一例鸚鵡綠膿桿菌的分離鑒定

中圖分類號：S858.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號：1673-1085（2024）08-0052-04

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又稱銅綠假單胞菌，屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），菌體呈兩端鈍圓的桿狀，一般單個(gè)、成對或短鏈狀排列，可以產(chǎn)生綠膿菌素和熒光色素，是革蘭氏陰性條件致病菌，于1882年從傷口的膿液中首次分離到[1]，我國于1982年首次分離。綠膿桿菌對營養(yǎng)要求很低，能適應(yīng)大多數(shù)環(huán)境，如水、土壤、空氣等自然環(huán)境，健康動(dòng)物的消化道和皮膚上也可檢測到。作為條件致病菌，綠膿桿菌可以與健康動(dòng)物并存，不引起動(dòng)物發(fā)病。當(dāng)機(jī)體免疫力下降或免疫抑制時(shí)，可引發(fā)綠膿桿菌致病性感染，一般表現(xiàn)為化膿性或敗血性疾病癥狀[2]，還能引起人的角膜炎、關(guān)節(jié)炎等。醫(yī)院中10%～20%的感染由它引起，對抗生素有很強(qiáng)的耐藥性，2017年被世界衛(wèi)生組織列為危險(xiǎn)病原體[3]。

綠膿桿菌對多種動(dòng)物易感，動(dòng)物宿主不同，感染后所引發(fā)的癥狀也不同。禽類感染后，一般引發(fā)敗血癥[4-5]；牛感染后常引起乳腺炎或肺炎[6]；兔發(fā)病一般導(dǎo)致出血性腸炎和痢疾[7]；羊感染常表現(xiàn)為流產(chǎn)、化膿性肺炎、流膿性鼻液等[8]。隨著我國養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，綠膿桿菌感染的報(bào)道也逐漸增多，抗生素的不規(guī)范使用使其耐藥性逐漸增強(qiáng)，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大威脅，甚至威脅到了人類健康[9-10]。本研究從鸚鵡臟器中分離到致病性綠膿桿菌，并對綠膿桿菌的耐藥性進(jìn)行分析，為綠膿桿菌感染的防控提供理論基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 樣品采集

剖檢發(fā)病鸚鵡，采集肝、脾、腎等臟器。

1.2" "主要試劑和引物

RNA提取試劑盒，杭州Axygen科技有限公司；One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；藥敏片，溫州康泰生物科技有限公司；引物由擎科生物科技有限公司（青島）合成。引物序列見表1。

2" 方法

2.1" 樣品處理

采集病料0.2 g置于1.5 mL離心管中，加入1 mL生理鹽水和研磨珠，用組織研磨器充分研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移至新的離心管，12 000 rpm離心5 min，取200 μL上清用于后續(xù)RNA提取。

2.2" 細(xì)菌分離與純化

無菌采集肝臟接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，培養(yǎng)基長出邊緣平坦、有芳香氣味、煥發(fā)藍(lán)綠色光澤的菌落。菌體革蘭氏染色呈陰性，細(xì)菌外形桿狀，單個(gè)或成對排列，不形成莢膜與芽胞。

2.3" "RNA提取

用RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作參考試劑盒說明書。

2.4" "PCR檢測

以RNA為模板，用一步法RT-PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行PCR檢測。反應(yīng)體系為20 μL，包括RNA 3 μL，上下游引物各1 μL，2×Reaction Mix 10 μL，Enzyme Mix 0.5 μL，RNase-free Water 4.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 5 min。

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物科技有限公司（上海）測序。

2.5" "序列分析

測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對分析。

3nbsp; 結(jié)果

3.1" "PCR檢測

設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增綠膿桿菌FLGE基因片段，能夠擴(kuò)增出與目的條帶大小相似的片段（1 300 bp）。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

3.2" "序列分析

測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對分析，與綠膿桿菌序列高度同源。分離菌株序列Blast比對結(jié)果見圖2。

3.3" "藥敏分析

用該菌對16種動(dòng)物常用抗生素藥物進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)（圖3），結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)以抑菌圈直徑≤10mm為低敏，＞10mm且≤15mm為中敏，＞15mm為高敏。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對阿米卡星、環(huán)丙沙星、慶大霉素高敏，結(jié)果見表2。

4" " 討論與結(jié)論

綠膿桿菌分布廣泛，能感染多種動(dòng)物引起不同的癥狀，其中禽類感染率較高，造成養(yǎng)殖場巨大損失。長期以來，綠膿桿菌屬于機(jī)會(huì)致病菌，主要引起免疫功能低下動(dòng)物發(fā)病和死亡，對健康動(dòng)物的致病力較低，因此未能引發(fā)起養(yǎng)殖者足夠重視。然而隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，綠膿桿菌產(chǎn)生的危害不斷擴(kuò)大，阻礙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，甚至威脅到了人類的健康。近年來，濫用抗生素使綠膿桿菌耐藥情況愈發(fā)普遍[11]，對多種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，包括氨基糖苷類、奎諾酮類和β-內(nèi)酰胺類等[12]，其耐藥機(jī)制可分為內(nèi)在耐藥、獲得性耐藥和適應(yīng)性耐藥。內(nèi)在耐藥性主要通過其低外膜通透性，并產(chǎn)生抗生素滅活酶；獲得性耐藥可通過耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移或突變來實(shí)現(xiàn)；適應(yīng)性耐藥性主要通過在感染部位形成生物膜，作為擴(kuò)散屏障限制抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。這些都是導(dǎo)致養(yǎng)殖場長期和反復(fù)感染的原因。針對綠膿桿菌感染的疫苗和藥物還不成熟，因此，研究綠膿桿菌感染對養(yǎng)殖生產(chǎn)有重要的意義。

德州某鸚鵡養(yǎng)殖場低日齡鸚鵡大量死亡，經(jīng)菌株分離檢測確診為綠膿桿菌感染。對該菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，高敏藥物為阿米卡星、環(huán)丙沙星、慶大霉素。綠膿桿菌可以通過形成生物膜誘導(dǎo)為難以根治的慢性感染，也可分泌許多毒力因子誘導(dǎo)急性感染，再加上其對抗生素有很強(qiáng)的耐藥性，對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成極大威脅。為了減少濫用抗生素現(xiàn)象的發(fā)生，在治療綠膿桿菌之前，養(yǎng)殖場需對感染的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，對癥下藥，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。臨床養(yǎng)殖要重視綠膿桿菌感染，以預(yù)防為主、治療為輔，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期消毒，如新潔爾滅、醋酸都可將其殺死，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔、衛(wèi)生。

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