分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪垦芯?/h1>
2024-09-20 00:00:00謝林云李丹
食品安全導(dǎo)刊 2024年9期
摘 要：目的：優(yōu)化分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪康姆治龇椒ā７椒ǎ悍謩e針對方法中提取液除雜方式、揮干方式及水浴反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，并對優(yōu)化后的方法線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、專屬性及重復(fù)性等進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：測試方法中揮干方式為沸水浴揮干、除雜方式為4 000 r·min-1離心10 min、水浴條件為60 ℃反應(yīng)15 min；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在20～160 μg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 2，加標(biāo)回收率在93.12%～97.73%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.64%，方法檢出限為0.120 3 μg·mL-1，定量限為0.361 0 μg·mL-1。結(jié)論：該方法操作簡便，條件明確，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y定。
關(guān)鍵詞：分光光度法；破壁靈芝孢子粉；總?cè)?/p>
Abstract： Objective： To optimize the spectrophotometric analysis method for the determination of total triterpenoids in Ganoderma lucidum spore powder. Method： The extraction method of impurity removal， evaporation method and water bath reaction conditions were optimized， and the linearity， detection limit， quantification limit， accuracy， specificity and repeatability of the optimized method were verified. Result： The evaporation method was boiling water bath evaporation， impurity removal method was 4 000 r·min-1 centrifugation for 10 min， and water bath condition was 60 ℃ reaction for 15 min. The standard solution of ursolic acid had good linearity in the mass concentration range of 20 μg to 160 μg， the correlation coefficient R2 was 0.999 2， the recovery rate was between 93.12% and 97.73%， the relative standard deviation was lower than 0.64%， the method detection limit was 0.120 3 μg·mL-1， and the quantification limit was 0.361 0 μg·mL-1. Conclusion： This method is simple to operate， the conditions are clear， and the test results are highly accurate， which is suitable for the determination of total triterpenoid content in Ganoderma lucidum spore powder.
Keywords： spectrophotometry; Ganoderma lucidum spore powder; triterpenes
靈芝（Ganoderma lucidum）又稱為菌靈芝，是靈芝科靈芝屬真菌的總稱[1-2]。靈芝最早記錄于西漢時(shí)期《淮南子·修務(wù)訓(xùn)》[3-4]，《神農(nóng)本草經(jīng)》[5-8]將“青芝、赤芝、黃芝、紫芝、黑芝、白芝”六芝列為草部上品之首[9]，其中赤芝和紫芝為《中華人民共和國藥典》（2000版）首次收載[10]。靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、降低血糖血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用[11]。目前市面上的靈芝制品有破壁靈芝孢子粉、靈芝孢子油、靈芝孢子油軟膠囊等，以破壁靈芝孢子粉居多。破壁靈芝孢子粉是一種重要的保健食品原料，三萜類化合物是破壁靈芝孢子粉中最主要的活性成分[12]，具有多種生理活性，如保肝護(hù)肝[13]、抗炎[14]、降血糖[15]、抗腫瘤[16]、抗氧化[17]、神經(jīng)保護(hù)[18]等，應(yīng)用前景廣泛。因此，三萜類化合物含量可作為評價(jià)破壁靈芝孢子粉質(zhì)量高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
