淋巴結(jié)濾泡輔助T細(xì)胞淋巴瘤-血管免疫母細(xì)胞型臨床病理特征和預(yù)后因素分析

【關(guān)鍵詞】淋巴結(jié)濾泡輔助T細(xì)胞淋巴瘤-血管免疫母細(xì)胞型；濾泡輔助T細(xì)胞表型；Epstein-Barr病毒編碼的小RNA；預(yù)后

【中圖分類(lèi)號(hào)】R363 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-04-23

血管免疫母細(xì)胞性T 細(xì)胞淋巴瘤（angioimmu?noblastic T-cell lymphoma，AITL）是外周T細(xì)胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL）的常見(jiàn)類(lèi)型之一，歐美約占PTCL病例的15%～20%[1-2]，我國(guó)占比更高。2022年第5版WHO血液淋巴系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)（5th edition of the WHO Classification of Haemato?lymphoid Tumours，WHO-HAEM5）將AITL重新命名為淋巴結(jié)濾泡輔助T細(xì)胞淋巴瘤-血管免疫母細(xì)胞型（nodal T-follicular helper cell lymphoma，angioimmunoblastic-type，nTFHL-AI）[3]。

nTFHL-AI主要影響疾病晚期的老年人，以全身性淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大以及系統(tǒng)性癥狀為主要特征[4-6]。大多數(shù)病例包含Epstein-Barr 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）陽(yáng)性B細(xì)胞顯著擴(kuò)增，提示該病可能與免疫功能失調(diào)有關(guān)[7-8]。nTFHL-AI組織病理學(xué)特點(diǎn)主要是淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)部分或完全消失，腫瘤性T 細(xì)胞浸潤(rùn)，高內(nèi)皮靜脈（high endothelialveins，HEVs）和濾泡樹(shù)突細(xì)胞（follicular dendriticcells，F(xiàn)DCs）增生，以及EBV陽(yáng)性B細(xì)胞增生。鑒于nTFHL-AI臨床病理特征復(fù)雜，致使準(zhǔn)確診斷具有挑戰(zhàn)性。目前仍以傳統(tǒng)病理學(xué)診斷為主，必要時(shí)配合分子或遺傳學(xué)檢測(cè)。此外，nTFHL-AI預(yù)后較差，患者生存時(shí)間短?，F(xiàn)有治療方案如蒽環(huán)類(lèi)藥物治療和造血干細(xì)胞移植療效有限。盡管單藥治療如苯達(dá)莫司汀、來(lái)那度胺、維布妥昔單抗和組蛋白去乙酰化劑在延緩甚至治愈疾病方面展現(xiàn)出前景，但是復(fù)發(fā)或難治性nTFHL-AI患者的預(yù)后仍未明顯改善，亟需開(kāi)發(fā)新的治療策略來(lái)改善患者生存結(jié)局。在這項(xiàng)回顧性研究中，本研究闡明了nTFHL-AI的臨床和病理特征，并揭示了潛在的預(yù)后因素，旨在為nTFHL-AI的臨床管理提供一些參考。

1 資料與方法

1.1 患者信息

本研究收集了2012年12月至2022年1月重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理科（即重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科）63例nTFHL-AI病例信息和對(duì)應(yīng)的福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織。根據(jù)最新WHO分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[3]，所有nTFHL-AI病例由2位及以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專(zhuān)家閱片。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均經(jīng)過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2023071）。

1.2 組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察及免疫組織化學(xué)檢測(cè)

在FFPE組織切片HE染色后顯微鏡下觀(guān)察組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，并行免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色檢測(cè)，一抗包括CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、CXCL13、BCL6、CD10、PD1、CD30、CD21、CD23、Ki67（福州邁新生物科技有限公司）。泛T抗原陽(yáng)性定義為超過(guò)50%腫瘤細(xì)胞至少1個(gè)標(biāo)記物（CD2、CD3、CD5或CD7）陽(yáng)性，并伴有不同程度丟失。TFH標(biāo)記物陽(yáng)性定義為至少有兩種標(biāo)記物（PD-1、BCL6、CD10和CXCL13）染色，且陽(yáng)性細(xì)胞比例≥25%。CD30陽(yáng)性細(xì)胞比例≥10%判定為陽(yáng)性。

