連樸飲基準(zhǔn)樣品高效液相色譜指紋圖譜建立及化學(xué)成分鑒定

關(guān)鍵詞 連樸飲；聚類分析；高效液相色譜指紋圖譜；超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜；主成分分析；正交偏最小二乘法-判別分析

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-0518（2024）06-0813-17

連樸飲（Lianpo decoction， LPD）出自清代王孟英的《隨息居重訂霍亂論》，為治療脾胃濕熱癥的經(jīng)典名方之一［1-2］。連樸飲有清熱祛濕、理氣和中的功效［3］，原文“制厚樸二錢、川連（姜汁炒）、石菖蒲、制半夏各一錢、香豉（炒）、焦梔各三錢、蘆根二兩”，其藥雖少，但方劑組合合理，藥效精確，治療效果顯著?，F(xiàn)代臨床中常用于治療胃腸功能紊亂、急慢性腸胃炎和功能性消化不良等疾?。?］。

黃連、厚樸共為君藥，黃連清熱燥濕［5］，厚樸行氣化濕［6］。石菖蒲、半夏共為臣藥，石菖蒲芳香化濕、悅脾，半夏則能燥濕降逆、和胃。此外，焦梔子、淡豆豉和蘆根同為佐藥，焦梔子和淡豆豉可以清宣胸膈的熱結(jié)癥狀，而蘆根則能清熱和胃、生津行水。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，LPD含有多種生物堿、酚類和環(huán)烯醚萜類化學(xué)物質(zhì)，具有抗菌、抗炎、抗氧化和降低血糖等功效［7-8］。目前，關(guān)于LPD化學(xué)成分的報(bào)道多集中在各單味藥材上，而對(duì)復(fù)方整體研究則較少。李家奇等［9］對(duì)不同產(chǎn)地及樹齡厚樸姜炙前后的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)厚樸中主要化學(xué)成分為木脂素、酚苷、苯乙醇苷及生物堿類化合物。穆成林等［10］對(duì)姜黃連進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究，建立姜黃連的指紋圖譜，黃連中含有多種化學(xué)成分，如生物堿、香豆素、有機(jī)酸、甾體和黃酮等［11］。張景等［12］采用超高效液相色譜對(duì)11批淡豆豉進(jìn)行分析，并結(jié)合聚類分析軟件，得到大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、黃豆苷元、黃豆黃素和染料木素等10個(gè)共有峰，以期用于淡豆豉的質(zhì)量控制。梔子主要含有環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類和黃酮類等化合物，雷磊等［13］對(duì)梔子炮制前后的化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)炮制后并未產(chǎn)生新的化合物。石菖蒲的主要藥理成分是β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚，為揮發(fā)性成分，馬莎莎［14］對(duì)石菖蒲及其易混淆品采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行化學(xué)成分比較，并建立石菖蒲指紋圖譜。蘆根主要含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪類、糖類、維生素和甾酮等多種成分［15］。法半夏含有的化學(xué)成分有生物堿類、甾醇類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、氨基酸和半夏蛋白等［16］，具有抗炎、抗腫瘤等作用。

物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的核心，但通過特征圖譜或指標(biāo)成分的含量檢測(cè)的單一分析方法，很難反映其科學(xué)、全面的質(zhì)控體系。液相色譜法以其高靈敏度、高分辨率和高效等特點(diǎn)，在中藥復(fù)方化學(xué)成分分析方面得到了廣泛的應(yīng)用［17］。目前，關(guān)于LPD的質(zhì)量控制研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少，本研究基于文獻(xiàn)［18-19］后，在確定遵古制備工藝的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)組合的方法制備了15批LPD物質(zhì)基準(zhǔn)樣品。建立基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)、聚類分析和主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別方法，以及借助高分辨質(zhì)譜鑒定出主要的化學(xué)成分，為L(zhǎng)PD的質(zhì)量控制和制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1. 1儀器和試劑

Thermo Vanquish型超高效液相色譜（UPLC，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Q-Exactive HF型組合型四級(jí)桿Orbitrap質(zhì)譜儀（MS，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；LC2030型高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）；AB135-S型十萬分之一電子分析天平（德國(guó)梅特勒-托利多公司）；2-4LS-Cplus型真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Epsilon公司）；KQ-250B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；FMD-30A型陶瓷煎藥壺（潮州市潮安區(qū)金石鎮(zhèn)富美達(dá)電器廠）。