三萜類化合物是一類基本母核由30個(gè)碳原子所組成的萜類化合物，含有-（C5H8）n-通式及含氧衍生物，由6個(gè)異戊二烯單位聚合而成。近年來，靈芝三萜逐漸受到研究者的重視，相關(guān)報(bào)道日漸增多，測定靈芝三萜含量的方法主要分為分光光度法和液相色譜法：液相色譜法準(zhǔn)確度高，但需要大量的高純度三萜類化合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，要分離獲得高純度具有代表性的三萜化合物對照品技術(shù)難度很大；分光光度法準(zhǔn)確度雖不如液相色譜法，但能以目前自然界廣泛存在的三萜化合物熊果酸、齊墩果酸作為對照品。目前破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y定基本采用分光光度法。
現(xiàn)有的破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪康姆止夤舛确椒ㄖT多條件存在不明確的問題：《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（2020年版）中使用了離心，但是并未明確離心的條件；《保健食品功效成分檢測方法》一書中針對總?cè)坪繙y試方法的描述有，樣品提取后溶液渾濁可過濾等[12]，但并未定義如何判斷渾濁。因破壁靈芝孢子粉極易產(chǎn)生懸浮，相關(guān)測試條件不明確將導(dǎo)致測試結(jié)果不準(zhǔn)確、重現(xiàn)性差等問題。破壁靈芝孢子粉中總?cè)频臏?zhǔn)確測定現(xiàn)為業(yè)內(nèi)公認(rèn)的技術(shù)難點(diǎn)，因此急需對測試方法進(jìn)行優(yōu)化，明確測試條件并驗(yàn)證方法的可靠性。
本研究使用分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪浚ㄟ^對方法中揮干方式、除雜方式、水浴條件等進(jìn)行優(yōu)化，對所確立的方法線性范圍、檢出限與定量限、專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、耐用性等進(jìn)行評價(jià)，驗(yàn)證本方法的適用性、可靠性及優(yōu)越性，為食品分析、檢測以及質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度94.7%，CAS號77-52-1），BePure；乙酸乙酯、冰乙酸（分析純），天津大茂試劑廠；三氯甲烷（分析純），廣州試劑廠；高氯酸（優(yōu)級純），成都市科隆公司；香草醛（分析純），天津科密歐公司。
1.2 儀器與設(shè)備
UV-1800光度計(jì)（SHIMADZU）；ME204E、ME155DU分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；恒溫水浴鍋（常州普天公司）；XWDS-1018ST超聲波清洗器（東莞市萬德盛自動(dòng)化設(shè)備公司）；L-530離心機(jī)（湖南湘儀）。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 溶液配制
熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100 μg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg至100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯超聲溶解，定容，搖勻。
香草醛-冰乙酸溶液（50 mg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取香草醛5.0 g，加冰乙酸使溶解并定容至100 mL，即得。臨用前配制。
1.3.2 試樣制備
準(zhǔn)確稱定試樣0.1 g（相當(dāng)于總?cè)瀑|(zhì)量為0.5～5.0 mg），置于50 mL容量瓶，加三氯甲烷約30 mL，50 kHz超聲處理30 min，0 ℃水浴冷卻，加三氯甲烷定容，混勻，轉(zhuǎn)移靜置30 min，4 000 r·min-1離心10 min，移取上清液測用。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確移取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL和1.00 mL于比色管中，沸水浴揮干，冷卻后精密加入0.40 mL香草醛-冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動(dòng)比色管使殘?jiān)芙?，再?zhǔn)確加入1.0 mL高氯酸，混勻后放置60 ℃水浴中反應(yīng)15 min，取出，0 ℃冰浴冷卻，精密加入冰乙酸5.0 mL搖勻，15 min后轉(zhuǎn)移至比色皿中，在548 nm波長測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.4 試樣溶液的測定
精密量取試樣上清液1.0 mL置10 mL比色管中，沸水浴揮干，冷卻后精密加入0.4 mL香草醛-冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動(dòng)比色管使殘?jiān)芙?，再?zhǔn)確加入1.0 mL高氯酸，混勻后放置60 ℃水浴中反應(yīng)15 min，取出，0 ℃冰浴冷卻，精密加入冰乙酸5.0 mL搖勻，15 min后轉(zhuǎn)移至比色皿中，在548 nm波長測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中總?cè)频暮俊?/p>
1.3.5 數(shù)據(jù)處理
試樣中總?cè)疲ㄒ孕芄嵊?jì)）含量按公式（1）計(jì)算。
式中：X為試樣中總?cè)疲ㄒ孕芄嵊?jì)）含量，g/100 g；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣液中熊果酸質(zhì)量，μg；m為試樣質(zhì)量，g；V1為試樣三氯甲烷定容總體積，mL；V2為移取試樣上清液體積，mL。
2 結(jié)果與分析
2.1 測定波長的選擇
