不同套作模式對魔芋根際土壤微生物群落的影響

摘 要 采集不同作物（花椒、玉米）與魔芋套作后的土壤樣品，通過ASV高通量測序方法分析根際土壤中的微生物信息，探究不同套作模式下魔芋根際微生物群落組成和多樣性的差異。結(jié)果表明：不同栽培模式能影響土壤微生物的活性和多樣性，表現(xiàn)在Chao1、Ace和Shannon指數(shù)都出現(xiàn)差異，玉米-魔芋栽培模式下，增加了擬桿菌門和綠彎菌門的相對豐度；花椒-魔芋栽培模式下，增加了放線菌門的相對豐度。不同健康情況下的土壤微生物存在差異，患軟腐病的花椒-魔芋套作增加了擬桿菌門和藍(lán)藻菌門的相對豐度，正常的花椒-魔芋套作中，放線菌門相對豐度更大。

關(guān)鍵詞 套作；魔芋；土壤微生物群落；多樣性；豐度

中圖分類號：S632.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.11.004

根際微生物的數(shù)量往往比根際區(qū)外多數(shù)十倍，在植物根系的直接作用下促進(jìn)植物的生長和增殖，并且與植物的根之間存在著相互作用關(guān)系。微生物既能分解有機(jī)物，又能給植物提供營養(yǎng)，同時也能產(chǎn)生一些其他的物質(zhì)，如維生素和生長刺激素，為植物提供重要的養(yǎng)分及能源，另外，土壤中的通氣性和水分狀態(tài)也會對微生物的生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響。

將魔芋與花椒或玉米進(jìn)行套作栽培，是農(nóng)民提高作物產(chǎn)量的種植方法。但魔芋生長習(xí)性比較特別，不耐旱也不耐澇，同時由于魔芋的根系比較淺，在黏性土壤中生長比較緩慢，容易受到根際微生物的影響。作為一種重要的生物群落，根際微生物群落對作物的生長發(fā)育和健康具有重要的影響。這些微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌等，它們常常與植物根系形成共生關(guān)系，相互利用和促進(jìn)生長。保證作物的根系健康是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要措施之一。通過調(diào)整土壤的性質(zhì)和改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，可以提供良好的根際生長環(huán)境，促進(jìn)根際的發(fā)育。這需要加強(qiáng)根際微生物的多樣性檢測管理，調(diào)節(jié)土壤酸堿與微生物的數(shù)量平衡等[1]。只有健康的根際環(huán)境才能有效吸收養(yǎng)分和水分，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，研究作物根際微生物多樣性的關(guān)系與變化，對作物健康生長非常重要。

1" 材料與方法

1.1" 試驗地概況

試驗地位于四川省涼山彝族自治州美姑縣，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)域，具有典型的山地氣候特點，晝夜溫差較大，年均氣溫11.4 ℃，光照雨量條件充足，全年日照較好，年均日照時數(shù)1 791 h，年均降水量815 mm，該區(qū)土壤質(zhì)地以黃棕壤為主。

1.2" 測序試驗

試驗設(shè)3個處理，分別為玉米-魔芋套作、花椒-魔芋套作和攜帶軟腐病的花椒-魔芋套作。2023年，于魔芋成熟期的11月采集各處理的土壤樣品，每個處理隨機(jī)選取采樣點，每個采樣點選取長勢一致的作物，采集魔芋根系上附著的土壤作為試驗根際土壤，挑出根系、秸稈、石塊等雜物，輕刮根際剩余土壤作為樣品，所有樣品用無菌塑料袋收集，收集后放在干冰上立即運至實驗室，并根據(jù)研究需要分成2份，1份存儲在?80 ℃用于DNA高通量測序分析，另1份風(fēng)干用于理化指標(biāo)檢測和分析。采用高通量測序技術(shù)獲取土壤微生物的Chao1、Ace和Shannon 指數(shù)，分析土壤微生物多樣性特征。

測序試驗流程如下：

環(huán)境樣品DNA提取→設(shè)計合成引物接頭→PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物定量與均一化→構(gòu)建PE文庫→Illumina測序

