農(nóng)村飲用水菌落總數(shù)的測(cè)量不確定度評(píng)定

摘 要：目的：對(duì)農(nóng)村飲用水菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定。方法：采集農(nóng)村飲用水，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)水樣菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)，按照國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范相關(guān)方法，分析菌落總數(shù)的不確定度來(lái)源，并評(píng)定菌落總數(shù)的測(cè)量不確定度。結(jié)果：重復(fù)測(cè)定和培養(yǎng)基配制引入的不確定度貢獻(xiàn)較大，其次是樣品吸取和稀釋體積引入的不確定度；計(jì)算得出擴(kuò)展不確定結(jié)果為0.015 4，基于該不確定度值計(jì)算農(nóng)村城郊和山區(qū)4種水源水（溪水、地下水、水庫(kù)水和河水）的菌落總數(shù)，獲得檢測(cè)結(jié)果為170～380 CFU·mL-1，均低于500 CFU·mL-1，符合《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749—2022）要求。

關(guān)鍵詞：農(nóng)村飲用水；菌落總數(shù)；不確定度評(píng)定

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of the total number of bacterial colonies in rural drinking water sources. Method： Rural drinking water was collected， and the total number of colonies in water samples was detected and counted by plate counting method. According to the relevant methods of the national technical specification for measurement， the sources of uncertainty of the total number of colonies were analyzed， and the measurement uncertainty of the total number of colonies was evaluated. Result： The uncertainty introduced by repeat assay and medium preparation contributed the most， followed by the uncertainty introduced by sample uptake and dilution volume. The calculated extended uncertainty result was 0.015 4. Based on this uncertainty value， the total number of colonies in four source waters （streams， groundwater， reservoir water and river water） in rural suburbs and mountain areas was calculated， the detected results were 170～380 CFU·mL-1， all of which are lower than 500 CFU·mL-1， meeting the requirements of GB 5749—2022.

Keywords： rural drinking water; total number of colonies; uncertainty assessment

水是生命的源泉，是人們生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。水體中微生物指標(biāo)超標(biāo)易引發(fā)傳染性腸道疾病[1]。近年來(lái)，微生物污染生活飲用水所致的突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)有發(fā)生，引起社會(huì)各界的高度關(guān)注。很多國(guó)家的飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，將微生物指標(biāo)放在第一位進(jìn)行監(jiān)測(cè)[2]。大部分山區(qū)農(nóng)村飲用水仍以溪水、水庫(kù)水、河水、地下水為主，其微生物超標(biāo)現(xiàn)象較為常見(jiàn)[3]。因此，加強(qiáng)農(nóng)村飲用水微生物檢測(cè)至關(guān)重要。測(cè)量不確定度可為評(píng)定檢測(cè)結(jié)果的可信度、質(zhì)量提供有效的手段。鑒于此，在農(nóng)村飲用水微生物檢測(cè)過(guò)程中，有必要對(duì)其進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

于2023年4月分別在湖南省邵陽(yáng)市新邵縣城郊（新田鋪鎮(zhèn)）和山區(qū)（迎光鄉(xiāng)）采集溪水、地下水、河水、水庫(kù)水等4種水源水。按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 第2部分：水樣的采集與保存》（GB/T 5750.2—2023）進(jìn)行樣品采集，每種水源水采集混合樣品后分裝成2份，共8份水樣。

1.2 儀器與試劑

生化培養(yǎng)箱（DHP-9162），北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2D），蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；電子天平（Scout SE-SE202F），奧豪斯儀器（常州）有限公司。

蒸餾水、無(wú)菌生理鹽水、乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

菌落總數(shù)因與水體有機(jī)物污染密切相關(guān)，成為評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物污染的重要指標(biāo)之一，因此本研究重點(diǎn)檢測(cè)農(nóng)村飲用水中的菌落總數(shù)。8份水樣均分別進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定，選擇其中1份水樣進(jìn)行同一檢測(cè)人員的10次重復(fù)測(cè)定，用于不確定度的重復(fù)測(cè)定分析。所有水樣中菌落總數(shù)嚴(yán)格按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 第12部分：微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2023）的要求進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)步驟如下。