取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和破壁靈芝孢子粉三萜提取溶液，經(jīng)香草醛-冰乙酸和高氯酸顯色后，在450～700 nm掃描，獲得吸光度曲線見圖1。由圖1可知，在548 nm波長處熊果酸有最大吸收，在550 nm處破壁靈芝孢子粉三萜有最大吸收，兩者最大吸收波長基本一致，符合《中華人民共和國藥典》（2020版）最大波長允許誤差范圍要求，故確定548 nm為測定波長。
2.2 靈芝制品的選擇
選擇不同類型的靈芝制品（破壁靈芝孢子粉、靈芝孢子油、靈芝孢子油軟膠囊），按照《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（2020年版）中規(guī)定的方法進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。通過測試結(jié)果可以看出，破壁靈芝孢子粉的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）較大，且與理論值偏差較大，故選擇破壁靈芝孢子粉作為進(jìn)一步優(yōu)化研究基質(zhì)。
2.3 條件優(yōu)化
2.3.1 除雜方式的考察
在樣品制備階段，除雜方式可分為濾紙過濾、0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾、4 000 r·min-1離心（分別設(shè)置離心時(shí)間5 min、10 min、20 min）3種。表2結(jié)果表明，3種方式的結(jié)果都比較穩(wěn)定，濾紙過濾和0.45 μm有機(jī)濾膜過濾的測試結(jié)果與理論結(jié)果有一定的偏差，離心方式的測試結(jié)果更接近理論值。在離心時(shí)間的選擇方面，不同離心時(shí)間狀態(tài)如圖2所示，離心10 min后上清液澄清無肉眼可見懸浮顆粒。因此，選擇4 000 r·min-1離心10 min作為除雜方式進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.2 揮干方式的考察
在樣品測定階段，揮干方式可分為沸水浴揮干、105 ℃烘箱烘干、60 ℃水浴蒸干、氮?dú)獯蹈?種方式，表3結(jié)果表明：沸水浴揮干方式RSD為1.05%，結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性比其他方式更好。后續(xù)選擇沸水浴揮干進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.3 水浴條件的考察
樣品測定階段，分別在60 ℃+10 min、60 ℃+15 min、60 ℃+45 min、65 ℃+15 min和70 ℃+15 min 5種條件組合下，考察反應(yīng)溫度和時(shí)間對測試結(jié)果的影響（表4）?？梢园l(fā)現(xiàn)，測定值與水浴溫度和水浴時(shí)間呈正相關(guān)：溫度控制在60 ℃不變時(shí)，隨水浴時(shí)間增長測試結(jié)果變大；當(dāng)水浴時(shí)間均控制在15 min時(shí)，隨著水浴溫度升高測試結(jié)果變大。結(jié)果表明，60 ℃+15 min條件下測試結(jié)果與理論值更接近，偏差最小，因此選擇此水浴條件。
2.4 方法驗(yàn)證
2.4.1 線性范圍驗(yàn)證
分別精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液按1.3.3操作測定吸光值，如圖3所示，以熊果酸的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光值縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.008 07X-0.022 14，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，結(jié)果表明熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在20～160 μg范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。
2.4.2 檢出限和定量限考察
通過分析20個(gè)獨(dú)立試劑空白來計(jì)算方法檢測限，通過計(jì)算得，標(biāo)準(zhǔn)偏差Sd=0.002 104 μg，檢出限L’=3×Sd/b=0.782 2 μg（b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，0.008 07），此時(shí)檢出限L對應(yīng)試樣濃度為0.120 3 μg·mL-1，因此定量限=3×L=0.361 0 μg·mL-1。
2.4.3 專屬性實(shí)驗(yàn)
按照樣品的組分特點(diǎn)，采用羥丙基纖維素和葡萄糖混合（8∶2，m/m）配制陰性樣品，同時(shí)做試劑空白，比較兩組數(shù)據(jù)可知，空白溶液與陰性樣品均無吸收，專屬性良好。
2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)
選取一款靈芝孢子粉精密稱取0.1 g，平行稱取6份按1.3.2方法進(jìn)行樣品處理，按2.3方法優(yōu)化的條件進(jìn)行重復(fù)性測試。測試結(jié)果如表5所示，樣品中總?cè)破骄繛?.36 g/100 g，RSD為0.06%，方法重復(fù)性良好。
2.4.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)
精密稱取重復(fù)性試驗(yàn)環(huán)節(jié)靈芝孢子粉樣品0.1 g，加入低、中、高3個(gè)濃度水平的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，考察方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果如表6所示，回收率在93.12%～97.73%，RSD在0.13%～0.64%，精密度和準(zhǔn)確性良好。