1.2.1" DNA提取

使用DNA試劑盒（Omega Bio-tek， Norcross， GA， USA）提取每個樣品的DNA，待每個DNA提取后，使用1%瓊脂糖凝膠檢測抽提的DNA基因組。

1.2.2" PCR擴(kuò)增

在測序?qū)嶒灥闹付y序區(qū)域合成帶有barcode的特異引物[2]。PCR 實驗采用TransGen AP221-02，PCR儀為ABI GeneAmpamp;reg 9700型。對實驗標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實驗，混合處理同一樣本的PCR產(chǎn)物，接著使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用AxyPrepDNA（AXYGEN）凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，最后使用Tris_HCl進(jìn)行洗脫處理[3]。PCR擴(kuò)增結(jié)果鑒定膠圖見圖1。

1.2.3" PCR產(chǎn)物定量

根據(jù)電泳定量結(jié)果利用QuantiFluor?-ST（Promega）定量系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量，接著按照樣品測序需求，將PCR產(chǎn)物按一定比例混合。

1.2.4" Illumina文庫構(gòu)建

利用PCR技術(shù)在目標(biāo)區(qū)的外部末端添加Illumina官方接頭序列，使用凝膠回收試劑盒切膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。緩沖液Tris-HCl進(jìn)行洗脫處理，2%瓊脂糖電泳進(jìn)行測定，使用氫氧化鈉進(jìn)行變性進(jìn)而生成單鏈DNA片段[4]。試劑：TruSeqTM DNA Sample Prep Kit。

1.2.5" Illumina測序

DNA片段作為試驗測序模板，堿基序列作為引物，PCR合成DNA片段；變性退火處理后，DNA片段一端將與引物互補(bǔ)固定以合成連接；對反應(yīng)序列表面進(jìn)行掃描，得到單個序列模板在每次反應(yīng)實驗過程中所生成的核苷酸種類；利用化學(xué)切割技術(shù)恢復(fù)基因端黏性，聚合核苷酸，統(tǒng)計熒光信號結(jié)果獲得模板DNA片段的序列[5]。

1.3" 生物信息分析

使用ASV（Amplicon Sequence Variant）高通量測序方法，可以進(jìn)行物種分類、群落多樣性分析、物種差異分析、相關(guān)性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和功能預(yù)測分析等一系列的統(tǒng)計學(xué)或可視化分析。將Illumina測序獲得的PE reads分割后，首先基于測序質(zhì)量對雙端Reads進(jìn)行質(zhì)控和篩選，同時根據(jù)雙端Reads之間的overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，獲得質(zhì)控拼接之后的優(yōu)化數(shù)據(jù)。使用序列降噪方法處理優(yōu)化數(shù)據(jù)，獲得ASV代表序列和豐度信息[6-7]。基于ASV代表序列及豐度信息，進(jìn)行群落多樣性分析，得到微生物群落分布柱狀圖，如圖2所示。所有的數(shù)據(jù)分析均在生物云平臺上進(jìn)行，采用mothur軟件計算Alpha多樣性指數(shù)Chao1、Ace和Shannon 指數(shù)，并采用Wilxocon秩和檢驗進(jìn)行Alpha多樣性的組間差異分析[8]，確定不同組間水平豐度顯著差異的的細(xì)菌類群。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同栽培模式對根際微生物多樣性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，玉米-魔芋和花椒-魔芋兩種套作模式下的根際微生物群落有差異。由表1可知，玉米-魔芋套作模式下，擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度得到提升，豐度占比分別為9%、16%。而花椒-魔芋套作模式下的放線菌門（Actinobacteriota）的占比更大，提高到了22%。擬桿菌門與綠彎菌門對玉米-魔芋這種套作栽培模式更敏感，而花椒-魔芋套作栽培模式對放線菌門的影響更大。由表2可知，玉米-魔芋與花椒-魔芋2種套作方式改變了其根際微生物的多樣性。在Chao1和Ace指數(shù)[9]方面，花椒-魔芋套作比玉米-魔芋套作分別提高了20%和19%，Shannon指數(shù)也有相同趨勢，花椒-魔芋套作比玉米-魔芋套作提高了5%。對比發(fā)現(xiàn)兩種栽培模式下作物的微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著差別，即玉米和花椒兩種不同作物與魔芋套作對魔芋根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成有不同的影響作用，并且花椒-魔芋這種套作模式對魔芋根際的土壤微生物的影響更為顯著。