1.3 原位雜交檢測(cè)EBV編碼的小RNA

采用原位雜交（in situ hybridization，ISH）技術(shù)檢測(cè)EBV編碼的小RNA（EBV-encoded small RNA，EBER）1/2。顯微鏡下觀(guān)察EBV感染的淋巴細(xì)胞（主要觀(guān)察B細(xì)胞）陽(yáng)性定義為EBER陽(yáng)性并計(jì)數(shù)。

1.4 克隆性研究

為研究克隆性，本研究參照文獻(xiàn)方法檢測(cè)T細(xì)胞受體γ（T-cell receptor γ，TCRγ）、免疫球蛋白重鏈（immunoglobulinheavy chain，IgH）和免疫球蛋白κ 輕鏈（immunoglobulin κlight chain，Igκ）基因重排[9]。從FFPE 組織提取DNA，利用BioMed-2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)處理后形成異源雙鏈核酸分子，并用聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)。若電泳條帶清晰，片段大小與BIOMED-2引物系統(tǒng)中陽(yáng)性對(duì)照片段相符，則判定為單克隆重排陽(yáng)性，反之重排陰性。

1.5 反應(yīng)評(píng)估

根據(jù)2014年Lugano反應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，nTFHL-AI患者治療反應(yīng)分為：完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（par?tial remission，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）[10]?？偡磻?yīng)率（overall response rate，ORR）定義為達(dá)到CR或PR的百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件（版本27.0）分析。2組之間臨床病理特征差異使用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)?？傮w生存期（overall survival，OS）定義為從診斷之日起到死亡或最近1 次的隨訪(fǎng)日期。無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free sur?vival，PFS）定義為從初次診斷之日起到疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)、任何原因死亡或最近1次隨訪(fǎng)的最早日期?？傮w生存期和無(wú)進(jìn)展生存期用Kaplan-Meier法評(píng)估，并用log-rank檢驗(yàn)比較。預(yù)后因素采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征

表1總結(jié)了患者臨床特征。本研究納入30名男性和33名女性，中位年齡67歲（范圍33～87歲）。在63名患者中，42名患者臨床信息可從重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲取，21例患者僅于門(mén)診會(huì)診而未進(jìn)一步檢查或者直接轉(zhuǎn)院，致使數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法檢索其臨床檢驗(yàn)及部分病理檢查結(jié)果。63名患者治療信息完整，數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)獲取42例患者治療方案，先前缺失的21例患者電話(huà)隨訪(fǎng)獲取了治療信息。其中6名（10%）拒絕任何形式的治療，57名（90%）接受化療。在接受化療的57名患者中，39名（68%）接受CHOP（環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松）或CHOP樣方案治療，16 名（28%）接受CHOEP（CHOP 聯(lián)合依托泊苷）或CHOEP樣化療，2名（4%）使用非蒽環(huán)類(lèi)藥物治療。在接受化療的57名患者中，5名（9%）還同時(shí)接受西達(dá)本胺治療，1名（2%）同時(shí)采用來(lái)那度胺治療。此外，6名（11%）患者化療同時(shí)進(jìn)行自體干細(xì)胞移植（autologous stem cell transplanta?tion，ASCT）。

2.2 組織病理學(xué)結(jié)果

大多數(shù)nTFHL-AI病例顯示淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)消失，伴分支狀HEVs和FDCs增生。部分病例可見(jiàn)胞漿透亮的腫瘤T細(xì)胞簇?fù)碛谘苤車(chē)?，增生的B 細(xì)胞散在分布于腫瘤T細(xì)胞間（圖1）。免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。在56例中，38例（68%）CD4和CD8共表達(dá)。16例（29%）僅CD4陽(yáng)性，2例僅CD8陽(yáng)性（3%）。有37例（66%）CD4陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞占明顯優(yōu)勢(shì)，而僅3例（5%）CD8陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)（圖2）。此外，16 例（29%）中CD4和CD8陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞無(wú)任何優(yōu)勢(shì)。在63位患者中，TFH 相關(guān)抗原的陽(yáng)性率依次為PD1（86%）=BCL6（86%）gt;CD10（73%）gt;CXCL13（49%）。泛T抗原的陽(yáng)性率依次為CD5（92%）、CD3（89%）、CD7（84%）、CD2（80%）；丟失比率依次為CD7（14%）gt;CD2（12%）gt;CD3（6%）=CD5（6%）（表3）。

