食藥用菌的基因組學研究進展

摘 要：以食藥用菌為研究對象，概述了食藥用菌的基因組測序現(xiàn)狀及基于基因組測序的基因挖掘和改造等方面的應用。據(jù)NCBI數(shù)據(jù)，擔子菌基因組測序數(shù)據(jù)有980條記錄；子囊菌基因組測序數(shù)據(jù)有3850條記錄，目前有130余種食藥用菌已經(jīng)完成基因組測序工作。比較基因組學在靈芝、香菇、樟芝等部分真菌中的應用，為研究該物種的遺傳多樣性、進化和次生代謝物的生物合成奠定了基礎。CRISPR/Cas9基因編輯技術可以快速高效地實現(xiàn)食藥用菌基因的精準編輯，包括基因敲除、點突變和基因插入等操作。基因組學的研究將有助于改善食藥用菌的品質(zhì)、提高其營養(yǎng)價值，甚至開發(fā)新品種，并促進食藥用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

關鍵詞：食藥用菌；核基因組；線粒體基因組；基因挖掘；CRISPR/Cas9

中圖分類號：S646 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）09-001-08

Advances in genomics of edible and medicinal fungi

WANG Fengli1， HAN Chuang1，2， JIAO Lihe1， YUE Xin1， GUO Yan1， DAI Xiaodong1

（1. Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150010， Heilongjiang， China; 2. College of Plant Protection， Northeast Agricultural University/Key Laboratory of Agricultural Microbiology of Heilongjiang Province， Harbin 150030， Heilongjiang， China）

Abstract： Here we present a comprehensive overview of the current status of genome sequencing in edible and medicinal fungi， as well as the application of gene mining and modification based on this technology. As of March 2024， NCBI reports a total of 980 basidiomycete genome sequencing records and 3850 ascomycete genome sequencing records. Additionally， numerous studies have successfully completed genome sequencing for over 130 species of edible and medicinal fungi. Comparative genomics has been applied to investigate genetic diversity， evolution， and secondary metabolite biosynthesis in specific fungi such as Ganoderma lucidum， Lentinus edodes， and Antrodia camphorata. Furthermore， CRISPR/Cas9 gene editing technology enables precise manipulation of genes in edible fungi through knockout， insertion， or point mutation operations. These advancements hold great potential for enhancing the quality and nutritional value of edible fungi while facilitating the development of new varieties to promote sustainable growth in the industry.

Key words： Edible and medicinal fungi; Nuclear genome; Mitochondrial genome; Gene mining; CRISPR/Cas9

收稿日期：2024-05-27；修回日期：2024-06-25

基金項目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務費項目（CZKYF2022SW01）

作者簡介：王鳳利，女，在讀碩士研究生，研究方向為食用菌種質(zhì)資源評價。E-mail：wang7877153@163.com

通信作者：戴肖東，男，研究員，研究方向為食用菌種質(zhì)資源評價。E-mail：heiweihlj@126.com

食藥用菌是具有較高營養(yǎng)價值和藥用價值的大型肉質(zhì)或膠質(zhì)子實體的高等真菌[1]。對我國食藥用菌的認識、開發(fā)和利用可以追溯到仰韶文化時期[2]，據(jù)報道，目前我國的食藥用菌種類有近千種，然而被廣泛認識和食用的僅有200余種[3]。自1996年首個真核生物－釀酒酵母基因組測序以來[4]，隨著測序方法的革新與測序成本的下降，真菌基因組學領域的研究取得了長足的發(fā)展。與其他真核物種相比，真菌的基因組結(jié)構(gòu)比較簡單，在序列注釋、基因改造方面都更為方便。當前，對真菌全基因組的研究已由單一物種的全基因組發(fā)展到基于群體基因組的多個基因序列，并將兩者進行整合研究，有望揭示基因水平轉(zhuǎn)移、正選擇、基因擴張和基因收縮等生物學問題。以真菌基因組的研究與發(fā)展作為良好的基礎應用于相應物種的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組及功能基因組研究，促進了真菌生物學乃至整個生物學的研究與發(fā)展[4]。近年來，我國食藥用真菌的分子生物學研究蓬勃發(fā)展，從理論到實際的應用，如在食用菌遺傳改良[5]、基因組注釋[6]、木質(zhì)素和纖維素合成酶基因[7]、抗病機制[8]、脅迫[9]等相關研究中都取得了前所未有的突破性成果。