玉米-魔芋與花椒-魔芋兩種套作模式充分發(fā)揮高矮作物的空間配置優(yōu)勢，但不同栽培模式能影響土壤微生物的活性和多樣性[10]。在作物栽培中，可以利用套作措施有效調(diào)控種群間比率的方法，根據(jù)根際微生物的差異去選擇合適的栽培模式，以達(dá)到最理想的種植效果。

2.2" 不同健康情況下的根際微生物多樣性差異

胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌（Ewinia caroto-voravar carotovora）引起的魔芋軟腐病是一種細(xì)菌性病害，其致病機(jī)制是病原微生物釋放的果膠酶，細(xì)胞中層發(fā)生溶解，腐蝕組織，從而吸引其他的腐菌，并將其分解，生成吲哚，發(fā)出惡臭[11]。針對正常的花椒-魔芋套作與患軟腐病的花椒-魔芋套作進(jìn)行根際微生物分析對比發(fā)現(xiàn)，患軟腐病的套作中的根際微生物擬桿菌門（Bacteroidota）與藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）相對含量得到增加，分別提升到了21%和19%，而正常的花椒-魔芋套作中的根際微生物放線菌門（Actinobacteriota）相對含量更多，達(dá)到了22%（見表1）。

擬桿菌門是一類單細(xì)胞，可廣泛存在于土壤，是微生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一部分，能夠幫助宿主維持健康和免疫功能。藍(lán)藻菌門是光合細(xì)菌，具有多種生物防控應(yīng)用，藍(lán)藻可以釋放酶、分解病原體的細(xì)胞壁或菌絲，與病原體和害蟲競爭根際空間和養(yǎng)分，并通過與植物根部的互動來激活植物的防御反應(yīng)。很多健康的植物在未被病原體感染以前，就已經(jīng)包含了各種各樣的抗病性細(xì)菌，比如檢測到的擬桿菌門與藍(lán)藻菌門等。在作物患上軟腐病后，作物在與病原微生物演化的同時，也形成了復(fù)雜的抗性機(jī)制，以應(yīng)對病原的多重致病方式，導(dǎo)致擬桿菌門與藍(lán)藻菌門等抗病性細(xì)菌的含量急劇增加，以抵抗病原物的侵入和擴(kuò)展。而土壤放線菌門是一類促生性細(xì)菌，這類細(xì)菌可以分解有機(jī)物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化成為植物可以使用的營養(yǎng)物質(zhì)，從而為植物的生長提供養(yǎng)分[12-14]。健康的植物土壤中，富含更多的營養(yǎng)物質(zhì)，土壤放線菌與這些物質(zhì)形成共生關(guān)系，微生物豐度增多。這就解釋了為什么患病套作的抗病性細(xì)菌的豐度增加，正常套作的土壤中促生性細(xì)菌更多的原因。

3" 討論與結(jié)論

根際土壤微生物的數(shù)量與種類對植物的生長發(fā)育和健康狀況具有重要的作用，其多樣性對根際營養(yǎng)元素的吸收與轉(zhuǎn)化也具有重要的作用，其中有益菌能夠增加土壤中的有效營養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)作物對環(huán)境的抗性[15]。具體比較玉米-魔芋與花椒-魔芋兩種套作處理魔芋根際微生物的真菌及細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)不同栽培模式處理的部分根際微生物的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)較大差異。玉米-魔芋與花椒-魔芋兩種套作方式顯著影響了根際微生物的多樣性，表現(xiàn)在Chao 1、Ace和Shannon指數(shù)發(fā)生顯著變化。根際細(xì)菌在門類上的相對豐度出現(xiàn)差異，這是由于根際土壤中含有豐富的微生物，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化與土壤類型、根際營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)及栽培方式等因素有關(guān)[16-17]。