2.3 克隆性結(jié)果

TCRγ、IgH和Igκ基因重排分別為37例（37/42，88%）、3例（3/42，7%）和3例（3/28，11%）（表2）。此外，TCRγ和Ig基因重排同時(shí)發(fā)生有4例。僅Ig基因重排而無(wú)TCRγ重排僅1例。

2.4 EBER狀態(tài)及其對(duì)nTFHL-AI影響

63 例nTFHL-AI 患者EBV 陽(yáng)性有38 例（60%）。基于EBER陽(yáng)性細(xì)胞占總組織細(xì)胞百分比將nTFHL-AI患者分成4組[11]：0%、≤1%、1%～lt;5%、≥5%，各組分別占比為40%（25/63）、14%（9/63）、29%（18/63）和17%（11/63）（表2）。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)3例T細(xì)胞EBER陽(yáng)性病例（圖3A、B）。另外，有1例EBER假陽(yáng)性，是因?yàn)閷⑹人峒?xì)胞誤認(rèn)為EBER陽(yáng)性所致（圖3C、D）。根據(jù)EBER狀態(tài)將nTFHL-AI患者分為EBER陽(yáng)性和陰性組，利用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較2組與臨床病理特征關(guān)系（表4）。與EBER陰性組相比，EBER陽(yáng)性組女性比例增高（P=0.035）。EBER 陽(yáng)性組更傾向于表達(dá)CXCL13，表明兩者之間存在相關(guān)性（P=0.006）。

2.5 nTFHL-AI患者預(yù)后分析

本研究評(píng)估63例nTFHL-AI患者預(yù)后，中位OS為20個(gè)月，1 年、3 年和5 年的OS 率分別是59%、37% 和31%（圖4A）。中位PFS為15個(gè)月，1年、3年和5年的PFS率分別是51%、24%和16%（圖4B）。接受蒽環(huán)類(lèi)藥物聯(lián)合化療患者的CR率約39%（表1）。

與CXCL13陽(yáng)性組相比，CXCL13陰性組nTFHL-AI患者有更差的OS和PFS（P=0.003、P=0.040；圖5A）。CXCL13陽(yáng)性組1年、2年和3年OS率分別為74%、63%和51%，陰性組對(duì)應(yīng)的OS率分別為43%、28%和11%。同樣地，CXCL13陽(yáng)性組1年、2年和3年P(guān)FS率分別為64%、49%和28%，陰性組對(duì)應(yīng)的PFS率分別37%、23%和23%。BCL6陰性組1年、3年和5年OS率分別89%、78%和78%，陽(yáng)性組對(duì)應(yīng)的OS率分別55%、25%和21%。BCL6陰性組1年、3年和5年P(guān)FS率分別77%、62% 和41%，而陽(yáng)性組為46%、16% 和11%。BCL6 陽(yáng)性組比陰性組的OS和PFS明顯縮短（P=0.026、P=0.044；圖5B）。而CD10表達(dá)與否對(duì)患者1年、3年和5年OS率和PFS率影響不顯著（P=0.277、P=0.116；圖5C）。PD1陽(yáng)性組1年、2年OS率分別61% 和46%，而陰性組對(duì)應(yīng)OS率均為42%。PD1陽(yáng)性組1年、2年P(guān)FS率分別52%和36%，陰性組則均為44%。PD1 表達(dá)對(duì)患者OS 和PFS 影響不明顯（P=0.842、P=0.912；圖5D）。