3 結(jié)論
由于現(xiàn)有方法中測試條件不明確，導(dǎo)致破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y試結(jié)果準(zhǔn)確度低、穩(wěn)定性差。本研究通過對方法中揮干方式、提取液除雜方式及水浴反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，確立破壁靈芝孢子粉總?cè)茰y試的最佳條件中揮干方式為沸水浴揮干、除雜方式為4 000 r·min-1離心10 min、水浴條件為60 ℃反應(yīng)15 min。進(jìn)一步對方法線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、專屬性及重復(fù)性等進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法測試結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
綜合來看，該方法操作簡便，設(shè)備易得，耗時(shí)少，檢測效率高，適用于破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y定，能夠?yàn)殪`芝制品中功效成分含量準(zhǔn)確測定提供有力技術(shù)手段，為保健食品企業(yè)檢測技術(shù)提升和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。
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作者簡介：謝林云（1983—），男，湖南永州人，碩士，工程師。研究方向：保健食品、營養(yǎng)成分檢測技術(shù)。
摘 要：目的：優(yōu)化分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪康姆治龇椒ā７椒ǎ悍謩e針對方法中提取液除雜方式、揮干方式及水浴反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，并對優(yōu)化后的方法線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、專屬性及重復(fù)性等進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：測試方法中揮干方式為沸水浴揮干、除雜方式為4 000 r·min-1離心10 min、水浴條件為60 ℃反應(yīng)15 min；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在20～160 μg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 2，加標(biāo)回收率在93.12%～97.73%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于0.64%，方法檢出限為0.120 3 μg·mL-1，定量限為0.361 0 μg·mL-1。結(jié)論：該方法操作簡便，條件明確，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y定。
關(guān)鍵詞：分光光度法；破壁靈芝孢子粉；總?cè)?/p>
Abstract： Objective： To optimize the spectrophotometric analysis method for the determination of total triterpenoids in Ganoderma lucidum spore powder. Method： The extraction method of impurity removal， evaporation method and water bath reaction conditions were optimized， and the linearity， detection limit， quantification limit， accuracy， specificity and repeatability of the optimized method were verified. Result： The evaporation method was boiling water bath evaporation， impurity removal method was 4 000 r·min-1 centrifugation for 10 min， and water bath condition was 60 ℃ reaction for 15 min. The standard solution of ursolic acid had good linearity in the mass concentration range of 20 μg to 160 μg， the correlation coefficient R2 was 0.999 2， the recovery rate was between 93.12% and 97.73%， the relative standard deviation was lower than 0.64%， the method detection limit was 0.120 3 μg·mL-1， and the quantification limit was 0.361 0 μg·mL-1. Conclusion： This method is simple to operate， the conditions are clear， and the test results are highly accurate， which is suitable for the determination of total triterpenoid content in Ganoderma lucidum spore powder.
