聚乙烯亞胺修飾的鐵酸鎳-氧化石墨烯復(fù)合物在磷酸化多肽富集中的應(yīng)用

摘要 制備了一種聚乙烯亞胺（PEI）修飾的鐵酸鎳-氧化石墨烯復(fù)合物材料GO@PEI-NiFe2O4，用于選擇性凈化和富集生物樣品中的磷酸化肽段。此復(fù)合材料表面的Ni2+和Fe3+可與磷酸基團(tuán)配位，從而選擇性地吸附磷酸化肽段，修飾的PEI 增強(qiáng)了復(fù)合材料的親水性，有利于其與磷酸化肽段結(jié)合。此外，復(fù)合材料中的NiFe2O4 具有磁性，可使其快速?gòu)娜芤褐蟹蛛x出來(lái)。以β-酪蛋白（β-Casein）為樣品，考察了復(fù)合材料對(duì)胰酶酶解液中的磷酸化肽段的富集性能，并與GO@NiFe2O4（未被PEI 修飾）富集的結(jié)果進(jìn)行了比較，同時(shí)探討了復(fù)合材料的吸附機(jī)理。采用磷酸化肽段pTyr測(cè)定了復(fù)合材料對(duì)pTyr 的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附曲線，最大吸附容量可達(dá)36.2 μg/mg。研究結(jié)果表明，此復(fù)合材料能夠有效去除非磷酸化肽段等干擾組分的影響，高效地富集復(fù)雜基體中的磷酸化肽段。大鼠肝臟蛋白胰酶酶解液經(jīng)過(guò)富集后，采用質(zhì)譜可鑒定出1535 條磷酸化肽段，其富集效果顯著優(yōu)于Fe3+-IMAC 商品化試劑盒。本研究為磷酸化肽段的富集提供了一種高選擇性材料，在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有潛在的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 磷酸化肽段；鐵酸鎳；聚乙烯亞胺；氧化石墨烯；磁響應(yīng)

生物體內(nèi)許多重要的生理生化活動(dòng)都與蛋白質(zhì)磷酸化有關(guān)，如細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、分化和增殖等[1-3]。蛋白質(zhì)磷酸化的異常還會(huì)導(dǎo)致很多疾病的發(fā)生和發(fā)展[4-8]，研究蛋白質(zhì)磷酸化有助于揭示疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)疾病的相關(guān)生物標(biāo)志物，因此備受關(guān)注。質(zhì)譜分析技術(shù)具有定性和定量分析能力強(qiáng)、分析速度快、通量高、分辨率和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究不可或缺的分析手段[9-11]。復(fù)雜生物樣品中磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定由于其樣品基體干擾大、待測(cè)組分豐度低等因素，無(wú)法用質(zhì)譜直接檢測(cè)[12-13]。磷酸化多肽在質(zhì)譜分析前，樣品通常需要先通過(guò)凈化和富集，以去除干擾組分的影響[14]。因此，富集材料的性能對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定具有關(guān)鍵作用，開發(fā)高效、特異性強(qiáng)的富集材料對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)至關(guān)重要。

金屬氧化物親和色譜法（Metal oxide affinity chromatography， MOAC）對(duì)復(fù)雜基體中的磷酸化肽段具有較好的富集效果，其富集材料表面的金屬陽(yáng)離子可特異性識(shí)別磷酸化肽段的磷酸基團(tuán)并形成復(fù)合物[15-16]。這些富集材料表面的金屬陽(yáng)離子通過(guò)化學(xué)鍵與氧原子結(jié)合，穩(wěn)定性強(qiáng)，在富集過(guò)程中不易丟失，已有多種用于磷酸化肽段富集的MOAC 金屬氧化物被報(bào)道[17-22]，如TiO2、CeO2 和MoO3 等，這些金屬氧化物對(duì)復(fù)雜基體中的磷酸化肽段富集具有良好的選擇性。但是，大多數(shù)金屬氧化物的親水性低，在一定程度上限制了其對(duì)磷酸化肽段的凈化富集效果，因此，對(duì)金屬氧化物進(jìn)行改性已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[23-24]。

鐵酸鎳為二元金屬氧化物，其分子中含有的Ni—O 和Fe—O 功能基團(tuán)簇均可選擇性地與磷酸化肽段結(jié)合[25-26]，因此可用作生物樣品中磷酸化肽段的富集材料。同時(shí)， NiFe2O4 分子中含有鐵氧體，是一種磁性物質(zhì)，在磁鐵存在下，可從溶液中快速分離出來(lái)[27]。然而，在非修飾的情況下， NiFe2O4 作為富集材料對(duì)磷酸化肽段的吸附性能不佳[25-26]，并且極易發(fā)生聚集，因而使用不便，影響富集效果[28]。