1 食藥用菌的基因組測序現(xiàn)狀

基因組（genome）是指該生物體內(nèi)的DNA中全部遺傳物質(zhì)的總和[10]，一般包括核基因組、線粒體基因組、葉綠體基因組，在食藥用菌中只包含核基因組及線粒體基因組。據(jù)統(tǒng)計，食藥用菌的全基因組測序約有130種[4]，對于一些常見食藥用菌，如香菇（Lentinula edodes）、靈芝（Ganoderma lucidum）、蛹蟲草（Cordyceps militaris）、茯苓（Poria cocos）、黑木耳（Auricularia heimuer）等物種已完成多次基因組測序，其中部分測序水平已經(jīng)到了染色體水平，對更好地了解食藥用菌基因組有重要意義。這些基因組信息的獲得使深入的功能分析和系統(tǒng)的比較基因組學研究得以開展，為深入了解其生命規(guī)律和調(diào)控提供了堅實的理論基礎。

1.1 食藥用菌核基因組測序

截止2024年3月，據(jù)NCBI數(shù)據(jù)，擔子菌基因組測序數(shù)據(jù)有980條記錄；子囊菌基因組測序數(shù)據(jù)有3850條記錄，有研究表明，目前有130余種食藥用菌已經(jīng)完成基因組測序[4]，例如裂褶菌（Schizophyllum commune）、香菇、冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）、靈芝、茯苓、草菇（Volvariella volvacea）、黑木耳、蛹蟲草、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、金針菇（Flammulina filiformis）、樟芝（Taiwanofungus camphoratus ）、干巴菌（Thelephora ganbajun Zang）等，表1為5種常見食藥用菌基因組測序情況。裂褶菌是研究大型真菌遺傳發(fā)育的模式生物，Ohm等[11]對裂褶菌的基因組（38.5 Mb）進行分析，揭示了其獨特的木質(zhì)素降解機制。裂褶菌是首個完成基因組測序的大型真菌，目前NCBI已有35條裂褶菌基因組數(shù)據(jù)記錄。香菇是世界上第二大菇，該物種的基因組已被多次報道，但Yu等[12]首次結(jié)合高通量染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Hi-C）技術，構(gòu)建了香菇高質(zhì)量的染色體水平基因組，大小為45.87 Mb，99%的序列被錨定在10條染色體上，且通過對不同地區(qū)野生菌株和商業(yè)品種進行群體基因組重測序，在分子水平上確定了香菇的育種歷史。冬蟲夏草作為傳統(tǒng)藥物或者保健食品在中國已經(jīng)有幾千年的歷史，中國被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬蟲夏草唯一的正確變形體。為了更深入地了解其生理和藥理機制，Jin等[13]對中國被毛孢的基因組進行了測序，首次獲得覆蓋率>99%的中國被毛孢的基因組（102.72 Mb）。靈芝是一種食藥兼用菌，可產(chǎn)生多種生物活性化合物，其藥用價值在中國已有2000多年的歷史。Wu等[14]首次對靈芝基因組（49.15 Mb）進行了報道，預測編碼了13 125個基因。茯苓是中國最重要的傳統(tǒng)中藥之一，在中國、日本、韓國和其他亞洲國家普遍使用。Li等[15]組裝了茯苓第一個高質(zhì)量的核基因組，包含14條染色體，基因組全長64.44 Mb，Contig N50長度為3.76 Mb，并對菌核的基因組結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)座子和甲基化、高溫適應性和基因家族擴展進行了分析。