（1）無(wú)菌耗材準(zhǔn)備。按照GB/T 5750.12—2023中營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制方法稱量各試劑，用蒸餾水稀釋溶解后調(diào)節(jié)pH值為7.4～7.6后，置于高壓滅菌鍋內(nèi)高壓滅菌；將若干支準(zhǔn)備好的1 mL和10 mL試管、移液管、移液槍頭及適量生理鹽水置于高壓滅菌鍋內(nèi)高壓滅菌，設(shè)置參數(shù)為121 ℃、30 min。

（2）樣品稀釋。用10 mL試管移取9 mL無(wú)菌生理鹽水注入準(zhǔn)備好的試管，以無(wú)菌操作方法用移液器吸取1 mL充分混勻的農(nóng)村飲用水水樣注入上述試管中，混勻成1∶10（體積比）稀釋液。再用移液器吸取1∶10（體積比）的稀釋液1 mL注入另一個(gè)9 mL無(wú)菌生理鹽水試管中，混勻成1∶100（體積比）稀釋液。按上述方法繼續(xù)稀釋成1∶1 000（體積比）稀釋液體備用。

（3）樣品接種。以無(wú)菌操作方法用移液器吸取上述3個(gè)濃度的稀釋液水樣1 mL，分別注入無(wú)菌平皿內(nèi)，再注入約15 mL已融化并冷卻到45 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻，每個(gè)梯度水樣均做一組平行接種，并做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

（4）樣品培養(yǎng)。待平皿內(nèi)培養(yǎng)基冷卻凝固后，將其翻轉(zhuǎn)使底面向上，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（48±2）h。

（5）菌落計(jì)數(shù)與結(jié)果報(bào)告。培養(yǎng)結(jié)束后選擇平均菌落數(shù)在30～300 CFU·mL-1的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照GB/T 5750.12—2023稀釋度選擇及菌落總數(shù)報(bào)告方式表格中的方法進(jìn)行報(bào)告。

1.4 數(shù)學(xué)模型建立

農(nóng)村飲用水中菌落總數(shù)的計(jì)算公式為

式中：A為樣品中菌落總數(shù)，CFU·mL-1；N為平皿內(nèi)菌落總數(shù)，CFU·mL-1；fn為該平皿樣品的稀釋倍數(shù)。

1.5 農(nóng)村飲用水中菌落總數(shù)判斷依據(jù)

根據(jù)擴(kuò)展不確定度值獲得8份水樣的菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果，依據(jù)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749—2022）中小型集中式供水和分散式供水水源水要求進(jìn)行判斷，其菌落總數(shù)限值為500 CFU·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

按照《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012），對(duì)檢測(cè)過(guò)程中各類不確定來(lái)源進(jìn)行綜合分析。本文重點(diǎn)對(duì)水樣菌落總數(shù)檢測(cè)過(guò)程中樣品稀釋體積、樣品吸取體積、培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件和重復(fù)測(cè)定結(jié)果等不確定度分量進(jìn)行分析評(píng)定。

2.2 不確定分量評(píng)定

2.2.1 樣品稀釋體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V1）

樣品稀釋體積引入的不確定度屬于B類不確定度。本文以無(wú)菌操作吸取每份樣品1 mL，用9 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，混勻后即得10-1稀釋液，再依次逐級(jí)稀釋為10-2和10-3稀釋液，因此需要用到1 mL移液管3次、10 mL移液管3次，由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分析如下。

（1）移液管容量允差引起的不確定度。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）中計(jì)量檢定容量允差d分別為0.007 mL（單標(biāo)）和0.05 mL（分度），按矩形分布，k=，則1 mL和10 mL移液管容量允差引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

（2）移液管隨機(jī)變化引起的不確定度。用移液管連續(xù)10次吸取刻度用超純水，用萬(wàn)分之一天平稱量后按貝塞爾公式計(jì)算出1 mL和10 mL移液管隨機(jī)變化引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

（3）移液管中水溫波動(dòng)引起的不確定度。實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度為（20+4）℃，校正環(huán)境溫度為20 ℃，水溫的最大波動(dòng)為4 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，

按矩形分布，k=，則1 mL和10 mL移液管中水溫波動(dòng)引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