不同套作模式影響根際微生物多樣性體現(xiàn)在改變了根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，對微生物種類、數(shù)量、豐度等均有一定影響。除此之外，對比患軟腐病和健康的花椒-魔芋套作的試驗結(jié)果顯示，擬桿菌門、藍(lán)藻菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌門，這些抗病菌和促生菌參與植物抗病機(jī)制與提供養(yǎng)分過程，在此發(fā)育過程中微生物相對豐度發(fā)生改變，進(jìn)而促進(jìn)魔芋的生長發(fā)育并提高魔芋品質(zhì)。研究表明，不同的種植方式和作物的健康狀況會影響土壤根系微生物的多樣性及組成，特別是有益微生物的分布組成，對土壤微生物的調(diào)控具有重要意義。

綜上所述，不僅根際微生物群落能對作物產(chǎn)生影響，作物的生長方式和生長狀況對微生物群落的影響也是顯著的，其生態(tài)平衡的調(diào)整和優(yōu)化，對現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量提升至關(guān)重要，需要在實踐中探索適合不同環(huán)境條件下的調(diào)控策略，不斷提高根際微生物群落的生態(tài)效應(yīng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)性，根際微生物的群落結(jié)構(gòu)龐大，更多的促生菌和抗病菌需要未來進(jìn)一步分析和鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王燦，肖志鵬，向鵬華.不同輪套作模式對植煙土壤根際微生物群落的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，（7）：1-5.

[2] NANNIPIERI P，ASCHER J，CECCHERINI M T，et al.Microbial diversity and soil functions[J].European Journal of Soil Science，2003，54（4）：655-670.

[3] 付金晶，安迪，孫琳，等.襯膜水稻技術(shù)對荒漠化土壤微生物多樣性的修復(fù)效果研究[J].地球科學(xué)前沿（漢斯）， 2021， 11（4）：435-448.

[4] 劉龍丁，李洪哲，王晶晶，等.一種用于腸道菌群研究的非嚙齒類動物模型的建模方法：CN201711461099.5[P].2024-01-18.

[5] 丁習(xí)林，楊子江，廖國周，等.KCl部分替代NaCl對宣威火腿細(xì)菌多樣性的影響[J].肉類研究，2022，36（10）：8-15.

[6] 夏瑾華，劉彩艷，劉佳儀，等.懷玉山三葉青兩個栽培種塊根內(nèi)生菌、根際微生物群落分布及其化感物質(zhì)的比較分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，54（7）：93-103.

[7] 趙小蓉，林啟美.微生物解磷的研究進(jìn)展[J].土壤肥料，2001（3）：7-11.

[8] 胡立萍，沈子亮，王全，等.泌乳早期奶牛瘤胃微生物與牛奶脂肪酸組成的變化[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2022，53（9）：3018-3028.

[9] SCHLOSS P D ， WESTCOTT S L ， RYABIN T ， et al. Introducing mothur： open-source， platform-independent， community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied amp; Environmental Microbiology，2009，75：7537.

[10] 曾志浩，袁宗勝，陳雪瑩，等.3種紅樹植物根際與非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2022，37（6）：809-816..

[11] 高翔，張淑香，龍懷玉.負(fù)壓灌溉下施鉀促進(jìn)紫葉生菜生長和根際微生物多樣性的研究[J].中國土壤與肥料，2019（6）：149-153.

[12] 陳娜.魔芋-玉米間作對其產(chǎn)量和根際微生物群落的影響[J].鄉(xiāng)村科技，2022，13（22）：75-78.

[13] 葉晶龍，樂超銀，潘虹，等.魔芋軟腐病拮抗放線菌的篩選及其抑菌活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（30）：16908-16910.

[14] HUANG M Y.Identification and fermentation of antagonistic bacterium against Ralstonia solanacearum[J].Microbiology China，2011（2）：214-220.

[15] WEI Z，YANG X M，YIN S X，et al. Efficacy of bacillus–fortified organic fertilizer in controlling bacterial wilt of tomato in the field[J].Applied Soil Ecology，2011（2）：152–159.

[16] HU W M，SAMAC D A，LIU X Z，et al. Microbial communities in the cysts of soybean cyst nematode affected by tillage and biocide in a suppressive soil[J]. Applied Soil Ecology， 2017（119）：396–406.

[17] 肖苗苗，張紅娟，趙芳，等.小麥/玉米輪作田根際微生物多樣性分析[J].微生物學(xué)通報，2021，48（12）：4612-4623.

（責(zé)任編輯：易" 婧）