天水大櫻桃白紋羽病病原菌分離鑒定

摘" "要" "在天水大櫻桃主要產(chǎn)區(qū)，通過組織分離法對疑似白紋羽病樣進行分離培養(yǎng)，選取優(yōu)勢病原菌種類，采用離體枝條接種法進行致病性測定，觀察分離物形態(tài)特征并結(jié)合16SrDNA序列分析進行菌種鑒定。通過組織分離和純化，獲得3株分離物，經(jīng)形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，均為褐座堅殼菌[ Rosellinianecatrix（Hart.）Berl ]。對3株分離物進行致病性測定，均能侵染大櫻桃枝條，并且在枝條表面形成白色網(wǎng)狀菌索。試驗證明，大櫻桃白紋羽病在天水地區(qū)存在，且致病菌為褐座堅殼菌。

關鍵詞" "天水;大櫻桃;白紋羽病;褐座堅殼菌;鑒定

大櫻桃喜光、喜溫、喜濕、喜肥，適合在沙壤土或礫質(zhì)壤土上生長。天水地處甘肅東南部，屬北暖溫帶大陸性氣候，海拔1 085～3 120 m，年均溫9.6 ℃，平均日照時數(shù)2 114.3 h，無霜期140～186 d，年降水量480～610 mm，非常適合大櫻桃生長。據(jù)2022年天水市果業(yè)辦統(tǒng)計，天水大櫻桃種植面積8.51萬畝，產(chǎn)量3.2萬t，產(chǎn)值6.68億元，其中秦州區(qū)6.05萬畝，產(chǎn)量2.29萬t，產(chǎn)值4.74億元。

大櫻桃白紋羽病主要危害果樹的根部，引起根腐，在我國主要分布于東北、華北、華南等地。其致病菌為褐座堅殼菌，自然條件下主要通過病健部接觸或帶菌苗木傳播，病菌可形成白色菌絲體和菌索，也可形成子囊殼，嚴重時導致全根腐爛，樹體逐漸枯死。目前對于白紋羽病的研究主要集中在筆柏、蘋果、梨等樹種上，在大櫻桃上未見報道。

近年來，天水大櫻桃種植面積急劇擴增，導致病害多發(fā)，尤其是土傳病害愈發(fā)嚴重，其中有些病癥高度疑似白紋羽病。針對此，我們采用組織分離法對大櫻桃疑似病樣進行分離培養(yǎng)，采用離體枝條接種法進行病原菌致病性測定，旨在確定天水大櫻桃產(chǎn)區(qū)是否存在白紋羽病致病菌，為該病的診斷與防控提供理論依據(jù)。

1" "材料與方法

1.1" "布點調(diào)查" "2023年3—5月，在天水市甘谷縣新興鎮(zhèn)頡家村滿意櫻桃園、天水市秦州區(qū)果樹研究所櫻桃種質(zhì)資源圃、天水市秦州區(qū)秀金山欣晟果業(yè)合作社櫻桃園、天水市秦州區(qū)玉泉鎮(zhèn)煙鋪村大櫻桃種植基地、天水市麥積區(qū)甘泉鎮(zhèn)白石村甘肅華實高效農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司基地、天水市麥積區(qū)南山萬畝櫻桃種植基地、天水市張家川龍山鎮(zhèn)馬河村櫻桃標準化示范基地、天水市武山縣咀頭鄉(xiāng)咀頭村潤博種植專業(yè)合作社8處調(diào)查大櫻桃樹體萎蔫至枯死的植株，并查看地下根系壞死情況，觀察根系是否出現(xiàn)白色菌絲（疑似病株判別標準）。

1.2" "試驗材料

1）病株樣本。在不同果園采集大櫻桃病根，裝入自封袋，記錄采集時間、采集地點等信息，做好標簽帶回實驗室，置于4 ℃冰箱中恒溫保存。

2）供試培養(yǎng)基。選用PDA培養(yǎng)基，主要配方：削過皮的土豆200 g，瓊脂15～20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3" "試驗方法

1）病原菌分離。采用組織分離法，以發(fā)病特征明顯的大櫻桃根部組織為材料，用無菌刀在病健交界處切取3 mm×3 mm的病變組織，用75%酒精、2.5%次氯酸鈉殺菌3次，置于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，直到出現(xiàn)菌落。將單個菌落純化培養(yǎng)，置于PDA傾斜培養(yǎng)基中，4 ℃冷藏，待用。

2）菌種保存。將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，大約14 d后在無菌操作臺上收集菌絲于凍存管中，-20 ℃下保存。

3）致病性測定。采用離體枝條接種法測定致病性。選用健康的大櫻桃枝條，依次用75%酒精和2.5%次氯酸鈉消毒處理，然后用蒸餾水沖洗3次，每個枝條接種1塊直徑5 mm的病原菌菌餅，設3次重復。接種PDA培養(yǎng)基菌餅作為對照。培養(yǎng)皿中鋪4層濕潤的濾紙，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后5、7、10 d觀察離體枝條發(fā)病情況。

4）病原菌再次分離。病原菌再次分離的目的是完成赫氏法則驗證，主要步驟：從已接種的發(fā)病枝條的病健交界處取5 mm×5 mm組織塊，按照組織分離法對病原菌進行再次分離。

5）病原菌形態(tài)學鑒定。將病原菌用PDA培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)后，于25 ℃下培養(yǎng)7 d，對菌體、菌落色、形狀等進行觀察，用參考文獻14所述方法進行形態(tài)學鑒定。

