紫堇乙醇提取物對草地貪夜蛾的殺蟲活性及其成分分析

摘 要 為探討紫堇乙醇提取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性，分析其殺蟲活性成分，以紫堇作為供試植物，采用冷浸法和超聲波提取法提取殺蟲活性物質(zhì)，并以草地貪夜蛾3齡幼蟲為試蟲進(jìn)行實驗。結(jié)果表明：采用冷浸法的提取率為7.28%，而采用超聲波提取法的提取率較冷浸法高，可達(dá)9.84%；冷浸法提取的殺蟲活性物質(zhì)對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性較超聲波提取法高，校正死亡率達(dá)70.3%，超聲波提取法的校正死亡率為59.2%；經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，冷浸法獲得的紫堇乙醇提取物一共檢測出17種化學(xué)成分，超聲波提取法獲得的紫堇乙醇提取物一共檢測出15種化學(xué)成分。

關(guān)鍵詞 紫堇乙醇提取物；草地貪夜蛾；觸殺活性；冷浸法；超聲波提取法；成分分析

中圖分類號：TQ453 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.11.011

紫堇（Corydalis edulis Maxim.）為罌粟科（Papaveraceae）紫堇屬（Corydalis）一年生草本植物，紫堇屬植物中，其主要活性成分是異喹啉類生物堿，還含有黃酮類、三萜類和酚類化合物等[1]。Gao 等分別從苦地丁的地上部分分離獲得 5 個原小檗堿類新化合物，從毛紫堇中分離獲得 3 個芐基四氫異喹啉類生物堿、苯酞異喹啉生物堿[2]。目前，國內(nèi)外常用的植物活性成分的提取與純化技術(shù)比較成熟，但還有諸多問題亟待解決。為了有效提高提取與純化的效果，常采用一些新技術(shù)來改進(jìn)提取工藝，現(xiàn)常使用的提取工藝主要有浸漬法、超聲波提取法、索氏提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[3]。

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda），屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），最早產(chǎn)于美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[4]，屬雜食性害蟲，寄主植物特別廣泛，取食最多的是玉米、棉花、高粱、水稻，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織全球預(yù)警的重大農(nóng)業(yè)害蟲。該蟲對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖能力強(qiáng)，飛行能力強(qiáng)，擴(kuò)散速度快[5]。目前，我國廣泛采用應(yīng)急化學(xué)防治措施來遏制草地貪夜蛾的繁殖。但自20世紀(jì)80年代起，陸續(xù)有研究表明，草地貪夜蛾對傳統(tǒng)殺蟲劑如有機(jī)磷類等，表現(xiàn)出了不同程度的抗性[6]。因此，對草地貪夜蛾采取更加科學(xué)的防治措施刻不容緩。

本研究以草地貪夜蛾3齡幼蟲為試蟲，以紫堇作為供試植物，采用冷浸法和超聲波提取法從紫堇體內(nèi)提取殺蟲活性物質(zhì)來探討紫堇乙醇提取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性，并進(jìn)一步分析其殺蟲活性成分，以期為草地貪夜蛾植物源防治提供科學(xué)的理論依據(jù)，為推進(jìn)新型、高效、綠色環(huán)保型農(nóng)藥的研發(fā)奠定堅實的理論基礎(chǔ)和潛在的應(yīng)用前景。

1" 材料與方法

1.1" 材料

紫堇對鱗翅目夜蛾科昆蟲，如草地貪夜蛾等有較高的觸殺活性，因此選擇紫堇作為供試植物。供試樣品于2023年3月初采自重慶市涪陵區(qū)聚賢大道，在紫堇開花初期，結(jié)果實前，采集紫堇整個植株進(jìn)行試驗。

草地貪夜蛾卵塊于2023年5月從重慶市秀山縣梅江鎮(zhèn)新聯(lián)村玉米田中采集，把收集到的卵塊帶回實驗室，挑選健康卵塊放在培養(yǎng)皿里進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2 ℃、濕度60%±5%、光周期16 h光：8 h暗[7]。待蟲卵孵化后，轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲盒并以蔬菜葉飼養(yǎng)至3齡幼蟲供試。

1.2" 方法

1.2.1" 紫堇乙醇提取物的制備

將采回的新鮮紫堇清洗干凈，置于室內(nèi)避光通風(fēng)處自然陰干后，置于45～50℃的恒溫箱內(nèi)烘干直至發(fā)脆。分別用冷浸法和超聲波提取法進(jìn)行提取。

冷浸法：取500 g烘干后的紫堇，裝于玻璃罐中，加95%乙醇常溫浸泡5d ，用4層紗布過濾，將濾液放入溫度調(diào)節(jié)至55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中加壓濃縮，形成一種膏狀物。將其裝入棕色瓶中進(jìn)行稱重，計算提取率R并記錄。最后放入4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