梔子苷（批號(hào)：B21661，純度≥98%）、染料木素（批號(hào)：B21039，純度≥98%）、和厚樸酚（批號(hào)：B20498，純度≥98%）、厚樸酚（批號(hào)：B20511，純度≥98%）、表小檗堿（批號(hào)：B20108，純度≥98%），購于源葉生物技術(shù)有限公司；鹽酸黃連堿（批號(hào)：112026-201802，純度≥94. 0%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-202015，純度≥91. 0%）、鹽酸巴馬汀（批號(hào)：110732-201913，純度85. 7%），購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)Merck KGaA公司）；磷酸（分析級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司）；甲酸（色譜級(jí)，西亞試劑公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。15批姜厚樸、姜黃連、焦梔子、法半夏、炒淡豆豉、石菖蒲和蘆根分別購自長(zhǎng)春北京同仁堂有限公司、吉林大藥房、長(zhǎng)春仁民醫(yī)藥連鎖有限公司、長(zhǎng)春福百草大藥房、吉林省同仁大藥房和長(zhǎng)春恒愛大藥房，根據(jù)各個(gè)藥房藥材包裝產(chǎn)地及批號(hào)信息顯示，7種連樸飲中的藥材飲片均源自道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)，由中藥鑒定與炮制教研室主任翁麗麗教授（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院）鑒定，姜厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd. etWils. 干燥干皮、根皮及枝皮的炮制品姜厚樸，姜黃連為毛茛科黃連屬植物黃連Coptis chinensis Franch.干燥根莖的炮制品姜黃連，焦梔子為茜草科梔子屬植物枙子Gardenia jasminoides Ellis 干燥果實(shí)種子的炮制品焦梔子，法半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（ Thunb.） Breit. 干燥塊莖的炮制品法半夏，炒淡豆豉為豆科植物大豆Glycine max（L.） Merr. 干燥成熟種子（黑豆）的發(fā)酵加工品的炮制品炒淡豆豉，石菖蒲為天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott 的干燥根莖，蘆根為禾本科植物蘆葦Phragmitescommunis Trin. 的新鮮或干燥根莖。按照2020版《中國(guó)藥典》各項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均符合要求，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法對(duì)7種藥材飲片的不同批次進(jìn)行隨機(jī)分組為15批LPD樣品，具體組合信息見表1。

1. 2 LPD物質(zhì)基準(zhǔn)制備

連樸飲出自《隨息居重訂霍亂論》，原文給出了明確劑量，但煎煮方式未給出。因此，樣品參照2009年版《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行煎煮［20］。參考《中國(guó)歷代度量衡值表》——來自《中國(guó)科學(xué)技術(shù)史-度量衡卷》（丘光明，2001）中的附錄，以及顏文強(qiáng)研究的《中國(guó)歷代度量衡換算簡(jiǎn)表》，清代“一兩等于37. 3 g，一錢等于3. 73 g”，分別稱取姜厚樸7. 5 g，姜黃連、法半夏和石菖蒲各稱取3. 7 g，炒淡豆豉和焦梔子各稱取11. 2 g，蘆根75. 0 g，共計(jì)116 g加藥材總克數(shù)8倍量水浸泡30 min，第1次加熱煮沸20 min，趁熱用150 μm篩過濾，再將藥渣加6倍量水進(jìn)行第2次加熱煮沸15 min，趁熱用150 μm篩過濾藥渣，合并兩次濾液。將濾液置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干處理72 h，即得連樸飲基準(zhǔn)樣品（凍干粉）。按表1飲片對(duì)應(yīng)制備15批LPD物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉（S1－S15）。按照相同的方法分別制備姜厚樸、姜黃連、炒淡豆豉、焦梔子、法半夏、石菖蒲和蘆根對(duì)應(yīng)藥材的陰性對(duì)照溶液及各單味藥對(duì)照溶液。

1. 3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取和厚樸酚、厚樸酚、表小檗堿、鹽酸小檗堿、梔子苷、染料木素、鹽酸巴馬汀和鹽酸黃連堿對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為41. 3、24. 4、9. 7、11. 8、18. 9、4. 5、10. 4和11. 2 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1. 4 供試品溶液的制備

