紫穗槐抗壞血酸過氧化物酶（APX2）基因的克隆及抗旱性功能驗證

摘要：為了研究紫穗槐（Amorpha fruticosa L.）在干旱條件下感知脅迫信號并通過生理和生化調(diào)節(jié)途徑來維持其耐性功能作用的基因，可為紫穗槐抗旱性育種提供一個候選基因。通過對紫穗槐在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，活性氧平衡系統(tǒng)的抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX2）基因的表達(dá)量隨脅迫時間顯著升高，對紫穗槐的AfAPX2基因進(jìn)行克隆，采用無縫克隆技術(shù)連接入門載體（pQB-V3），通過Gateway體系LR反應(yīng)將目的基因構(gòu)建到表達(dá)載體，并用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana tabacum），愈傷組織培養(yǎng)成T₀代苗，收獲種子后種植研究其與干旱脅迫的相關(guān)性。結(jié)果表明， AfAPX2基因表達(dá)蛋白與擬南芥和水稻的APX2同源比對，同樣有過氧化物酶的結(jié)構(gòu)域，推測可以通過ROS途徑增強植物抗逆性。AfAPX2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有13處α-螺旋，17處β-折疊，4處β-轉(zhuǎn)角和多處無規(guī)則卷曲，AfAPX2酶三級結(jié)構(gòu)具有鐵離子的結(jié)合位點。在干旱脅迫和脅迫后恢復(fù)供水下，過表達(dá)AfAPX2基因株系的葉片以及植株的茂盛程度明顯大于野生型。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)AfAPX2基因陽性植株對自然干旱脅迫的耐受性增強，提高了煙草的抗旱性，說明AfAPX2在響應(yīng)干旱脅迫中可能扮演重要的調(diào)節(jié)角色。進(jìn)而驗證了紫穗槐干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組的上調(diào)基因與其相關(guān)，可以找到提高抗旱性的相關(guān)基因。

關(guān)鍵詞：紫穗槐；抗壞血酸過氧化物酶；干旱；轉(zhuǎn)基因；煙草

收稿日期：2024-02-19

基金項目：財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02）；黑龍江省自然科學(xué)基金（LH2023C097）。

第一作者：張藝騰（1996-），男，碩士，研究實習(xí)員，從事玉米抗逆高產(chǎn)栽培研究。E-mail：yiteng_fighting@163.com。

通信作者：錢春榮（1973-），女，博士，研究員，從事作物耕作栽培研究。E-mail：qcr3906@163.com。

紫穗槐（Amorpha fruticose L.）是一種落葉灌木，原產(chǎn)于北美，作為觀賞植物引入中國，是一種城市綠化和滑坡保護(hù)植物。具有較高的觀賞價值，廣泛應(yīng)用于城市景觀建設(shè)和路面保護(hù)。另外紫穗槐可以適應(yīng)干燥的土壤，在河岸和道路以及淹沒森林的邊緣最為豐富，甚至可以適應(yīng)偶發(fā)的洪水。各種棲息地條件的高耐受性和強大的繁殖能力促進(jìn)了紫穗槐果實的侵略性入侵行為。因此，了解紫穗槐的抗旱耐鹽堿機制，對植物耐受性的研究和提高在逆境脅迫下的作物產(chǎn)量具有重要意義。