超聲波提取法：將烘干后的紫堇用粉碎機(jī)打碎。取140 g紫堇粉末，分7次，每次20 g倒入250 mL錐形瓶中，加入200 mL 95%乙醇，1～2滴2%稀鹽酸。將錐形瓶置于60 ℃的干燥箱中24 h，取出后用超聲波震蕩45 min。抽濾后冷凍離心，用濾紙濾過，置于溫度調(diào)節(jié)至55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，加壓濃縮，制成膏狀物，裝入已稱重的棕色瓶中，稱重后計算提取率R并記錄，最后放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

Ｒ=（Ｗ₁-Ｗ₂）/Ｗ×100% （1）

式（1）中，R為提取效率；Ｗ1為棕色瓶和濃縮提取物的總重量，g；Ｗ2為棕色瓶本身的重量，g；W為供試植物樣品的重量，g。

分別稱取紫堇的乙醇提取物（冷浸法和超聲波提取法）各2 g置于50 mL燒杯中，加40 mL無菌水，兩滴丙酮，一滴吐溫80溶劑，便于膏狀植物提取物的溶解，在振蕩器中振蕩到完全溶解后，置于100 mL容量瓶中，用無菌水定容，得到濃度為20 mg·mL-1的植物乙醇提取物溶液。取同體積無菌水，加丙酮2滴，吐溫80溶劑1滴，做對照。

1.2.2" 觸殺活性測定

以草地貪夜蛾 3 齡幼蟲為試蟲，采用浸漬法測定紫堇乙醇提取物對試蟲的觸殺作用。將制備的紫堇乙醇提取物溶液（冷浸法和超聲波提取法）與對照組溶液置于500 mL燒杯內(nèi)，將試蟲輕輕夾起置于取出的溶液中浸泡3～5 s，最后將其取出，放于濾紙上，待吸干多余溶液后再放入養(yǎng)蟲盒內(nèi)。

設(shè)置3組試驗樣品，每組設(shè)置20只試蟲，重復(fù)上述實驗操作，24 h后檢查試蟲。使用毛筆輕觸幼蟲身體表面，若未出現(xiàn)任何反應(yīng)，則判定其已經(jīng)死亡，記錄每組死亡數(shù)和存活數(shù)，并計算24 h死亡率和校正死亡率。

死亡率=死亡蟲數(shù)/供試蟲數(shù)×100% （2）

校正死亡率=處理組死亡率?對照組死亡率/1?對照組死亡率 × 100%" （3）

1.2.3" 殺蟲活性成分分析

將紫堇乙醇提取物樣品送至青島恒信檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，應(yīng)用氣象-色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測紫堇乙醇提取物的化學(xué)成分。具體檢測條件如下：

色譜柱：彈性石英毛細(xì)管柱；升溫條件：初溫40 ℃，保持2 min，以10 ℃·min^-1升至180 ℃，保持4 min，再以20 ℃·min^-1升至290 ℃，保持6 min；溶劑延遲：0 min；載氣：高純氦氣（99.999%）；載氣流量：2 mL·min^-1；汽化室溫度：280 ℃；進(jìn)樣量：0.4 μL；分流比為20∶1；進(jìn)樣方式：頂空進(jìn)樣；離子源：EI；離子源溫度：230 ℃，四級桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；傳輸線溫度：200 ℃；質(zhì)量范圍：30～600 amu。

1.3 供試樣品處理

考慮到草地貪夜蛾具有高度的遷飛擴(kuò)散性，為避免其幼蟲在實驗結(jié)束后進(jìn)一步發(fā)育成為成蟲，對涪陵區(qū)及其他地區(qū)的農(nóng)作物造成危害，必須對其進(jìn)行有效的殺滅處理。將剩余的草地貪夜蛾機(jī)械殺死后再進(jìn)行填埋。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 兩種提取工藝的提取率

從表1可知，提取方法不同，對紫堇乙醇提取物的提取率也有差別，冷浸法的提取率為7.28%，超聲波提取法的提取率為9.84%，超聲波提取法的提取率較冷浸法的提取率高。

2.2" 紫堇乙醇提取物對草地貪夜蛾的觸殺活性

本研究用2種提取工藝提取紫堇的殺蟲活性物質(zhì)，并用獲得的紫堇乙醇提取物對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性進(jìn)行了測試，測定結(jié)果表明（見表2），兩種提取法獲得的紫堇乙醇提取物均能觸殺草地貪夜蛾3齡幼蟲，但在毒殺活性方面存在一定程度的差異，冷浸法的校正死亡率為70.3%，超聲波提取法的校正死亡率為59.2%，通過分析得出，冷浸法對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性較超聲波提取法高，且兩種提取方法的校正死亡率相差11.1%，導(dǎo)致校正死亡率相差較大的原因可能是冷浸法提取的殺蟲活性物質(zhì)比超聲波提取法更多，對草地貪夜蛾3齡幼蟲具有更好的觸殺活性。