取0. 5 g凍干粉置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min（500 W功率、40 Hz頻率），放冷，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液過0. 22 μm微孔濾膜，即得。

1. 5 液相色譜條件

色譜柱為Welch Ultimate?XB-C18柱（250 mm×4. 6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相為甲醇-0. 1%磷酸水溶液； 采用梯度洗脫： 0～25 min，20%～30%甲醇； 25～40 min，30%～35%甲醇； 40～55 min，35%～40%甲醇； 55～60 min，40%～43% 甲醇； 60～75 min，43%～45% 甲醇； 75～85 min，45%～50% 甲醇； 85～95 min，50%～70% 甲醇；95～110 min，70%～75%甲醇； 110～116 min，75%甲醇； 116～117 min，75%～20%甲醇； 117～120 min，20%甲醇； 指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm； 柱溫30 ℃； 體積流量為1 mL/min； 進(jìn)樣體積10 μL。

1. 6 超高效液相色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱為Zorbax Eclipse C18柱（ 100 mm×2. 1 mm，1. 8 μm）； 流動(dòng)相為乙腈-0. 1%甲酸溶液，梯度洗脫（0～2 min，5%乙腈； 2～6 min，5%～30%乙腈； 6～7 min，30%乙腈； 7～12 min，30%～78%乙腈； 12～14 min，78%乙腈； 14～17 min，78%～95%乙腈； 17～20 min，95%乙腈； 20～21 min，90%～5%乙腈； 21～25 min，5%乙腈）； 流速為0. 3 mL/min； 柱溫為30 ℃； 進(jìn)樣量為2 μL。

采用電噴霧離子源，正、負(fù)離子掃描模式，噴霧電壓為3. 5 kV（+）、3. 5 kV（?），鞘氣流速45 mL/min，輔助氣流速15 mL/min，離子傳輸管溫度330 ℃。采集方式： 全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（Full MS/ddMS2，TopN： 5），一級(jí)質(zhì)譜分辨率： 120000，掃描范圍： 100～1500（m/z）； 二級(jí)質(zhì)譜分辨率： 60000； 碰撞模式為高能量碰撞解離（HCD），碰撞能量（Normalized collision energy， NCE）： 12. 5、25和35。

2 結(jié)果與討論

2. 1 LPD 物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜

2. 1. 1 方法學(xué)考察

2.1.1.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一S6樣品，按1. 4小節(jié)制備供試品溶液，在1. 5小節(jié)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，并以分離度好且保留時(shí)間適中的11號(hào)峰（鹽酸小檗堿）為參照峰，測(cè)得各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0. 21%，相對(duì)峰面積的RSD均小于4. 55%，表明儀器精密度良好。

2.1.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取S6物質(zhì)基準(zhǔn)樣品按1. 4小節(jié)制備供試品溶液，按1. 5小節(jié)色譜條件，分別在0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣，依法測(cè)定，將11號(hào)峰（即鹽酸小檗堿）作為參照峰進(jìn)行比對(duì)。對(duì)每個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于0. 24%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于4. 42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取S6物質(zhì)基準(zhǔn)樣品按1. 4小節(jié)制備供試品溶液，共6份，按1. 5小節(jié)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以11號(hào)峰（鹽酸小檗堿）為參照峰，分別計(jì)算出每個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0. 18%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3. 98%，表明該方法重復(fù)性較好。

2. 1. 2 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

按1. 4小節(jié)制備供試品溶液，按1. 5小節(jié)下色譜條件測(cè)定，記錄15個(gè)批次連樸飲基準(zhǔn)樣品色譜圖。將上述色譜數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（2012版），基于S6色譜圖作為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，同時(shí)設(shè)定時(shí)間窗寬度為0. 1，自動(dòng)匹配Mark峰及峰多點(diǎn)校正，生成全部批次樣品的疊加圖（圖1），共標(biāo)定了23個(gè)共有峰，通過對(duì)比混合對(duì)照品的色譜采集結(jié)果（圖2），可鑒定出其中8個(gè)色譜峰，分別為3號(hào)峰梔子苷、7號(hào)峰表小檗堿、8號(hào)峰鹽酸黃連堿、11號(hào)峰鹽酸小檗堿、12號(hào)峰鹽酸巴馬汀、19號(hào)峰染料木素、21號(hào)峰和厚樸酚和22號(hào)峰厚樸酚。15批基準(zhǔn)樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均高于0. 9，詳細(xì)信息參見表2，結(jié)果表明，15批連樸飲基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜相似度良好。這說明不同批次、不同產(chǎn)地供試品之間的主要物質(zhì)群差別相對(duì)小，制備工藝較為穩(wěn)定。