故樣品稀釋中由1 mL和10 mL移液管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

樣品稀釋中由1 mL和10 mL移液管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則樣品稀釋體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 樣品吸取體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V2）

樣品吸取體積引入的不確定度屬于B類不確定度。本文每個(gè)稀釋液接種1 mL至普通瓊脂培養(yǎng)平皿中，并做1個(gè)平行，同時(shí)用生理鹽水做空白對(duì)照，因此需要用到1 mL移液管2次，那么樣品吸取體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 培養(yǎng)基配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（W）

培養(yǎng)基配制引入的不確定度屬于B類不確定度。本文根據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 第12部分：微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2023）方法，需要稱取蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂，用量筒量取1 000 mL蒸餾水進(jìn)行溶解，配制普通瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制不確定度來(lái)源于天平校正產(chǎn)生的不確定度及量取蒸餾水產(chǎn)生的不確定度，具體見(jiàn)表1。其中，電子天平校正證書(shū)擴(kuò)展不確定度（允差）U=0.05 g根據(jù)表1計(jì)算得出培養(yǎng)基配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 培養(yǎng)條件和重復(fù)測(cè)定結(jié)果引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）

因培養(yǎng)條件包含在重復(fù)測(cè)定中，不再單獨(dú)評(píng)定，只評(píng)定重復(fù)測(cè)定結(jié)果，而重復(fù)測(cè)定結(jié)果引入的不確定度屬于A類不確定度。同一水樣重復(fù)測(cè)定10次，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2計(jì)算得出殘差平方和為"根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算出培養(yǎng)條件和重復(fù)測(cè)定結(jié)果引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則培養(yǎng)條件和重復(fù)測(cè)定結(jié)果引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)2.2中各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果，獲得相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果為

2.4 擴(kuò)展不確定度及測(cè)定結(jié)果報(bào)告

對(duì)上述10個(gè)重復(fù)水樣進(jìn)行菌落總數(shù)分析，自由度為n-1=9，取包含因子k=2（置信概率近似95%），則擴(kuò)展不確定度為

因此，10個(gè)重復(fù)測(cè)定水樣的菌落總數(shù)取對(duì)數(shù)的結(jié)果報(bào)告為

取反對(duì)數(shù)后，10個(gè)重復(fù)測(cè)定水樣的菌落總數(shù)結(jié)果報(bào)告為280～320 CFU·mL-1。

2.5 農(nóng)村飲用水中菌落總數(shù)結(jié)果分析

對(duì)城郊和山區(qū)4種中小型集中式供水和分散式供水水源（包括溪水、地下水、水庫(kù)水和河水）進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，根據(jù)擴(kuò)展不確定度值計(jì)算獲得8份水樣的菌落總數(shù)結(jié)果為170～380 CFU·mL-1，均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的500 CFU·mL-1，符合GB 5749—2022要求（表3）。山區(qū)水源中，水庫(kù)水菌落總數(shù)最多，其次分別是溪水、河水和地下水；城郊水源中，河水菌落總數(shù)最多，其次分別為溪水、地下水和水庫(kù)水。

3 討論與結(jié)論

本文對(duì)農(nóng)村飲用水菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定，并根據(jù)擴(kuò)展不確定度值計(jì)算8份農(nóng)村飲用水菌落總數(shù)，得出菌落總數(shù)為170～380 CFU·mL-1，均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的500 CFU·mL-1，符合GB 5749—2022要求，且其不確定度值符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求[4]。對(duì)比分析各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定值發(fā)現(xiàn)，重復(fù)測(cè)定和培養(yǎng)基配制引入的不確定度貢獻(xiàn)較大，其次是樣品稀釋體積和樣品吸取體積引入的不確定度。蔡曉霞等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在食品中菌落總數(shù)測(cè)定中，樣品重復(fù)測(cè)定對(duì)測(cè)量不確定度貢獻(xiàn)最大，與本研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果可為今后進(jìn)一步規(guī)范農(nóng)村飲用水菌落總數(shù)檢測(cè)步驟，減少實(shí)驗(yàn)誤差，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低結(jié)果的誤判風(fēng)險(xiǎn)提供可靠依據(jù)。

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