1.2 食藥用菌線粒體基因組測序

線粒體（mitochondrion，mt）作為食藥用菌的第二大基因組[16]，其基因組信息主要用于系統(tǒng)發(fā)育、分類鑒定、比較基因組學以及線粒體相關疾病的研究。隨著科學技術的發(fā)展、測序手段逐漸成熟，近年來在真菌線粒體方面的研究成果逐年增多，但是就目前報道情況來看，已完成線粒體基因組測序的真菌與其豐富的物種多樣性相對而言，遠遠不夠，且不同真菌線粒體基因組存在較大的差異。

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）的線粒體基因組（272.2 kb）是已報道的大型真菌中最大的，包含大量內(nèi)含子、線粒體非保守開放閱讀框和重復序列等[17]。煙色珊瑚菌（Clavaria fumosa）線粒體基因組是目前所報告的擔子菌最大的線粒體基因組，Wang等[18]對煙色珊瑚菌的完整線粒體基因組首次進行了測序、組裝和比較，長度為256 807 bp。樟芝是中國臺灣特有的一種珍貴的藥用真菌。Wang等[19]首次對樟芝的線粒體基因組進行了組裝，大小為114 922 bp。冬蟲夏草菌株1229的完整線粒體基因組被組裝為一個157 510 bp的單圓形dsDNA，鑒定出的保守基因包括大和小rRNA亞基、27個tRNA以及15個蛋白編碼基因，推測可能是編碼RTs和HEs的內(nèi)含子ncORFs導致了冬蟲夏草線粒體基因組的擴增[20]。線粒體基因組的測序在干巴菌、黑木耳、茯苓、草菇、香菇等真菌中也已有報道，多種食藥用菌的線粒體基因組均存在大量的基因組擴增、丟失、重排現(xiàn)象，可能是存在大量內(nèi)含子以及內(nèi)含子的特殊性導致的，但目前還沒有定論。

2 食藥用菌的比較基因組學研究

比較基因組學是在基因組測序的基礎上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進行比較，來了解基因的功能、表達機制和物種進化[21]。在食藥用菌中，比較基因組學一般應用于物種進化、種屬間的親緣關系研究等方面，像靈芝、香菇、樟芝等部分真菌通過對同種或同菌株的不同單核菌株進行測序，通過比較分析，研究該物種的遺傳多樣性，為了解其生物學、進化和次生代謝物的生物合成奠定了基礎。

2.1 比較基因組學在食藥用菌核基因組研究中的應用

為了解香菇兩個單倍體核基因組結(jié)構(gòu)及其在子實體發(fā)育和生長中的相互作用，Gao等[22]利用Illumina、HiFi和Hi-C技術從香菇中分離并組裝了SP3和SP30兩個單倍體基因組，總長度分別為50.93 Mb和49.80 Mb，雖然這兩個基因組都被組裝成10條染色體，但SP3和SP30這兩個單核體在染色體結(jié)構(gòu)和基因含量方面存在顯著差異；經(jīng)比較基因組分析，菌株尾部基因在這兩個基因組中所占比例約為30%。此外，這兩個基因組富集了不同的基因和基因家族，包括參與碳水化合物代謝、次級代謝和剪接體形成的基因。其中，SP30菌株的淀粉代謝基因和蔗糖代謝基因顯著富集，且SP30菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長速度快于SP3菌株。相反，SP3菌株重排基因豐富，可產(chǎn)生風味物質(zhì)5′-核苷酸。比較基因組分析表明，兩個單倍體核可能來自不同的遺傳祖先，其中約30%的基因組是獨特的或非合性的。在主要交配型位點之外的位置發(fā)現(xiàn)了不完整的交配型基因，這表明香菇交配系統(tǒng)可能繼續(xù)進化。Chen等[23]從兩個樟芝雙核菌——HC1（橘紅色）和SN1（乳白色）中分離出4個單核菌株，對這4個單核體的高質(zhì)量染色體水平的基因組序列進行了測序、注釋和比較分析，為了解該真菌的生物學、進化和次生代謝物的生物合成奠定了基礎，證明了樟芝具有四極交配系統(tǒng)，HC1和SN1代表了兩個表現(xiàn)出核型變異的物種內(nèi)分離物。與幾種食用菌模式生物相比，樟芝在基因家族和個體基因數(shù)量上發(fā)生了明顯收縮，尤其是在植物、真菌和細菌細胞壁降解酶方面，很好地解釋了樟芝在自然情況下罕見以及人工培養(yǎng)困難、耗時，且易受真菌和細菌感染的原因，為深入研究樟芝的遺傳操作、子實體改良以及在天然藥物生產(chǎn)中的合成生物學應用奠定了基礎。