Keywords： spectrophotometry; Ganoderma lucidum spore powder; triterpenes
靈芝（Ganoderma lucidum）又稱為菌靈芝，是靈芝科靈芝屬真菌的總稱[1-2]。靈芝最早記錄于西漢時(shí)期《淮南子·修務(wù)訓(xùn)》[3-4]，《神農(nóng)本草經(jīng)》[5-8]將“青芝、赤芝、黃芝、紫芝、黑芝、白芝”六芝列為草部上品之首[9]，其中赤芝和紫芝為《中華人民共和國藥典》（2000版）首次收載[10]。靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、降低血糖血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用[11]。目前市面上的靈芝制品有破壁靈芝孢子粉、靈芝孢子油、靈芝孢子油軟膠囊等，以破壁靈芝孢子粉居多。破壁靈芝孢子粉是一種重要的保健食品原料，三萜類化合物是破壁靈芝孢子粉中最主要的活性成分[12]，具有多種生理活性，如保肝護(hù)肝[13]、抗炎[14]、降血糖[15]、抗腫瘤[16]、抗氧化[17]、神經(jīng)保護(hù)[18]等，應(yīng)用前景廣泛。因此，三萜類化合物含量可作為評價(jià)破壁靈芝孢子粉質(zhì)量高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
三萜類化合物是一類基本母核由30個(gè)碳原子所組成的萜類化合物，含有-（C5H8）n-通式及含氧衍生物，由6個(gè)異戊二烯單位聚合而成。近年來，靈芝三萜逐漸受到研究者的重視，相關(guān)報(bào)道日漸增多，測定靈芝三萜含量的方法主要分為分光光度法和液相色譜法：液相色譜法準(zhǔn)確度高，但需要大量的高純度三萜類化合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，要分離獲得高純度具有代表性的三萜化合物對照品技術(shù)難度很大；分光光度法準(zhǔn)確度雖不如液相色譜法，但能以目前自然界廣泛存在的三萜化合物熊果酸、齊墩果酸作為對照品。目前破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y定基本采用分光光度法。
現(xiàn)有的破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪康姆止夤舛确椒ㄖT多條件存在不明確的問題：《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（2020年版）中使用了離心，但是并未明確離心的條件；《保健食品功效成分檢測方法》一書中針對總?cè)坪繙y試方法的描述有，樣品提取后溶液渾濁可過濾等[12]，但并未定義如何判斷渾濁。因破壁靈芝孢子粉極易產(chǎn)生懸浮，相關(guān)測試條件不明確將導(dǎo)致測試結(jié)果不準(zhǔn)確、重現(xiàn)性差等問題。破壁靈芝孢子粉中總?cè)频臏?zhǔn)確測定現(xiàn)為業(yè)內(nèi)公認(rèn)的技術(shù)難點(diǎn)，因此急需對測試方法進(jìn)行優(yōu)化，明確測試條件并驗(yàn)證方法的可靠性。
本研究使用分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪浚ㄟ^對方法中揮干方式、除雜方式、水浴條件等進(jìn)行優(yōu)化，對所確立的方法線性范圍、檢出限與定量限、專屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、耐用性等進(jìn)行評價(jià)，驗(yàn)證本方法的適用性、可靠性及優(yōu)越性，為食品分析、檢測以及質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度94.7%，CAS號77-52-1），BePure；乙酸乙酯、冰乙酸（分析純），天津大茂試劑廠；三氯甲烷（分析純），廣州試劑廠；高氯酸（優(yōu)級純），成都市科隆公司；香草醛（分析純），天津科密歐公司。
1.2 儀器與設(shè)備
UV-1800光度計(jì)（SHIMADZU）；ME204E、ME155DU分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；恒溫水浴鍋（常州普天公司）；XWDS-1018ST超聲波清洗器（東莞市萬德盛自動(dòng)化設(shè)備公司）；L-530離心機(jī)（湖南湘儀）。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 溶液配制
熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100 μg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg至100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯超聲溶解，定容，搖勻。
香草醛-冰乙酸溶液（50 mg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取香草醛5.0 g，加冰乙酸使溶解并定容至100 mL，即得。臨用前配制。