植物在逆境條件下生長發(fā)育主要取決于其不斷適應(yīng)環(huán)境變化的作用機制，特別是在環(huán)境脅迫時能夠激活耐旱特異性防御機制、主動進(jìn)行生理調(diào)整以及獲得應(yīng)對環(huán)境變化的結(jié)構(gòu)等。而在植物受逆境脅迫的生化反應(yīng)中具有一組起基礎(chǔ)性作用的代謝物質(zhì)，即植物清除活性氧（ROS）的重要酶^[1]和抗壞血酸（ASC）-谷胱甘肽（GSH）循環(huán)中重要酶類組分^[2]的抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate Peroxidase， APX）?；钚匝酰≧OS）由分子氧的一價還原產(chǎn)生，是有氧代謝的固有物質(zhì)。在植物體內(nèi)，ROS 主要是為了應(yīng)對不利的環(huán)境條件而產(chǎn)生的，在發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的不同關(guān)鍵生理途徑中充當(dāng)信號分子^[3-6]。然而，高濃度的ROS如過氧化氫（H₂O₂）可透過生物膜擴(kuò)散，并與生物化合物（如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸）發(fā)生反應(yīng)，造成損傷，在許多情況下會導(dǎo)致細(xì)胞死亡^[7]。控制細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而控制細(xì)胞氧化還原平衡，是一個復(fù)雜的過程，涉及許多機制和龐大的基因網(wǎng)絡(luò)^[8]。抗壞血酸過氧化物酶（APX）是一種清除H₂O₂的抗氧化酶，在高等植物中至少分布于4個不同的細(xì)胞區(qū)室：葉綠體的基質(zhì)、類葉綠體膜、微粒體和細(xì)胞質(zhì)。研究表明，每個細(xì)胞區(qū)可能含有一種或幾種APX異構(gòu)體^[9]。Mittler等^[10]指出，在干旱脅迫期間，編碼細(xì)胞質(zhì)APX的APX1基因的表達(dá)量增加。并且種子在缺水下APX活性降低，導(dǎo)致萌發(fā)能力喪失^[11]。APX的主要功能是清除植物細(xì)胞在脅迫條件下氧化猝滅產(chǎn)生的過量ROS^[12-13]。因此，APX活性的降低往往會導(dǎo)致ROS的大量積累，從而對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸造成氧化損傷。最近，有研究強調(diào)，當(dāng)干旱脅迫時，APX1酶起著關(guān)鍵作用，這僅僅是由于擬南芥細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中H₂O₂的強烈增加，可能造成細(xì)胞損傷^[14]。而目前對紫穗槐APX基因的研究相對較少，開展AfAPX2基因?qū)钚匝踅舛具^程所起重要作用的深入研究，是紫穗槐RNA-seq篩查抗干旱基因的一個有力證據(jù)。

紫穗槐為抗旱耐受鹽堿性極強的灌木樹種^[15-16]，研究干旱脅迫對紫穗槐其生理生化指標(biāo)影響的結(jié)果，揭示了其幼苗抵御干旱脅迫的生理適應(yīng)性變化調(diào)節(jié)機制。紫穗槐抗干旱性相關(guān)的高差異表達(dá)基因在其抗旱生理中起著至關(guān)重要的作用。本研究以qRT-PCR檢測驗證挖掘到干旱脅迫相關(guān)的多個基因，在干旱脅迫下，活性氧平衡系統(tǒng)的抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX2）基因的表達(dá)量顯著升高，因此開展AfAPX2基因?qū)钚匝踅舛具^程所起重要作用的深入研究并克隆AfAPX2基因，轉(zhuǎn)化過表達(dá)煙草，分析其抗旱性，旨在為促進(jìn)紫穗愧抗旱育種遺傳改良和提高種質(zhì)資源利用率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植株材料 紫穗槐（Amorpha fruticosa L.）種子來源于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院吳松泉課題組的饋贈；本氏煙草（Nicotiana tabacum）種子由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所卜慶云課題組饋贈。

1.1.2 載體、試劑與菌株 PMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；克隆入門載體“pQB-V3”和Gateway體系植物表達(dá)載體“pGWB18”由中國科學(xué)院卜慶云課題組饋贈。cDNA反轉(zhuǎn)錄酶和PCR聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)酶購自佳蘭生物科技有限公司；無縫克隆試劑盒購自諾唯贊生物科技股份有限公司；2×Taq酶購自康為試劑生物有限公司。DH5α大腸桿菌（Escherichia coli），農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 PEG6000模擬干旱脅迫 本研究以20%的PEG6000溶液對沙培28 d的紫穗槐幼苗灌根處理，取0，6，12，24和48 h處理幼苗的根、莖和葉用液氮速凍處理，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后稀釋50倍作為模板，在MxPro-Mx3000P系統(tǒng)上采集數(shù)據(jù)，設(shè)計AfAPX家族特異引物及內(nèi)參基因Afqublin引物，PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，檢測PEG6000模擬干旱脅迫后基因的相對表達(dá)量。

1.2.2 AfAPX2基因的生物信息學(xué)比較分析 應(yīng)用NCBI的ORF分析推導(dǎo)編碼氨基酸（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）；在線網(wǎng)絡(luò)軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）進(jìn)行蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析；以在線網(wǎng)站（http：//web.expasy.org/protparam/）軟件分析蛋白的理化性質(zhì)；并預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（https：//www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html）和三級結(jié)構(gòu)（https：//swissmodel.expasy.org/interactive），以及預(yù)測編碼蛋白的功能；利用BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比對分析。

