基于黏性末端鏈置換擴(kuò)增的電化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)比率傳感器用于miRNA檢測

摘要 基于黏性末端鏈置換（TMSD）非酶擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建了一種簡單、高靈敏的電化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)比率傳感方法用于miRNA 的檢測。本方法以修飾在電極上的亞甲基藍(lán)（MB）產(chǎn)生的EC 信號(hào)作為內(nèi)參比信號(hào)，并將Ru（phen）32+嵌入到通過分支雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（bHCR）產(chǎn)生的DNA 納米微粒中作為ECL 探針。目標(biāo)物存在時(shí)，MB 脫離電極表面并使ECL 信標(biāo)修飾在電極上，從而使EC 信號(hào)減弱， ECL 信號(hào)增強(qiáng)，采用ECL 和EC 信號(hào)比值（ECL/EC）作為輸出信號(hào)，降低了潛在干擾，提高了傳感器的重現(xiàn)性和靈敏度。體系的ECL/EC 比值與miRNA-21 的濃度在10 fmol/L～500 pmol/L 范圍內(nèi)具有良好的響應(yīng)，檢出限為6.5 fmol/L。與單一使用ECL 信號(hào)的方法相比，在測定1 pmol/L 的miRNA 目標(biāo)物時(shí)，響應(yīng)信號(hào)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差從8.2%下降到4.1%。本方法成功應(yīng)用于復(fù)雜細(xì)胞樣品中miRNA-21 的檢測。

關(guān)鍵詞 電化學(xué)；電化學(xué)發(fā)光；比率傳感器；黏性末端鏈置換；miRNA

液體活檢作為體外診斷方法的重要分支，在臨床中的應(yīng)用日趨成熟，可用于腫瘤的早期診斷以及治療效果的動(dòng)態(tài)監(jiān)測與預(yù)后判斷[1-3]。miRNA 是臨床檢測中的重要的標(biāo)志物，經(jīng)典的miRNA 檢測方法為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-qPCR），具有良好的靈敏度[4]，然而其操作步驟相對繁瑣，并且需要嚴(yán)格精確的控溫設(shè)備以及專業(yè)的操作人員，限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用[5]。因此，開發(fā)靈敏度高、可靠且簡單方便的miRNA 檢測技術(shù)在腫瘤分子診斷方面具有重要的意義。

電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence， ECL）具有高信噪比、高靈敏度、設(shè)備簡單以及操作簡便等優(yōu)勢[6-7]，廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)志物的分析檢測，將ECL 與信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合的傳感器展現(xiàn)出極高的檢測靈敏度[8-9]。傳統(tǒng)的ECL 核酸生物傳感器的構(gòu)建通常需在電極表面修飾DNA 探針，因此，傳感器的重現(xiàn)性受到傳感界面的有效面積、DNA 探針的分布和密度、電極界面的性質(zhì)以及相關(guān)試劑用量等因素的影響[10]。比率傳感器通過利用內(nèi)部或外部參比信號(hào)校正，能有效消除非特異性干擾所引起的信號(hào)偏差，進(jìn)而提高傳感器的重現(xiàn)性[11-12]。Zhu 等[13]將ECL 信號(hào)與電化學(xué)（Electrochemistry， EC）信號(hào)的比值作為讀出信號(hào)，制備了一種高精度、高重復(fù)性的比率生物傳感器，用于miRNA-133a 的超靈敏檢測。其中，亞甲基藍(lán)（MB）的EC 信號(hào)與目標(biāo)物miRNA 的濃度無關(guān)，僅用于監(jiān)測電極表面的實(shí)時(shí)狀態(tài)，以此校正信號(hào)干擾。該傳感器具有良好的分析性能，對急性心肌梗塞（AMI）的早期診斷具有良好的應(yīng)用潛力。

本研究基于一種典型的非酶依賴且不需精確控溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)—黏性末端鏈置換擴(kuò)增（Toeholdmediatedstrand displacement， TMSD）技術(shù)[14-15]，構(gòu)建了一種簡單、靈敏和重現(xiàn)性良好的電化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)比率傳感器用于miRNA 檢測。此傳感器采用電極上修飾的MB 產(chǎn)生的EC 信號(hào)作為內(nèi)部參比信號(hào)，以校正電極表面探針修飾的不均勻性；以MB 修飾的DNA 作為EC 探針，并將Ru（phen）32+ 嵌入到通過分支雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Branched hybridization chain reaction， bHCR）產(chǎn)生的DNA 納米微粒中作為ECL 探針。目標(biāo)物存在時(shí)， EC 信號(hào)減弱， ECL 信號(hào)增強(qiáng)， ECL 和EC 信號(hào)比值（ECL/EC）與目標(biāo)物濃度具有相關(guān)性。采用ECL/EC 信號(hào)比值作為輸出信號(hào)，可以減少干擾、提高傳感器的靈敏度和重現(xiàn)性。TMSD 作為一種非酶信號(hào)放大技術(shù)，可以有效地放大目標(biāo)信號(hào)，同時(shí)避免了酶基方法易受環(huán)境變化影響的問題。