2.2 比較基因組學在食藥用菌線粒體基因組研究中的應用

Wang等[18]通過比較煙色珊瑚菌線粒體基因組，發(fā)現(xiàn)其線粒體基因組包含最多的內(nèi)含子和內(nèi)含子編碼開放閱讀框（ORF），檢測到4個新的內(nèi)含子類，具有獨特的基因排列等特點。基于組合線粒體基因集的76個擔子菌的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，線粒體基因可以作為擔子菌進化的有效分子標記。Wang等[19]通過對樟芝線粒體基因組共線性進行分析，發(fā)現(xiàn)樟芝線粒體基因組包含一個獨特的基因序列，線粒體基因組之間存在大規(guī)模的基因重排；內(nèi)含子的數(shù)量和種類在12個多孔菌目屬物種中具有顯著的變異，證明了在多孔菌目屬物種的進化過程中發(fā)生了大量的內(nèi)含子丟失或獲得事件。Li等[24]通過對4個靈芝的線粒體基因組進行測序組裝，4個線粒體基因組的大小從50 603 bp到73 416 bp不等。靈芝線粒體基因組的大小在不同種類靈芝中存在差異，內(nèi)含子是影響靈芝線粒體基因組大小變化的主要因素，通過比較分析揭示了靈芝線粒體基因組種內(nèi)和種間的變異，在內(nèi)含子類型、非保守基因和基因排列等方面具有豐富的多樣性。

3 基于基因組測序?qū)κ乘幱镁蛲诰?/p>

全基因組序列的公布推動了大量相關的基因研究，但是對這些數(shù)據(jù)中的大量信息還未全部解析，目前階段還是大量利用生物信息學工具對基因組進行注釋，以及蛋白的功能預測，得到一些關于次級代謝產(chǎn)物、活性物質(zhì)以及木質(zhì)素降解相關的基因信息，研究主要集中于靈芝、蛹蟲草、香菇、金針菇、平菇等具有經(jīng)濟價值的食藥用菌。Fernández-fueyo等[25]對平菇基因組的分析表明，在一個木質(zhì)素降解系統(tǒng)中，多功能過氧化物酶承擔了木質(zhì)素過氧化物酶的作用，研究首次對擔子菌中完整的過氧化物酶同工酶進行了表征，揭示了其高熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性差異。Li等[7]對蛹蟲草疏水蛋白家族進行了全基因組分析，共鑒定了4個疏水蛋白編碼基因，每個疏水酶基因在生命周期和對光照的反應中具有不同的轉(zhuǎn)錄模式，具有致病性生活方式的子囊菌真菌比腐生菌更容易獲得較多的疏水性編碼基因，II類成員之間的變異比I類成員大，只有少數(shù)同源蛋白是通過重復進化的。Kim等[26]從金針菇的全基因組序列中鑒定和表征新的金針菇漆酶基因，在15個推測的漆酶基因中，發(fā)現(xiàn)4個新漆酶基因含有4個完整的銅結(jié)合區(qū)（10個組氨酸殘基和1個半胱氨酸殘基）和4個參與形成二硫橋的半胱氨酸殘基，分別為fvlac1、fvlac2、fvLac3和fvlac4。在fvlacc1 （Asn-454）、fvlacc2 （Asn-437和Asn-455）、fvlacc3 （Asn-111和Asn-237）和fvLac4 （Asn-402和Asn-457）的cDNA序列中鑒定出潛在的N-糖基化位點（Asn-Xaa-Ser/Thr），預測這些蛋白的前19～20個氨基酸殘基構(gòu)成信號肽。漆酶活性測定和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應分析表明，CuSO4影響這些漆酶基因的誘導和轉(zhuǎn)錄水平。靈芝酸（ganoderic acids， GAs）作為靈芝重要的藥理活性化合物，是一種三萜類化合物，其生物合成及其調(diào)控機制也是研究熱點，但直接調(diào)控GAs生物合成基因表達的轉(zhuǎn)錄因子尚不清楚。Liu等[27]結(jié)合基因組學、DAP-seq、RNA-seq、代謝組學等技術以及分子生物學和遺傳學方法，確定了轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）的可能靶點，包括三萜合成和脂質(zhì)代謝基因，首次發(fā)現(xiàn)SREBP在調(diào)節(jié)靈芝真菌GAs生物合成中的新未知功能，并證明SREBP通過結(jié)合啟動子區(qū)域，促進GA、麥角甾醇和脂質(zhì)生物合成相關靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而增強GAs、麥角甾醇和脂質(zhì)的代謝能力。