1.2.3 植物過表達(dá)載體pGWB18-AfAPX2的構(gòu)建 根據(jù)無縫克隆的要求，以克隆的基因AfAPX2核苷酸序列和pQBV3載體的兩端序列為依據(jù)設(shè)合成載體構(gòu)建的引物AfAPX2-3F和AfAPX2-4R（表1），高保真聚合酶PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物與以EcoRV線性化pQBV3載體用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的無縫連接酶融合，PCR檢測pQBV3-AfAPX2質(zhì)粒DNA的正確性，將準(zhǔn)確無誤的純化的質(zhì)粒DNA與pGWB18載體LR反應(yīng)連接構(gòu)建植物表達(dá)載體pGWB18-AfAPX2（圖1），以EcoRV酶切檢測載體構(gòu)建的完成情況。通過電擊法將pGWB18-AfAPX2質(zhì)粒DNA導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，經(jīng)PCR檢測正確的菌株為侵染工作的工程菌。

1.2.4 過表達(dá)AfAPX2基因煙草 電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，將檢測含有載體pGWB18-AfAPX2質(zhì)粒DNA的農(nóng)桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)到OD₆00為0.5時，對野生型煙草（Nicotiana tabacum）0.5 cm²葉片侵染，侵染時間在10～20 min，在濾紙上吸干菌液，在培養(yǎng)基（MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA+20 mg·L^-1AS）上黑暗共培養(yǎng)48 h，以羧芐青霉素溶液脫菌，進(jìn)而在潮霉素50 mg·L^-1的篩選下分化培養(yǎng)，獲得抗性芽，生根培養(yǎng)成苗，并培養(yǎng)發(fā)育成植株，以載體引物35S-F和B18NOS-R（表1）檢測T₁代轉(zhuǎn)化子6個株系。

1.2.5 自然干旱法檢測過表達(dá)AfAPX2 煙草的脅迫耐受性 過表達(dá)AfAPX2煙草和野生型煙草種子播種在蛭石和草碳土混合的花盆中，生長到４葉期后移栽到15 cm×15 cm的花盆中，在植物培養(yǎng)室中再培養(yǎng)21 d，直到個別植株現(xiàn)蕾時開始斷水自然干旱，分別在干旱7和14 d拍照調(diào)查表型，自然干旱14 d后澆足水，開始復(fù)水至14 d后檢測恢復(fù)后的表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 AfAPX2基因的克隆

為了獲得AfAPX2基因，將紫穗槐葉片的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，在克隆引物與聚合鏈?zhǔn)矫傅?0 μL的體系中，PCR儀上35個循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)物電泳，EB染色的瓊脂糖凝膠成像的結(jié)果見圖2A，2和4泳道的產(chǎn)物有2條DNA帶，4道泳的DNA量多，且長度為750 bp左右，符合目的基因大小。

轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在篩選平板（50 mg·L^-1氨芐青霉素）過夜培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒DNA用HindIII和BamHI DNA限制性內(nèi)切酶消解質(zhì)粒DNA，電泳檢測結(jié)果顯示750 bp處有條DNA帶，表明PMD18-T上有外源目的基因插入（圖2B）。將酶切正確的PMD18-T-c168978質(zhì)粒DNA送到庫美生物有限公司測序，以質(zhì)粒DNA測序結(jié)果校準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄組的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄組的核苷酸校準(zhǔn)序列（AfAPX2）見圖3。

2.2 AfAPX2基因的ORF編碼的氨基酸及同源性比較

將校準(zhǔn)AfAPX2的核苷酸序列輸入NCBI的ORF檢索框，提交分析開放讀碼框，獲得核苷酸編碼最長的氨基酸序列，甲硫氨酸（M）起始的蛋白質(zhì)（圖4A）；以此氨基酸在NCBI的蛋白質(zhì)比對BLAST，氨基酸同源比對結(jié)果顯示前10位的物種是：密花豆（Spatholobus suberectus）、金花生（Arachis duranensis）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、大豆（Glycine max）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、木豆（Cajanus cajan）、豇豆（Vigna unguiculata）、豇豆變種（Vigna radiata var. radiata）、花生（Arachis hypogaea）和野生大豆（Glycine soja）。將這些物種高度同源的APX2氨基酸與模式植物擬南芥和水稻APX2比較表明，有20個氨基酸位點不同（圖4B）。該分子式為：C₁219H₁886N₃24O₃66S₄，蛋白質(zhì)分子量： 27 064.58；等電點：5.51；脂肪族氨基酸指數(shù)： 79.32；總平均親水性（GRAVY）： -0.353的親水蛋白。

