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    基于黏性末端鏈置換擴(kuò)增的電化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)比率傳感器用于miRNA檢測

    2024-09-02 00:00:00金小亞張瑩林悅林振宇
    分析化學(xué) 2024年5期

    摘要 基于黏性末端鏈置換(TMSD)非酶擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建了一種簡單、高靈敏的電化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)比率傳感方法用于miRNA 的檢測。本方法以修飾在電極上的亞甲基藍(lán)(MB)產(chǎn)生的EC 信號作為內(nèi)參比信號,并將Ru(phen)32+嵌入到通過分支雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(bHCR)產(chǎn)生的DNA 納米微粒中作為ECL 探針。目標(biāo)物存在時(shí),MB 脫離電極表面并使ECL 信標(biāo)修飾在電極上,從而使EC 信號減弱, ECL 信號增強(qiáng),采用ECL 和EC 信號比值(ECL/EC)作為輸出信號,降低了潛在干擾,提高了傳感器的重現(xiàn)性和靈敏度。體系的ECL/EC 比值與miRNA-21 的濃度在10 fmol/L~500 pmol/L 范圍內(nèi)具有良好的響應(yīng),檢出限為6.5 fmol/L。與單一使用ECL 信號的方法相比,在測定1 pmol/L 的miRNA 目標(biāo)物時(shí),響應(yīng)信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差從8.2%下降到4.1%。本方法成功應(yīng)用于復(fù)雜細(xì)胞樣品中miRNA-21 的檢測。

    關(guān)鍵詞 電化學(xué);電化學(xué)發(fā)光;比率傳感器;黏性末端鏈置換;miRNA

    液體活檢作為體外診斷方法的重要分支,在臨床中的應(yīng)用日趨成熟,可用于腫瘤的早期診斷以及治療效果的動(dòng)態(tài)監(jiān)測與預(yù)后判斷[1-3]。miRNA 是臨床檢測中的重要的標(biāo)志物,經(jīng)典的miRNA 檢測方法為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-qPCR),具有良好的靈敏度[4],然而其操作步驟相對繁瑣,并且需要嚴(yán)格精確的控溫設(shè)備以及專業(yè)的操作人員,限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用[5]。因此,開發(fā)靈敏度高、可靠且簡單方便的miRNA 檢測技術(shù)在腫瘤分子診斷方面具有重要的意義。

    電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence, ECL)具有高信噪比、高靈敏度、設(shè)備簡單以及操作簡便等優(yōu)勢[6-7],廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)志物的分析檢測,將ECL 與信號放大技術(shù)相結(jié)合的傳感器展現(xiàn)出極高的檢測靈敏度[8-9]。傳統(tǒng)的ECL 核酸生物傳感器的構(gòu)建通常需在電極表面修飾DNA 探針,因此,傳感器的重現(xiàn)性受到傳感界面的有效面積、DNA 探針的分布和密度、電極界面的性質(zhì)以及相關(guān)試劑用量等因素的影響[10]。比率傳感器通過利用內(nèi)部或外部參比信號校正,能有效消除非特異性干擾所引起的信號偏差,進(jìn)而提高傳感器的重現(xiàn)性[11-12]。Zhu 等[13]將ECL 信號與電化學(xué)(Electrochemistry, EC)信號的比值作為讀出信號,制備了一種高精度、高重復(fù)性的比率生物傳感器,用于miRNA-133a 的超靈敏檢測。其中,亞甲基藍(lán)(MB)的EC 信號與目標(biāo)物miRNA 的濃度無關(guān),僅用于監(jiān)測電極表面的實(shí)時(shí)狀態(tài),以此校正信號干擾。該傳感器具有良好的分析性能,對急性心肌梗塞(AMI)的早期診斷具有良好的應(yīng)用潛力。

    本研究基于一種典型的非酶依賴且不需精確控溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)—黏性末端鏈置換擴(kuò)增(Toeholdmediatedstrand displacement, TMSD)技術(shù)[14-15],構(gòu)建了一種簡單、靈敏和重現(xiàn)性良好的電化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)比率傳感器用于miRNA 檢測。此傳感器采用電極上修飾的MB 產(chǎn)生的EC 信號作為內(nèi)部參比信號,以校正電極表面探針修飾的不均勻性;以MB 修飾的DNA 作為EC 探針,并將Ru(phen)32+ 嵌入到通過分支雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Branched hybridization chain reaction, bHCR)產(chǎn)生的DNA 納米微粒中作為ECL 探針。目標(biāo)物存在時(shí), EC 信號減弱, ECL 信號增強(qiáng), ECL 和EC 信號比值(ECL/EC)與目標(biāo)物濃度具有相關(guān)性。采用ECL/EC 信號比值作為輸出信號,可以減少干擾、提高傳感器的靈敏度和重現(xiàn)性。TMSD 作為一種非酶信號放大技術(shù),可以有效地放大目標(biāo)信號,同時(shí)避免了酶基方法易受環(huán)境變化影響的問題。

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