4 基于基因組測序?qū)κ乘幱镁虻母脑烨闆r

隨著食藥用菌的基因組數(shù)據(jù)公布，以及新基因的發(fā)現(xiàn)及基因功能研究的深入，利用分子手段對食藥用菌進行基因改造成為了熱點。建立穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)化體系是分子育種的基礎，主要方式包括PEG介導轉(zhuǎn)化法（PMT）、電擊法、基因槍法和農(nóng)桿菌介導法（ATMT）等[28]，目前在食藥用菌中應用較多的是PMT和ATMT。Chen等[29]利用ATMT技術將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到蛹蟲草，在5-FOA選擇性下獲得突變子。Tu等[30]通過PMT方法將質(zhì)粒pU6-ura3-sgRNA1引入到靈芝Cas9菌株和ku70突變體中獲得轉(zhuǎn)化子。對食藥用菌改造方向主要是利用基因敲除、基因過表達、基因沉默等方法，其中CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是對分子育種的一種重要手段。

4.1 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)

早在1987年，一段間隔短重復序列首次在K12大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[31]；直到2002年將其命名為CRISPR，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，大約有40%的細菌基因組上含有此序列；2012年，法國科學家利用重組Cas9蛋白以及體外轉(zhuǎn)錄的crRNA和tracRNA成功實現(xiàn)了體外切割實驗；此后華人科學家張峰博士對其進一步優(yōu)化，并申請專利；2020年，Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna由于發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9而獲得諾貝爾化學獎[32]。CRISPR/Cas9基因編輯技術，是對靶向基因進行特定修飾的技術。CRISPR/Cas9基因系統(tǒng)由一小段RNA（sgRNA）和一種高效的DNA切割酶（Cas核酸酶）組成，其原理主要是在sgRNA引導下，Cas9蛋白對靶基因位點進行特異性切割，產(chǎn)生DSB，再利用非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復（HDR）進行修復，最終實現(xiàn)目標基因敲除和堿基編輯等基因組遺傳修飾[33-34]。

