(gè)分支，說(shuō)明這些種質(zhì)的遺傳關(guān)系相近，且除了云甜（Cm026）外，都為長(zhǎng)毛甜瓜亞種，Y101（Cm025）和黑甜瓜（Cm011）被聚類(lèi)到同一個(gè)分支上，且其都為短毛甜瓜亞種，由此可以證明KASP分子標(biāo)記技術(shù)能初步鑒別甜瓜種質(zhì)資源，但由于試驗(yàn)甜瓜種質(zhì)的遺傳關(guān)系沒(méi)有足夠明確，所以對(duì)區(qū)分甜瓜種質(zhì)資源存在可行性，但其實(shí)用性還有待進(jìn)一步檢驗(yàn)。徐志紅等[23]研究表明，不同類(lèi)型薄皮甜瓜之間比薄皮甜瓜與厚皮甜瓜之間的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，新選育的薄皮甜瓜與厚皮甜瓜雜交的品種與傳統(tǒng)厚皮甜瓜的親緣關(guān)系近，可劃分為厚皮甜瓜，東西方學(xué)者根據(jù)甜瓜的形態(tài)都競(jìng)相提出各自的分類(lèi)系統(tǒng)，分歧甚大[24]。近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)取得了進(jìn)步，從限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD） 到擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、裂解擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）[25-26]，而KASP是一種比較新的基因分型測(cè)定方法，不僅準(zhǔn)確高效，而且試劑價(jià)格低廉，在Hao等[27]的研究中，雖然SSR標(biāo)記依舊有效有用，但是其在試驗(yàn)過(guò)程中要么沒(méi)有目標(biāo)條帶，要么過(guò)于復(fù)雜而無(wú)法識(shí)別。與SSR標(biāo)記相比，KASP因其穩(wěn)定性、可靠性高和高通量而被廣泛使用。趙傳超等[28]認(rèn)為，SSR、插入/缺失標(biāo)記（InDel）等需要電泳技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，操作過(guò)程較為繁瑣，標(biāo)記數(shù)量有限，檢測(cè)數(shù)據(jù)整合困難，操作耗時(shí)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大批量的準(zhǔn)確檢測(cè)等問(wèn)題，正逐漸被SNP標(biāo)記所取代，主要應(yīng)用于基因定位和遺傳圖譜的繪制[29]。葉青靜等[30]通過(guò)比對(duì)常規(guī)的PCR標(biāo)記，KASP-SNP檢測(cè)數(shù)據(jù)的讀取完全自動(dòng)化，通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR擴(kuò)增和熒光掃描就能快速獲得基因分型結(jié)果，不需要經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，從而提高了檢測(cè)效率，還避免了交叉污染和假陽(yáng)性的產(chǎn)生。隨著育種技術(shù)的發(fā)展，高效育種的模式需要多個(gè)技術(shù)的應(yīng)用，通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)了解育種材料的遺傳背景、開(kāi)發(fā)實(shí)用的分子標(biāo)記、進(jìn)行基因精細(xì)定位已經(jīng)成為常規(guī)的研究手段[31]，從而使甜瓜育種進(jìn)入現(xiàn)代分子育種時(shí)代。

綜上所述，筆者通過(guò)KASP技術(shù)對(duì)11份甜瓜種質(zhì)進(jìn)行基因分型，確定了45對(duì)具有較好分型效果的標(biāo)記，并從中挑選25個(gè)基因型分簇集中的最優(yōu)標(biāo)記，對(duì)31份甜瓜種質(zhì)進(jìn)行基因分型，構(gòu)建了31份甜瓜種質(zhì)的指紋圖譜，對(duì)后續(xù)明確甜瓜種質(zhì)資源和遺傳背景以及鑒定種子純度等具有重要意義。

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