EBER陽(yáng)性組1年、2年和3年OS率分別為71%、56%和44%，而陰性組對(duì)應(yīng)OS率分別為40%、31% 和21%。EBER陽(yáng)性組1年、2年和3年P(guān)FS率分別為55%、44%和28%，陰性組則為41%、23%和14%。與EBER陽(yáng)性組相比，EBER陰性組OS 和PFS 更差（P=0.013，P=0.047；圖6A）。依據(jù)EBER陽(yáng)性細(xì)胞占總組織細(xì)胞百分比將nTFHL-AI患者分為0%、≤1%、1%～lt;5%、≥5%四組，比較各組的1年、2年和3年生存率，提示EBER陽(yáng)性細(xì)胞比例越低，患者OS越差（P=0.013，圖6B），但PFS無(wú)明顯差異（P=0.056，圖6B）。

2.6 危險(xiǎn)因素分析

單因素分析提示包括年齡≥60歲（P=0.013）、晚期（Ⅲ/Ⅳ期）疾?。≒=0.046）、東部腫瘤協(xié)作組（eastern cooperative on?cology group，ECOG）評(píng)分≥2 級(jí)（Plt;0.001）、骨髓受累（P=0.010）、T 細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后指數(shù)（prognostic index for T-celllymphoma，PIT）≥2分（P=0.012）、國(guó)際預(yù)后指數(shù)（internationalprognostic index，IPI）≥2分（P=0.038）、EBER陰性（P=0.011）、CXCL13 陰性（P=0.008）、BCL6 陽(yáng)性（P=0.042）和Ki67 陽(yáng)性（P=0.022）是OS 不良預(yù)后因素（表5）。上述因素除PIT 和BCL6外，也導(dǎo)致較差的PFS（表5）。鑒于本研究病例數(shù)有限，多因素COX回歸分析采用逐步向前/向后法，以P=0.050和P=0.100分別作為單因素進(jìn)入模型和排除模型的閾值，結(jié)果提示骨髓受累、EBER陰性和Ki67陽(yáng)性不僅是OS獨(dú)立不良預(yù)后因素（P=0.003、P=0.001、P=0.034，表6），也獨(dú)立負(fù)性影響PFS（P=0.021、P=0.003、P=0.021，表6）。

3 討論

nTFHL-AI是具有TFH表型的成熟T細(xì)胞淋巴瘤，以全身性淋巴結(jié)腫大和系統(tǒng)性癥狀為主要特征，伴有HEVs和FDCs顯著增生。EBV陽(yáng)性B細(xì)胞增生可見(jiàn)于66%～81.6%的病例[11-12]。此外，nTFHLAI病例中EBV陽(yáng)性B細(xì)胞和EBV陰性腫瘤T細(xì)胞是常見(jiàn)的，但有研究發(fā)現(xiàn)EBV 陽(yáng)性的腫瘤T 細(xì)胞[13-14]。本研究也發(fā)現(xiàn)3例EBER 陽(yáng)性的腫瘤T 細(xì)胞。鏡下觀(guān)察EBV感染的T細(xì)胞，形狀小而圓，能與較大的感染B細(xì)胞區(qū)分。為進(jìn)一步確認(rèn)EBV感染的是T還是B細(xì)胞，可以同時(shí)進(jìn)行EBER-CD3和EBER-CD20雙染色來(lái)區(qū)分。

目前公認(rèn)治療nTFHL-AI 的一線(xiàn)化療治療為CHOP方案，但患者預(yù)后通常不理想。雖然本研究一線(xiàn)治療緩解率與之前的報(bào)道相符[15]，但患者5年OS 率（31%）和PFS 率（16%）均低于之前報(bào)告比例[15-18]，這可能與本研究隊(duì)列中拒絕治療的患者較多（10%）有關(guān)。此外，盡管39名患者接受了CHOP方案治療，但其治療可能未達(dá)到最佳效果，因此開(kāi)發(fā)最佳治療策略仍是必然需求。