6）病原菌分子生物學鑒定。 根據(jù)真菌DNA提取試劑盒的說明，采用超痕量分光光度計測定DNA的純度及濃度，將樣本稀釋為50 ng/μL標準溶液， 待用。94 ℃預變性5 min， 94 ℃變性30 s，62 ℃預變性50 s，72 ℃延伸l min，循環(huán)" 30次。在72 ℃下進行5 min的保存。擴增完成后，將擴增產(chǎn)物送入生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。利用 NCBI的 BLAST序列對測序數(shù)據(jù)進行同源性比對，并利用 MAGE6.0軟件，通過相鄰連接法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行" " 1 000次反復驗證。

2" "結(jié)果與分析

經(jīng)調(diào)查，大櫻桃白紋羽病典型癥狀在天水市甘谷縣、秦州區(qū)、麥積區(qū)、張家川、武山縣大櫻桃園均有出現(xiàn)。

2.1" "癥狀特征" "主要發(fā)生在大櫻桃的根部， 在根部組織形成白色網(wǎng)狀菌索（圖1），" 菌絲深入木質(zhì)部導致根部腐爛， 嚴重時樹體葉片枯黃最終壞死。

2.2" "菌株的分離純化" "從天水市甘谷縣、秦州區(qū)、麥積區(qū)、張家川、武山縣采集到的病株上共分離出3個分離物，挑取單孢進行純化培養(yǎng)，得到3株純化菌株（圖2），分別命名為GF-1、GF-2、GF-3。

2.3" "病原菌的致病性測定" "病原菌的致病性測定采用離體大櫻桃枝條接種法，在接種的4～14 d內(nèi)均可看見白色菌索覆蓋在離體枝條上（圖3A），這與在田間大櫻桃根部發(fā)現(xiàn)的癥狀一致，而空白對照在大櫻桃離體枝條上未出現(xiàn)白色菌索（圖3B）。通過再分離實驗完成科赫氏法則驗證，得到的分離物與初次得到的分離物形態(tài)一致，說明分離物對大櫻桃枝條具有致病性，初步可以認定本研究分離的菌株為大櫻桃白紋羽病病原菌。

2.4" "病菌的形態(tài)特征" "將該病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，其白色菌團的大小可以達到2.5±0.5 cm（圖4A）。繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，菌團可以完全遮蓋整個培養(yǎng)皿（圖4B）。菌團圓形，邊沿羽狀，中部較稠密，沒有著色;菌絲具有隔膜和分枝，分枝較細（圖4C）。其形態(tài)特征與褐座堅殼菌[ Rosellinianecatrix（Hart.）Berl ]的特點相吻合。

2.5" "菌株16SrDNA序列分析" "從3種病原菌中提取DNA，采用16SrDNA普通引物，每個引物可得到500 bP左右的目標帶，分離純化后測序。通過BLAST比對，利用 MAGE6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結(jié)果顯示它們都是褐座堅殼菌的16 SrDNA序列。菌株GF-2與西班牙鱷梨上分離的MK430555.1組成一組，相似率為100%，菌株GF-1和菌株GF-3與來自印度喜馬偕爾邦的蘋果樹上分離的褐座堅殼菌株HG964402.1組成一組，相似率為100%。這表明，引起天水大櫻桃白紋羽病的病原菌至少存在2個種。

3" "小結(jié)與討論

大櫻桃白紋羽病在天水市甘谷縣、秦州區(qū)、麥積區(qū)、武山縣、張家川均有分布。通過致病性測定，分離出的菌株GF-1、GF-2、GF-3在離體條件下能夠侵染大櫻桃枝條。分析來自不同地區(qū)白紋羽病病菌的16SrDNA序列，發(fā)現(xiàn)菌株GF-1、GF-3與HG964402.1組成一組，分離菌株GF-2與MK430555.1組成一組，表明引起天水地區(qū)大櫻桃白紋羽病的褐座堅殼菌至少存在2個種。

白紋羽病是果樹根腐病的一種，由于發(fā)生較少，目前在大櫻桃上尚未見相關報道，在甘肅天水地區(qū)是否有該病發(fā)生尚不明確。對白紋羽病的研究目前主要集中于蘋果、梨等樹種，Hossein Golafrouz等人對引起梨根腐的褐座堅殼菌做了深入研究，結(jié)果表明：分離來自伊朗的芽孢桿菌和木霉可對褐座堅殼菌有明顯的拮抗作用，為該病的生物防治提供了新的思路。Sawant Shailesh S等人從梨園土壤中分離出32株致病菌，鑒定發(fā)現(xiàn)其菌株都是引起梨樹根腐的褐座堅殼菌。在蘋果樹種上，Pasini Luca等人研究表明，褐座堅殼菌是導致蘋果發(fā)生根腐的主要原因，并且這種病原菌難以控制，通過溫室盆栽試驗表明木霉對該病菌有一定的生防效果。Nazeer等人對引起蘋果樹根腐的病原菌做了系統(tǒng)研究，認為引起蘋果樹根腐病的病原菌主要是褐座堅殼菌，并且篩選出抑制褐座堅殼菌的生防菌株。

國內(nèi)外有關大櫻桃樹種由于褐座堅殼菌引起根腐的研究尚無。本研究利用常規(guī)組織分離法、病原菌致病性測定、病原菌形態(tài)學鑒定及分子生物學鑒定等方法，確定了天水地區(qū)大櫻桃發(fā)生白紋羽病的病原種類為褐座堅殼菌，這一結(jié)論與前人研究一致，也是有關天水地區(qū)大櫻桃白紋羽病的首次報道，希望對該病在大櫻桃上的防控技術研究提供一定的理論基礎。

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（文中部分圖片彩版見封二）