2.3 AfAPX2的二級和三級結(jié)構(gòu)分析及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

通過PSIPRED工具預(yù)測AfAPX2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，輸出結(jié)果如圖4C所示，其有13處α-螺旋，17處β-折疊，4處β-轉(zhuǎn)角和多處無規(guī)則卷曲。以SMART網(wǎng)絡(luò)軟件分析酶活性殘基表明第1號～第178號氨基酸是抗壞血酸過氧化物酶殘基（圖5A）。AfAPX2酶三級結(jié)構(gòu)分析從正反面展示了抗壞血酸過氧化物酶三級結(jié)構(gòu)，顯示了鐵離子的結(jié)合位點（圖5B和C）。

2.4 植物潮霉素抗性的過表達(dá)載體pGWB18-AfAPX2

將PMD18-T-c168978質(zhì)粒DNA的1%作為PCR模板擴(kuò)增附加Gateway體系接頭AfAPX2的DNA，純化PCR產(chǎn)物連接插入線性化pQBV3載體實現(xiàn)無縫連接融合，PCR檢測pQBV3-AfAPX2質(zhì)粒DNA，其中2，4和6泳道有750 bp左右的目的基因條帶，表明有AfAPX2基因成功連入pQBV3載體（圖6A）。

pQBV3-AfAPX2質(zhì)粒DNA（#2）與目的載 體pGWB18載體混合，在LR反應(yīng)酶的作用下，使pGWB18-AfAPX2載體成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌克隆菌株載體DNA，試劑盒提取質(zhì)粒DNA，以BamHI限制性內(nèi)切酶鑒定，產(chǎn)生載體條帶和目的基因條帶，表明植物表達(dá)載體pGWB18-AfAPX2構(gòu)建完成（圖6B）。電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，PCR檢測菌株有目的基因條帶（圖7A），說明獲得侵染植物的農(nóng)桿菌。

2.5 過表達(dá)載體AfAPX2基因煙草的獲得

在含有pGWB18-AfAPX2質(zhì)粒DNA的農(nóng)桿菌介導(dǎo)下，侵染轉(zhuǎn)化煙草葉片，含有潮霉素的平板篩選分化出抗性植株，以載體特異引物PCR檢測T₁代轉(zhuǎn)化子6個株系。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖7B所示，有與目的基因大小一致的片段，表明35S-AfAPX2已經(jīng)整合到本氏煙草的染色體上。

2.6 自然干旱法檢測過表達(dá)AfAPX2煙草的脅迫耐受性

土壤水分是植物生長的必要因子，本研究通自然斷水的方法檢測本氏煙草野生型（WT）和過表達(dá)AfAPX2基因煙草對水分匱缺的耐受性，經(jīng)過7 d的干旱脅迫后，植株底部葉片黃化，上部的葉片萎蔫，過表達(dá)株系的頂部葉片的萎蔫程度低于WT；繼續(xù)自然干旱脅迫，到14 d后，WT和過表達(dá)AfAPX2 基因煙草的干旱損傷差異不明顯，兩者葉片都已萎蔫，底部葉片高度黃化變白；從干旱第14天開始復(fù)水，第一次飽和水澆灌后，每2 d補充一次水，經(jīng)過14 d的恢復(fù)供水生長，WT和過表達(dá)株系的表型呈現(xiàn)出顯著差異，過表達(dá)AfAPX2基因株系的葉片以及植株的茂盛程度明顯優(yōu)于野生型（圖8）。