1.3.2 試樣制備
準(zhǔn)確稱定試樣0.1 g（相當(dāng)于總?cè)瀑|(zhì)量為0.5～5.0 mg），置于50 mL容量瓶，加三氯甲烷約30 mL，50 kHz超聲處理30 min，0 ℃水浴冷卻，加三氯甲烷定容，混勻，轉(zhuǎn)移靜置30 min，4 000 r·min-1離心10 min，移取上清液測用。
1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確移取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL和1.00 mL于比色管中，沸水浴揮干，冷卻后精密加入0.40 mL香草醛-冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動(dòng)比色管使殘?jiān)芙?，再?zhǔn)確加入1.0 mL高氯酸，混勻后放置60 ℃水浴中反應(yīng)15 min，取出，0 ℃冰浴冷卻，精密加入冰乙酸5.0 mL搖勻，15 min后轉(zhuǎn)移至比色皿中，在548 nm波長測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.4 試樣溶液的測定
精密量取試樣上清液1.0 mL置10 mL比色管中，沸水浴揮干，冷卻后精密加入0.4 mL香草醛-冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動(dòng)比色管使殘?jiān)芙?，再?zhǔn)確加入1.0 mL高氯酸，混勻后放置60 ℃水浴中反應(yīng)15 min，取出，0 ℃冰浴冷卻，精密加入冰乙酸5.0 mL搖勻，15 min后轉(zhuǎn)移至比色皿中，在548 nm波長測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中總?cè)频暮俊?/p>
1.3.5 數(shù)據(jù)處理
試樣中總?cè)疲ㄒ孕芄嵊?jì)）含量按公式（1）計(jì)算。
式中：X為試樣中總?cè)疲ㄒ孕芄嵊?jì)）含量，g/100 g；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣液中熊果酸質(zhì)量，μg；m為試樣質(zhì)量，g；V1為試樣三氯甲烷定容總體積，mL；V2為移取試樣上清液體積，mL。
2 結(jié)果與分析
2.1 測定波長的選擇
取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和破壁靈芝孢子粉三萜提取溶液，經(jīng)香草醛-冰乙酸和高氯酸顯色后，在450～700 nm掃描，獲得吸光度曲線見圖1。由圖1可知，在548 nm波長處熊果酸有最大吸收，在550 nm處破壁靈芝孢子粉三萜有最大吸收，兩者最大吸收波長基本一致，符合《中華人民共和國藥典》（2020版）最大波長允許誤差范圍要求，故確定548 nm為測定波長。
2.2 靈芝制品的選擇
選擇不同類型的靈芝制品（破壁靈芝孢子粉、靈芝孢子油、靈芝孢子油軟膠囊），按照《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（2020年版）中規(guī)定的方法進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。通過測試結(jié)果可以看出，破壁靈芝孢子粉的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）較大，且與理論值偏差較大，故選擇破壁靈芝孢子粉作為進(jìn)一步優(yōu)化研究基質(zhì)。
2.3 條件優(yōu)化
2.3.1 除雜方式的考察
在樣品制備階段，除雜方式可分為濾紙過濾、0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾、4 000 r·min-1離心（分別設(shè)置離心時(shí)間5 min、10 min、20 min）3種。表2結(jié)果表明，3種方式的結(jié)果都比較穩(wěn)定，濾紙過濾和0.45 μm有機(jī)濾膜過濾的測試結(jié)果與理論結(jié)果有一定的偏差，離心方式的測試結(jié)果更接近理論值。在離心時(shí)間的選擇方面，不同離心時(shí)間狀態(tài)如圖2所示，離心10 min后上清液澄清無肉眼可見懸浮顆粒。因此，選擇4 000 r·min-1離心10 min作為除雜方式進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.2 揮干方式的考察
在樣品測定階段，揮干方式可分為沸水浴揮干、105 ℃烘箱烘干、60 ℃水浴蒸干、氮?dú)獯蹈?種方式，表3結(jié)果表明：沸水浴揮干方式RSD為1.05%，結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性比其他方式更好。后續(xù)選擇沸水浴揮干進(jìn)行試驗(yàn)。
2.3.3 水浴條件的考察