2.3" 紫堇乙醇提取物殺蟲活性成分

由表3可知，通過冷浸法獲得的紫堇乙醇提取物一共檢測出17種化學(xué)成分，其中有6種化學(xué)成分具有殺蟲活性，包括白樺脂酸、三萜酸、鄰苯二酚、苦味素、揮發(fā)酚、黃酮類化合物。白樺脂酸是自然界普遍存在的五環(huán)三萜類化合物之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗糖尿病、抗菌和抗抑郁等諸多生物活性[8]；三萜酸也屬于三萜類化合物，三萜類化合物在楝科、蕓香科及苦木科植物中均有分布，又稱為檸檬素類化合物，其對害蟲的影響主要是拒食和驅(qū)避；鄰苯二酚是一種重要的化工中間體，它是殺菌劑乙霉威、殺蟲劑殘殺威和克百威的中間體。植物的生長面對各種外界生物脅迫和非生物脅迫，極苦的苦味素是最佳的防御武器，可用來抵御病蟲害的侵入。因此，苦味素是保護(hù)植物的 “綠色農(nóng)藥”；酚作為重要化工原料被廣泛用于殺蟲劑、殺菌劑、化工、制藥和合成纖維等行業(yè)中；研究表明，幾乎所有類黃酮對很多微生物都具有程度不等的抑菌活性，其中具有防治害蟲作用的主要有魚藤酮、毛魚藤酮等[9]。

通過超聲波提取法獲得的紫堇乙醇提取物一共檢測出15種化學(xué)成分，其中具有殺蟲活性的有白樺脂酸、鄰苯二酚、苦味素、異喹啉、小檗堿5種化學(xué)成分。異喹啉可用作合成藥物、染料、殺蟲劑的中間體；小檗堿又叫黃連，現(xiàn)上市小檗堿系列產(chǎn)品多用于殺菌除藻。有研究報道，小檗堿對小菜蛾等鱗翅目害蟲具有較強(qiáng)的拒食作用，可能通過影響害蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶等和代謝相關(guān)的酶活性，進(jìn)而使害蟲死亡[10]。

3" 結(jié)論與討論

3.1" 結(jié)論

經(jīng)提取試驗，得出兩種提取工藝對紫堇中殺蟲活性物質(zhì)的提取率有差異，采用冷浸法的提取率為7.28%，而采用超聲波提取法的提取率則較冷浸法高，可達(dá)9.84%。

經(jīng)觸殺實驗，發(fā)現(xiàn)用冷浸法提取的紫堇殺蟲活性物質(zhì)對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性更好，校正死亡率達(dá)70.3%，而用超聲波提取的紫堇殺蟲活性物質(zhì)對草地貪夜蛾3齡幼蟲的觸殺活性較冷浸法低，校正死亡率為59.2%。

經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，冷浸法獲得的紫堇乙醇提取物一共檢測出17種化學(xué)成分，其中白樺脂酸、三萜酸、鄰苯二酚、苦味素、揮發(fā)酚、黃酮類化合物6種化學(xué)成分具有殺蟲活性；超聲波提取法獲得的紫堇乙醇提取物一共檢測出15種化學(xué)成分，其中具有殺蟲活性的有白樺脂酸、鄰苯二酚、苦味素、異喹啉、小檗堿5種化學(xué)物質(zhì)。

3.2" 討論

本研究選取紫堇作為供試植物、草地貪夜蛾3齡幼蟲作為供試?yán)ハx，運用冷浸法和超聲波提取法提取紫堇的次生物質(zhì)，超聲波提取法提取紫堇中的殺蟲活性物質(zhì)提取率較高，結(jié)果與蘇曉莉[11]的報道一致。冷浸法的提取率較超聲波提取法低，但其所得的粗提取物中殺蟲有效成分比超聲波提取法多，對草地貪夜蛾有的殺蟲效果較好。運用氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了提取物的化學(xué)成分，紫堇中含有苦味素、白樺脂酸、鄰苯二酚、揮發(fā)酚、三萜酸、異喹啉、小檗堿、黃酮類化合物等具有殺蟲活性的化學(xué)成分。

本研究為開發(fā)防治草地貪夜蛾的植物源農(nóng)藥提供了原料，為進(jìn)一步優(yōu)化紫堇有效成分提取工藝提供了理論依據(jù)，為開發(fā)新型、高效、綠色環(huán)保型農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）