4.2 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在食藥用菌研究中的應用

部分食藥用菌可產(chǎn)生具有經(jīng)濟價值的天然代謝物，為了獲得高產(chǎn)量的三萜、靈芝酸、多糖等代謝產(chǎn)物，通常是利用遺傳轉(zhuǎn)化方法對真菌代謝通路進行定向改造。傳統(tǒng)的同源重組方法基因敲除效率極低，而且食藥用菌多為異核體，獲得純合突變體的概率較低，所以目前研究人員將目光轉(zhuǎn)向了CRISPR/Cas9基因編輯技術。CRISPR/Cas9技術顯著提高了基因組編輯的效率，確定適當?shù)陌形稽c有助于評估編輯效率。在CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)中有3種常見的遞送策略：體內(nèi)Cas9核酸酶和體外sgRNA（體外表達Cas9的底盤與sgRNA）、體內(nèi)Cas9和sgRNA兩者（攜帶Cas9表達盒和sgRNA盒的全合一質(zhì)粒），以及體外Cas9和sgRNA兩者（RNP復合物）[35]。目前成功進行CRISPR/Cas9改造的食藥用菌并不多，并且大多數(shù)都是將篩選基因作為靶基因，如靈芝、蛹蟲草、平菇等，詳見表2。

Liu等[57]開發(fā)并優(yōu)化了一種基于金針菇中體外組裝的核糖核蛋白復合物的CRISPR/Cas9基因組編輯方法，并首次將其應用于金針菇，與其他方法相比，該方法避免了使用任何外源DNA，從而在質(zhì)粒構(gòu)建時節(jié)省了時間和勞動力。Boontawon等[40]將攜帶Cas9和靶向fcyl和pyrG的不同sgRNA的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)移到PC 9菌株的原生質(zhì)體中，產(chǎn)生了分別對5-氟胞嘧啶和5-氟乳清酸表現(xiàn)出抗性的菌株，首次證明在食用菌中使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)是可以進行基因編輯的。Chen等[29]在蛹蟲草中開發(fā)并建立了無標記的CRISPR-Cas9-TRAMA基因組編輯系統(tǒng)，進一步在蟲草素和麥角硫因的合成酶中操作編輯，以展示Cas9-TRAMA系統(tǒng)在蛋白質(zhì)修飾、啟動子強度評估和10 kb代謝合成簇缺失中的應用。Meng等[36]首次描述基于AMA1質(zhì)粒的大型真菌基因組編輯和精確靶向基因缺失，在蛹蟲草中構(gòu)建了基于具有AMAl序列的自主復制質(zhì)粒的高效CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，其研究結(jié)果將使多個基因的修飾在功能基因組學研究和菌株育種中成為可能。

CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)在大型真菌中的應用較植物、動物發(fā)展明顯不足，且就目前研究現(xiàn)狀來說，CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)在大型真菌中的應用還不完善、成熟，依舊停留在初級摸索階段。這些問題主要是由于大型真菌的基因組數(shù)據(jù)沒有得到全部解析、基因?qū)用媪私獠蛔阋约癈RISPR/Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率低下等。

5 展 望

我國擁有極其豐富的食藥用菌資源，以前研究者更多的是將關注點放在了食藥用菌的分類、栽培、育種等方面，更注重其經(jīng)濟價值。隨著組學技術的發(fā)展，在基因水平上了解一個物種成為一種趨勢。對于食藥用菌來說，了解其生長、發(fā)育和各種代謝通路產(chǎn)生的代謝物以及研究食藥用菌的進化漸漸變成重點。食藥用菌全基因組測序可幫助了解食藥用菌的基因構(gòu)成和結(jié)構(gòu)，通過聯(lián)系性狀、特性以及功能，可篩選出該菌與食用、藥用價值相關的基因，對推動食藥用菌在食品行業(yè)的發(fā)展，以及為醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論支持。在食藥用菌的基因組應用方面，利用比較基因組方法，不僅為大型真菌生理調(diào)節(jié)、形態(tài)差異、代謝調(diào)控等提供有力的理論支持，還可為將來食藥用菌的馴化栽培提供參考[58]。深入開展食藥用菌基因組研究，挖掘與次生代謝產(chǎn)物合成相關的基因、基因簇，并對其功能進行鑒定，這為高效、可控地生產(chǎn)有效化合物提供了技術手段，也為基因組學與合成生物學的學科交叉奠定了一定的理論基礎。真菌基因組的研究與發(fā)展作為良好的基礎應用于相應物種的轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組及基因組研究，促進了真菌生物學乃至整個生物學的研究和發(fā)展。

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