2. 1. 3 共有峰歸屬

取各單味藥和各陰性溶液對(duì)照液（S6中各批次單味藥及陰性樣品），基于1. 5小節(jié)的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。將這些色譜峰的保留時(shí)間與23個(gè)共有峰進(jìn)行了對(duì)比研究，對(duì)比結(jié)果如圖3所示： 1、3（梔子苷）、4、13、14、15、16、17、20和23號(hào)峰來自佐藥焦梔子； 7（表小檗堿）、8（鹽酸黃連堿）、10、11（鹽酸小檗堿）、12（鹽酸巴馬?。┖?0號(hào)峰來自君藥姜黃連； 2、5、9、17、18和19號(hào)峰（染料木素）來自佐藥炒淡豆豉；2、6、20、21（和厚樸酚）和22號(hào)峰（厚樸酚）來自君藥姜厚樸； 2、10、15和16號(hào)峰來自佐藥蘆根； 2、4和6號(hào)峰來自臣藥石菖蒲，能夠說明連樸飲指紋圖譜所含物質(zhì)的代表性。

2. 2 化學(xué)模式識(shí)別分析

采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)所得多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，包括聚類分析（Cluster analysis， CA）、主成分分析（Principal components analysis， PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial leastsquares discrimination analysis， OPLS-DA），以進(jìn)一步探討連樸飲物質(zhì)基準(zhǔn)樣品批次間的差異。

2. 2. 1 聚類分析

采用SPSS 26. 0軟件對(duì)聚類分析進(jìn)行處理，以15批連樸飲基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的23個(gè)共有峰面積為變量。采用了歐氏平方距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，來實(shí)現(xiàn)組間聯(lián)接，具體結(jié)果參見圖4。當(dāng)類間距為5時(shí)，可以將樣本分為以下3個(gè)類別，分別是第1類： 樣品S11?S13號(hào)； 第2類： S2、S5、S6、S9和S15號(hào)樣品；第3類： 其余樣品。結(jié)果表明，不同批次連樸飲樣品凍干粉相對(duì)峰面積有略微的差異，可能主要與原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)和批間質(zhì)量差異有關(guān)。

2. 2. 2 主成分分析

利用SPSS 26. 0軟件，根據(jù)特征值和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率，對(duì)15批次的連樸飲樣品進(jìn)行了主成分分析。根據(jù)特征值和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率的計(jì)算結(jié)果，如表3所示，篩選出了那些特征值大于1的主要成分。這些主要成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了93. 24%，表明15批連樸飲指紋圖譜篩選的23個(gè)共有峰可代表連樸飲整體化學(xué)成分信息。通過這一分析方法，可以更加準(zhǔn)確地了解連樸飲樣品的關(guān)鍵成分，為進(jìn)一步研究提供了有力的支持。

表4所示為主成分因子載荷矩陣的結(jié)果，根據(jù)各色譜峰在4個(gè)主成分上的載荷值，可提取出每個(gè)主成分所反映的信息。第1主成分包含： 來自1、4、7、8、10、11、12、18和19號(hào)色譜峰的色譜峰信息，主要與姜厚樸、姜黃連、焦梔子、炒淡豆豉和石菖蒲中的成分相關(guān)； 第2主成分包括來自3、5、6、9、14、15、16、17和20號(hào)色譜峰的色譜峰信息，主要與姜厚樸、炒淡豆豉、焦梔子、石菖蒲和蘆根中的成分有關(guān)； 第3主成分包括來自2、21、22和23號(hào)色譜峰的色譜峰信息； 第4主成分包括來自13號(hào)色譜峰的色譜峰信息，主成分3和4主要與姜厚樸、焦梔子中的成分相關(guān)。根據(jù)主成分分析結(jié)果，可以得到15批連樸飲基準(zhǔn)樣品的主成分得分。