3 討論

3.1 PEG6000模擬干旱脅迫對植物苗期的生理指標(biāo)分析

植物生長必需的就是溫度、光照、水分和營養(yǎng)物質(zhì)，水分是細(xì)胞的重要組成部分，細(xì)胞是構(gòu)成組織的基本單位，組織發(fā)育就是新陳代謝推陳出新的生理過程。本研究前期發(fā)現(xiàn)紫穗槐種子萌發(fā)期在PEG6000模擬干旱脅迫下，胚芽和胚根的MDA含量、SOD酶活性與PEG6000處理的強弱呈極顯著正相關(guān)，脯氨酸含量也有升高^[17]，郝福順等^[18]發(fā)現(xiàn)PEG處理明顯提高了葉子和根中APX的活性，所以PEG與其種子萌發(fā)和幼苗根系生長的生理及結(jié)構(gòu)變化有密切聯(lián)系。有研究表明MDA的升高、SOD活性的增加雖然會對植物細(xì)胞造成不良影響，但對于提高植物幼苗期抗旱能力具有重要作用；干旱脅迫下植株的SOD、MDA、Pro和REC是衡量植物抗旱性的指標(biāo)，SOD活性顯著高于對照，表明紫穗槐幼苗與楊樹等林木相比對干旱脅迫還有一定的耐受性，紫穗槐可作為一種抗旱種質(zhì)材料進(jìn)行研究。

3.2 干旱脅迫下紫穗槐幼苗表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組

當(dāng)前轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)很成熟，已有多種植物對環(huán)境響應(yīng)的RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序被報道，如鹽脅迫下濱柃（Eurya emarginata）^[19]、水稻^[20]、玉米^[21]、擬南芥和胡楊等植物的轉(zhuǎn)錄組測序研究；目前關(guān)于紫穗槐菌根的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)差異表達(dá)基因研究已有報道^[22]。本研究前期以PEG6000模擬干旱脅迫處理紫穗槐幼苗，在10%和20%的PEG6000干旱處理下表現(xiàn)出了一定的耐旱性生長。取脅迫前后的全株幼苗轉(zhuǎn)錄組測序獲得高質(zhì)量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，共注釋到的56.25 Gb Clean Data，96 594條UniGene注釋覆蓋到10個物種，紫穗槐和大豆同為豆科植物，同豆科的大豆轉(zhuǎn)錄測序組裝獲得大約39 183條序列^[23]，與栽培大豆的同源性最高，其次是菜豆。本研究紫穗槐轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步匯總從頭組裝產(chǎn)生了大約42.6 Gb原始數(shù)據(jù)。COG數(shù)據(jù)庫比對到25個代謝分類，在細(xì)胞內(nèi)行使結(jié)合、催化的分子功能、參與各種分子合成和代謝積累；UniGene的KEGG Pathway注釋結(jié)果顯示，拼接后比對獲得UniGene主要注釋在128個通路中，多于360個基因有11個通路，SSR密度分布表明所測得數(shù)據(jù)可靠全面。主成分分析和樣本間的相關(guān)分析結(jié)果表明，每組中的生物復(fù)制都聚集在一起，這表明同一組中的樣本之間的變異性很小。說明在后續(xù)深入分析時，可以放心使用所有6個測序樣本數(shù)據(jù)。

3.3 抗壞血酸過氧化物酶基因缺乏會改變活性氧穩(wěn)態(tài)

APX是一類重要的抗氧化酶，參與植物生物和非生物脅迫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)^[24-25]?？箟难徇^氧化物酶作為響應(yīng)上游參與酶調(diào)節(jié)氧化平衡的關(guān)鍵酶。近年來，植物活性氧與逆境脅迫調(diào)節(jié)研究也逐漸成為熱點，本研究將過表達(dá)AfAPX2基因的煙草和野生型煙草進(jìn)行自然干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)植株長勢明顯優(yōu)于野生型，并且復(fù)水后恢復(fù)狀態(tài)也更好。而一些研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，APX2敲除突變體也觀察到了H₂O₂積累的抑制^[26]，而較多報道顯示是由于APX缺乏導(dǎo)致H₂O₂增加^[27-29]。這種分歧可能表明APX在不同發(fā)育階段和生長條件下的功能存在差異。但無論如何，APX2的缺失導(dǎo)致H₂O₂水平或穩(wěn)態(tài)的變化，嚴(yán)重影響了植物的生長發(fā)育，這種嚴(yán)重的抑制作用可能是H₂O₂信號變化的結(jié)果。所以構(gòu)建Crispr-Cas9-AfAPX2載體敲除紫穗槐APX2基因來做進(jìn)一步的研究，分析抗壞血酸過氧化物酶的缺失對植物體內(nèi)活性氧的調(diào)控機理具有重要意義。