在預(yù)后方面，BCL6陽(yáng)性表達(dá)患者的生存結(jié)果似乎更差（OS vs. PFS，P=0.026 vs. P=0.044）。單因素分析顯示，BCL6 陽(yáng)性是OS 不利預(yù)后因素（P=0.042）。BCL6作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，在TFH發(fā)育中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。BCL6在nTFHL-AI患者中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)暗示其可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[19]。此外，BCL6表達(dá)與TET2突變存在明顯相關(guān)性。TET2作為雙加氧酶，能將5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，并在大多數(shù)nTFHL-AI中頻繁突變[20-21]。研究表明，TET2 突變可能導(dǎo)致高甲基化，進(jìn)而促使BCL6過(guò)表達(dá)。此外，BCL6異常表達(dá)似乎會(huì)導(dǎo)致向TFH細(xì)胞偏向分化，最終導(dǎo)致人類(lèi)T細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生[22]。因此nTFHL-AI中TET2突變與BCL6過(guò)表達(dá)可能共存，并與患者不良預(yù)后相關(guān)。然而，BCL6在nTFHL-AI中的確切機(jī)制尚未完全闡明，需要進(jìn)一步地研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13 陰性組患者與CXCL13陽(yáng)性組相比，1年、2年和3年的OS和PFS顯著降低（P=0.003、P=0.040）。單因素分析表明，CXCL13陰性是nTFHL-AI患者OS和PFS的不利預(yù)后標(biāo)志（P=0.008、P=0.025）。相反，CXCL13 陽(yáng)性表達(dá)可能是nTFHL-AI患者的有利預(yù)后因素。作為一種趨化因子，CXCL13 通過(guò)與其受體CXCR5 相互作用，參與生發(fā)中心的形成[23]。然而，Kim TY等[24]認(rèn)為，NK/T細(xì)胞淋巴瘤中，血清CXCL13水平越高，患者OS和PFS越低。這與本研究結(jié)果不一致，可能因?yàn)榱馨土鰜喰筒煌罢呤荖K/T 細(xì)胞淋巴瘤，本研究為nTFHL-AI；其次，研究樣本不同，前者是血清水平，本研究則在組織水平檢測(cè)；最后，本研究樣本數(shù)量有限，患者隨訪(fǎng)時(shí)間僅3年，需要增加樣本量和延長(zhǎng)隨訪(fǎng)時(shí)間來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證CXCL13對(duì)nTFHL-AI的預(yù)后影響。EBV狀態(tài)對(duì)nTFHL-AI患者生存和預(yù)后的影響仍有爭(zhēng)議[11，24-25]。在本研究中，與EBER陽(yáng)性患者相比，EBER 陰性患者OS 和PFS 顯著縮短（P=0.013、P=0.047）。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，EBER陽(yáng)性細(xì)胞比例較低與較差OS相關(guān)（P=0.013）。多因素量分析提示，EBER陰性表達(dá)是OS和PFS的獨(dú)立不良預(yù)后因素（P=0.001、P=0.003）。本研究中EBER 預(yù)后意義與先前文獻(xiàn)報(bào)道不一致，不排除樣本量有限，隨訪(fǎng)時(shí)間不足5年等原因，故增大樣本量和持續(xù)隨訪(fǎng)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證EBER 對(duì)生存期的影響是必不可少的。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)EBV狀態(tài)與CXCL13表達(dá)之間存在顯著相關(guān)性。EBER陽(yáng)性組的CXCL13陽(yáng)性表達(dá)率高于EBER 陰性組（P=0.006）。EBV 或EBER與CXCL13之間潛在關(guān)系可能源自一個(gè)假設(shè)：B 細(xì)胞被EBV 感染后遞呈病毒蛋白如LMP-1 和EBNA-1，同時(shí)上調(diào)B7（CD28配體），進(jìn)而激活CD4陽(yáng)性Th細(xì)胞，促進(jìn)CXCL13生成，從而推動(dòng)B細(xì)胞增殖和激活，形成一個(gè)免疫刺激的“正反饋循環(huán)”[26]。然而，目前對(duì)EBV或EBER 與CXCL13之間的關(guān)聯(lián)仍不明確，需要深入研究。

總之，本研究對(duì)nTFHL-AI患者臨床病理特征和預(yù)后因素進(jìn)行分析，為該病的管理提供了一些見(jiàn)解。研究表明，CXCL13陽(yáng)性表達(dá)與患者良好預(yù)后相關(guān)，而B(niǎo)CL6 陽(yáng)性和EBER 陰性則是不利預(yù)后因素，特別是EBER陰性是一個(gè)顯著的獨(dú)立不良預(yù)后因素。

（責(zé)任編輯：李青穎）