（系數(shù)為相應(yīng)的主成分因子載荷值與特征值開平方后的比值）計(jì)算4個(gè)主成分（F₁?F₄）的得分，再根據(jù)公式F=0. 400F₁+0. 377F₂+0. 171F₃+0. 052F₄計(jì)算15批連樸飲基準(zhǔn)樣品的綜合評(píng)分（F），并進(jìn)行排序，結(jié)果見表5。主成分分析綜合得分結(jié)果顯示，S2、S5、S6、S9和S15位于排名前5位，S13、S3、S12、S8和S11排名居中，S10、S7、S4、S1和S14位于排名后5位。主成分分析綜合評(píng)分越高，表明該樣品的綜合質(zhì)量越好，依此來評(píng)價(jià)不同批次樣品質(zhì)量的優(yōu)劣。經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)各批次樣品之間的藥材成分存在一定差異，說明連樸飲基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜可能與其組成藥材的來源和產(chǎn)地有關(guān)。

基于SIMCA 14. 1軟件，分析15批連樸飲基準(zhǔn)樣品的主要成分，相關(guān)分析結(jié)果如圖5所示。第1類樣品編號(hào)為S2、S5、S6、S9和S15號(hào)； 第2類： S11?S13，其它樣品均歸為第3類，該結(jié)果與聚類分析結(jié)果相符。這說明藥材來源不同，其所含化學(xué)成分含量也有一定區(qū)別。

2. 2. 3 正交偏最小二乘法分析

為分析批次樣品之間的差異，將所測(cè)的15批樣品中的23個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14. 1軟件，選擇有監(jiān)督模式的OPLS-DA分析15批連樸飲基準(zhǔn)樣品，結(jié)果監(jiān)督模型中R²X（cum）為0. 774，R²Y（cum）為0. 928，Q²（cum）為0. 842，3個(gè)參數(shù)均大于0. 5，表明該模型有較好的預(yù)測(cè)能力。為了篩選出導(dǎo)致批次間差異性較大的成分，以變量權(quán)重值VIP評(píng)價(jià)方法對(duì)15批樣品進(jìn)行了分析。當(dāng)VIP＞1時(shí)，表明該成分是組間分類的關(guān)鍵因素。圖6可知，VIP＞1的共有峰有12個(gè)，由大到小排列為11（鹽酸小檗堿）、10、8（鹽酸黃連堿）、18、1、15、3（梔子苷）、2、19（染料木素）、4、16和14號(hào)色譜峰。表明這12個(gè)峰對(duì)應(yīng)的成分可能是導(dǎo)致不同批次之間樣品產(chǎn)生差異的主要原因。峰歸屬結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，姜黃連、焦梔子、炒淡豆豉、蘆根和石菖蒲5味藥材是引起連樸飲基準(zhǔn)樣品質(zhì)量變化的重要來源，所以為了更好地控制連樸飲基準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性，應(yīng)在藥材源頭進(jìn)行質(zhì)量穩(wěn)定性控制并重點(diǎn)關(guān)注上述藥材。

2. 3 化學(xué)成分鑒定

為了更為全面地解析LPD中化學(xué)成分的組成，取LPD基準(zhǔn)樣品溶液（S6）適量，按1. 6小節(jié)液質(zhì)條件測(cè)定，采用UPLC-Q-Orbitrap MS 正、負(fù)離子模式獲得LPD 化合物的質(zhì)譜信息見圖7，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Compound Discoverer 3. 3軟件進(jìn)行初步計(jì)算，結(jié)合Thermo mzCloud在線數(shù)據(jù)庫、Thermo mzValut本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行碎片和變量匹配，同時(shí)結(jié)合處方中各藥材化學(xué)成分及相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道，建立了各單味藥成分的化合物數(shù)據(jù)庫，共鑒定了91個(gè)化合物，見表6。

以梔子苷（35）的鑒別為例，通過PubChem Compound 查詢其分子式為C₁₇H₂₄O₁₀，相對(duì)分子質(zhì)量為388. 13670，在負(fù)離子模式下，碎片離子峰中有較強(qiáng)的m/z 33. 13489的碎片離子峰，根據(jù)其碎片峰的質(zhì)荷比，推測(cè)m/z 33. 13489的碎片離子峰為［M+HCOO］－，該化合物可能是梔子苷。碎片離子m/z 25. 07628［M－H－glc］－是由準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－脫去一分子葡萄糖殘基產(chǎn)生的，m/z 225. 07628通過異構(gòu)化和RDA裂解，產(chǎn)生m/z 123. 04405［M－H－Glc－C₄H₆O₃］-的碎片離子峰。