4 結(jié)論

干旱脅迫下對紫穗槐抗壞血酸過氧化物酶（APX2）基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異基因測序分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因AfAPX2與擬南芥和水稻的APX2基因高度同源，同樣含有過氧化物酶的結(jié)構(gòu)域，推測可以通過ROS途徑參與抗氧化損傷調(diào)控。將過表達(dá)該基因的煙草自然干旱脅迫7 d后，過表達(dá)株系的頂部葉片萎蔫程度低于野生型，并且發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因煙草在恢復(fù)供水14 d后，其生長狀態(tài)相比野生型明顯好轉(zhuǎn)。綜上，表明過表達(dá)AfAPX2基因煙草對自然干旱脅迫的耐受性增強，提高了煙草的抗旱性，進(jìn)而驗證了紫穗槐在干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄組測序的上調(diào)基因與其相關(guān)，可以挖掘到提高抗旱性的其他相關(guān)基因。

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Cloning of Ascorbate Peroxidase （APX2） Gene from Amorpha fruticosa L.

and Functional Validation of Drought Resistance

ZHANG Yiteng¹， GUAN Qingjie²， YU Yang¹， HAO Yubo¹， JIANG Yubo¹， GONG Xiujie¹， L Guoyi¹， QIAN Chunrong¹

（1.Institute of Crop Cultivation and Farming， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150023， China; 2.School of Life Sciences， Northeast Forestry University/Key Laboratory of Northeast Saline-Alkali Vegetation Restoration and Reconstruction， Ministry of Education， Harbin 150040， China）

Abstract：In order to study the genes that sense stress signals under drought conditions in Amorpha fruticosa and maintain their functional roles in tolerance through physiological and biochemical regulatory pathways， which can provide a candidate gene for drought-resistant breeding of Amorpha fruticosa. The transcriptome data of Amorpha fruticosa under drought stress were analysed， the expression of Ascorbate Peroxidase （APX2） gene， which is a system of reactive oxygen balance， increased significantly with the time of drought stress， and the AfAPX2 gene of Amorpha fruticosa was cloned， and a seamless cloning technique was used to connect to the starter vector （pQB-V3）， and a Gateway system LR was developed. The target gene was constructed into the expression vector by Gateway system LR reaction， and transformed into Agrobacterium rhizogenes EHA105 by electroshock method， and Agrobacterium-mediated transformation of tobacco （Nicotiana tabacum） was adopted， and the healing tissues were cultured into seedlings of T₀ generation， and seeds were harvested and planted to study the correlation between them and drought stress. The results showed that AfAPX2 gene expressed protein was homologous to APX2 from Arabidopsis and rice， and also had the structural domain of peroxidase， which was hypothesized to enhance plant stress tolerance through the ROS pathway. The secondary structure of AfAPX2 protein had 13 α-helices， 17 β-folds， 4 β-turns， and multiple irregular curls， and the tertiary structure of the AfAPX2 enzyme had a ferric ion. The tertiary structure of AfAPX2 enzyme has a binding site for iron ions." Under drought stress and restoration of water supply after stress， the leaves as well as plants of overexpressing AfAPX2 gene lines were significantly more luxuriant than those of the wild type. In this study， we found that trans-AfAPX2 gene-positive plants showed enhanced tolerance to natural drought stress and improved drought tolerance in tobacco， suggesting that AfAPX2 may play an important regulatory role in response to drought stress. It was further verified that the up-regulated genes in the drought stress transcriptome of Amorpha fruticosa were related to it， and the relevant genes for improving drought tolerance could be found. Overexpression of AfAPX2 in tobacco showed that transgene-positive plants showed enhanced tolerance to natural drought stress and improved drought tolerance in tobacco， suggesting that AfAPX2 may play an important regulatory role in response to drought stress. It was further verified that the up-regulated genes in the drought stress transcriptome of Amorpha fruticosa were related to it， and the relevant genes for improving drought tolerance could be found. It can be used as a candidate gene for breeding drought resistance in Amorpha fruticosa， which lays a solid theoretical foundation for its genetic improvement and resource utilization.

Keywords：Amorpha fruticose; ascorbate peroxidase; drought; transgene; tobacco