樣品測定階段，分別在60 ℃+10 min、60 ℃+15 min、60 ℃+45 min、65 ℃+15 min和70 ℃+15 min 5種條件組合下，考察反應(yīng)溫度和時(shí)間對測試結(jié)果的影響（表4）?？梢园l(fā)現(xiàn)，測定值與水浴溫度和水浴時(shí)間呈正相關(guān)：溫度控制在60 ℃不變時(shí)，隨水浴時(shí)間增長測試結(jié)果變大；當(dāng)水浴時(shí)間均控制在15 min時(shí)，隨著水浴溫度升高測試結(jié)果變大。結(jié)果表明，60 ℃+15 min條件下測試結(jié)果與理論值更接近，偏差最小，因此選擇此水浴條件。
2.4 方法驗(yàn)證
2.4.1 線性范圍驗(yàn)證
分別精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液按1.3.3操作測定吸光值，如圖3所示，以熊果酸的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光值縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.008 07X-0.022 14，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，結(jié)果表明熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在20～160 μg范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。
2.4.2 檢出限和定量限考察
通過分析20個(gè)獨(dú)立試劑空白來計(jì)算方法檢測限，通過計(jì)算得，標(biāo)準(zhǔn)偏差Sd=0.002 104 μg，檢出限L’=3×Sd/b=0.782 2 μg（b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，0.008 07），此時(shí)檢出限L對應(yīng)試樣濃度為0.120 3 μg·mL-1，因此定量限=3×L=0.361 0 μg·mL-1。
2.4.3 專屬性實(shí)驗(yàn)
按照樣品的組分特點(diǎn)，采用羥丙基纖維素和葡萄糖混合（8∶2，m/m）配制陰性樣品，同時(shí)做試劑空白，比較兩組數(shù)據(jù)可知，空白溶液與陰性樣品均無吸收，專屬性良好。
2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)
選取一款靈芝孢子粉精密稱取0.1 g，平行稱取6份按1.3.2方法進(jìn)行樣品處理，按2.3方法優(yōu)化的條件進(jìn)行重復(fù)性測試。測試結(jié)果如表5所示，樣品中總?cè)破骄繛?.36 g/100 g，RSD為0.06%，方法重復(fù)性良好。
2.4.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)
精密稱取重復(fù)性試驗(yàn)環(huán)節(jié)靈芝孢子粉樣品0.1 g，加入低、中、高3個(gè)濃度水平的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，考察方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果如表6所示，回收率在93.12%～97.73%，RSD在0.13%～0.64%，精密度和準(zhǔn)確性良好。
3 結(jié)論
由于現(xiàn)有方法中測試條件不明確，導(dǎo)致破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y試結(jié)果準(zhǔn)確度低、穩(wěn)定性差。本研究通過對方法中揮干方式、提取液除雜方式及水浴反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，確立破壁靈芝孢子粉總?cè)茰y試的最佳條件中揮干方式為沸水浴揮干、除雜方式為4 000 r·min-1離心10 min、水浴條件為60 ℃反應(yīng)15 min。進(jìn)一步對方法線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確性、專屬性及重復(fù)性等進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法測試結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
綜合來看，該方法操作簡便，設(shè)備易得，耗時(shí)少，檢測效率高，適用于破壁靈芝孢子粉中總?cè)坪繙y定，能夠?yàn)殪`芝制品中功效成分含量準(zhǔn)確測定提供有力技術(shù)手段，為保健食品企業(yè)檢測技術(shù)提升和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。
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作者簡介：謝林云（1983—），男，湖南永州人，碩士，工程師。研究方向：保健食品、營養(yǎng)成分檢測技術(shù)。