以大豆苷元（65）的鑒別為例，其準(zhǔn)分子離子［M－H］－ m/z 為253. 05718，該離子丟失1分子的CO后產(chǎn)生m/z 225. 06211碎片離子?；衔?8對(duì)應(yīng)物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子［M－H］^－ m/z 為283. 06759，碎片離子的m/z 分別為268. 03741和240. 04224，推測(cè)系m/z 283. 06759離子丟失甲基游離基及CO產(chǎn)生，為黃豆黃素。化合物74對(duì)應(yīng)物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子［M－H］^－m/z 為269. 05256，碎片離子的m/z 分別為225. 05495和133. 02831，推測(cè)系m/z 269. 05256離子丟失一分子CO₂產(chǎn)生，為染料木素。

共鑒定LPD中包括姜厚樸11個(gè)化合物、姜黃連12個(gè)化合物，炒淡豆豉6個(gè)化合物，焦梔子24個(gè)化合物，法半夏15個(gè)化合物，石菖蒲7個(gè)化合物，蘆根8個(gè)化合物，4個(gè)化合物為焦梔子和姜黃連共有，2個(gè)化合物為焦梔子、姜黃連和石菖蒲共有，1個(gè)化合物為姜厚樸、炒淡豆豉和焦梔子共有，1個(gè)化合物為石菖蒲和法半夏共有。主要包含環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、黃酮苷類、黃酮類和異黃酮類、生物堿類、木脂素類和氨基酸類，初步篩選出連樸飲基準(zhǔn)樣品中可能存在的化合物。

3 結(jié)論

在色譜條件優(yōu)化方面，對(duì)初步選擇的8個(gè)特征峰進(jìn)行200～400 nm全波長(zhǎng)掃描，選擇各特征峰均有吸收且分離度相對(duì)較好的波長(zhǎng)，最終確定指紋圖譜檢測(cè)所用波長(zhǎng)為254 nm。流動(dòng)相選擇時(shí)分別考察了乙腈-0. 05%磷酸水溶液、乙腈-0. 1%磷酸水溶液以及甲醇-0. 1%磷酸水溶液對(duì)指紋圖譜的影響，最終選擇甲醇-0. 1%磷酸水溶液為流動(dòng)相洗脫時(shí)，色譜圖具有較好的分離度和較穩(wěn)定的基線?；谝陨涎芯?，建立了基于HPLC指紋圖譜的連樸飲基準(zhǔn)樣品研究分析方法。

當(dāng)前，HPLC指紋圖譜是一種常見的控制中藥復(fù)方整體質(zhì)量的方法。在連樸飲基準(zhǔn)樣品的高效液相色譜指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證過程中，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值均在4. 55%以內(nèi)。為了更深入地了解連樸飲基準(zhǔn)物質(zhì)的指紋圖譜特征，采用了主成分分析、聚類分析和相似度評(píng)價(jià)這3種方法對(duì)其進(jìn)行了探究。用聚類分析和主成分分析的方法，可將15批基準(zhǔn)樣品分為3類，且二者結(jié)果具有高度的一致性。15批連樸飲基準(zhǔn)樣品的23個(gè)共有峰與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均高于0. 9，這表明不同批次、不同產(chǎn)品類型的供試品之間的主要物質(zhì)群具有相對(duì)較小的差別，制備工藝穩(wěn)定。PCA降維分析結(jié)果中，主成分1?4為主要影響因子，OPLS-DA共確定12個(gè)差異標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)對(duì)連樸飲影響較大的單味藥有姜黃連、焦梔子、炒淡豆豉、蘆根和石菖蒲，后期可以根據(jù)單味藥的質(zhì)量差異加以驗(yàn)證，以便更好地對(duì)連樸飲進(jìn)行質(zhì)量控制。在本研究中，所使用的質(zhì)譜檢測(cè)方法具有很高的靈敏度，根據(jù)豐富的質(zhì)譜信息，并與對(duì)照品和文獻(xiàn)相結(jié)合，共鑒定了91個(gè)化合物。將二者結(jié)合起來，不僅可以從總體上反映出連樸飲中所含化學(xué)成分的信息，還可以體現(xiàn)出處方中各藥味在方中的貢獻(xiàn)，為其質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。