基于響應面優(yōu)化陳皮黃酮類有效成分的提取工藝

摘要： 以陳皮為研究原料，以陳皮中的總黃酮提取率為響應值，采用單因素以及響應面實驗優(yōu)化索氏提取陳皮黃酮類有效成分的工藝?？疾煲毫媳?、粉碎粒度、提取時間和乙醇體積分數(shù)對陳皮總黃酮提取率的影響，并采用 Box-Behnken實驗設計的四因素三水平響應面分析方法優(yōu)化工藝。結果表明陳皮黃酮類有效成分提取的最佳工藝條件是：液料比為20∶1（mL/g）；粉碎粒度為100目；提取時間為2.5 h；乙醇體積分數(shù)為35%。此條件下陳皮總黃酮的提取率為1.65%，預測提取率為1.68%，與實際值非常吻合。在此最佳工藝條件下提取的陳皮浸膏經乙醚萃取后，得到的乙醚萃取物進一步用氣相色譜-質譜（gas chromatogrphy-mass spectrometry，GC-MS）法分析，共鑒定出27種揮發(fā)性成分，其中主要成分是多甲氧基黃酮類化合物。

關鍵詞： 陳皮； 索氏提?。?總黃酮； 響應面設計法； 氣相色譜-質譜（GC-MS）

中圖分類號： TS201.1

文獻標志碼： A

文章編號： 1671-6841（2024）05-0088-07

DOI： 10.13705/j.issn.1671-6841.2023014

Optimization of Extraction Technology of Flavonoids from

Dried Tangerine Peel Based on Response Surface

HAN Hongping1，2， XU Guangli1， CAO Jiajia1，DUAN Peiqi1，2

（1.School of Chemistry and Chemical Engineering， Qinghai Normal university， Xining 810008， China;

2.The Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources of Qinghai-Tibetan Plateau in Qinghai

Province， Xining 810016， China）

Abstract： Using dried tangerine peel as row material， and the extraction rate of total flavonoids from tangerine peel as the response value， the pr2f726f4dbe30f61d698b3609b33ec316ocess of Soxhlet extraction of flavonoids from tangerine peel was optimized by single factor test and response surface test. The effects of extraction time， ethanol volume fraction， liquid-solid ratio and crushing particle size on the extraction rate of total flavonoids from tangerine peel were examined， and the four factor and three-level response surface analysis method designed by Box Behnken experiment was used to optimize the process. The results showed that the optimum extraction conditions of flavonoids from tangerine peel were as follows： extraction time was 2.5 h; ethanol volume fraction was 35%， liquid-solid ratio was 20∶1 （mL/g）; crushing particle size was 100 mesh. And the extraction rate of total flavonoids from tangerine peel was 1.65%. The predicted extraction amount was 1.68%， which was very consistent with the actual value. After the extract of tangerine peel was extracted by ether with the optimum conditions， the ether extract was further analyzed by GC-MS. A total of 27 volatile components were identified， and the main components were polymethoxy flavonoids.

Key words： tangerine peel; soxhlet extraction; total flavonoids; response surface design method；gas chromatogrphy-mass spectrometry （GC-MS）

0 引言

陳皮是蕓香科植物橘及栽培變種柑橘的干燥成熟果皮，在我國作為主要功能藥用類和其他功能食品類藥材同源配伍應用的藥物，臨床可用于治療胸腹脹滿、痰多、咳嗽、惡心厭食等癥狀［1-3］。研究表明，陳皮中含有多種天然活性化學成分，主要有黃酮類化合物、揮發(fā)油、多糖、生物堿和多種人體必需的微量元素等［4-6］。陳皮中的黃酮類化合物主要有橙皮苷、橘皮素、新橙皮苷以及川陳皮素等。藥理學最新研究表明陳皮中的黃酮類化合物既有增強抗血管脆性、抗病毒、預防心血管疾病的作用，也是天然陳皮的主要生物學活性成分來源［7-10］，因此對陳皮中黃酮類有效成分的提取工藝進行優(yōu)化可為陳皮進一步開發(fā)利用提供有效的理論依據(jù)。

目前陳皮黃酮類化合物的提取工藝主要有溶劑回流提取［11］、超聲波提取［12］、微波輔助提取等［13］。雖然超聲波、微波萃取技術具有時間短、節(jié)省試劑和污染小等優(yōu)點，但因為操作不便、實驗成本高、不能用于大規(guī)模提取，因而應用不廣泛，所以溶劑回流提取仍是目前最廣泛有效的方法，它利用相似相溶原理，選用一種能夠對所提取的有效成分溶解最大的溶劑，并同時盡可能減少其他雜質成分的溶出。本文采用索氏提取法提取陳皮中的黃酮類有效成分，探討其粉碎粒度、液料比、提取時間和乙醇體積分數(shù)等單因素實驗，運用響應面設計優(yōu)化實驗，選擇陳皮有效成分的最佳提取工藝，并用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術［14］測定分析最優(yōu)條件下得到的陳皮浸膏乙醚萃取物的化學成分。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

陳皮購于甘肅隴塬峰藥業(yè)有限公司，蘆?。ㄅ枺篋ST181110，純度≥98%）購于成都德思特生物科技公司，氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

本文儀器與設備使用TU-1950型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司），TSQ 8000 Evo型三重四極桿氣質聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技公司），BZ24/29型索氏提取器（天津市玻璃儀器廠），SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（山東東易日盛儀器廠），ME20型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 陳皮提取液的制備

首先在60 ℃恒溫干燥箱中恒溫干燥陳皮，粉碎之后過100目篩，然后將稱取的陳皮粉末用濾紙分裝，放入索氏提取器中，按液料比20∶1（mL/g）的比例加入35%乙醇回流提取，提取結束后過濾分離，即得陳皮提取液。

1.3.2 陳皮總黃酮提取率的測定

準確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加入60%的乙醇溶解稀釋并定容，得到0.2 mg/mL濃度的蘆丁標準儲備液。分別精密移取0、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mL的蘆丁儲備液于25mL容量瓶中，采用硝酸鋁顯色法測定，以不加蘆丁的空白溶液做對照，在508 nm波長處測定吸光度，以蘆丁濃度c為橫坐標，吸光度值A為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為A=0.0012c+0.0113，所用的線性相關系數(shù)為R2=0.9992。每組進行三次平行對照試驗，然后求平均值，將其代入線性回歸方程，并計算陳皮樣品中總黃酮提取率。

1.3.3 單因素實驗

以陳皮總黃酮吸光度為評價指標，探討不同因素對陳皮總黃酮提取結果的影響?？疾煲毫媳确謩e為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（g/mL）、粉碎粒度分別為40、60、80、100、120目，乙醇體積分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%，提取時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h的單因素實驗，每組實驗重復三次，考察各因素對陳皮中總黃酮提取結果的影響，得到最佳單因素水平。

1.3.4 響應面優(yōu)化實驗

以總黃酮提取率為響應值，在單因素實驗基礎上通過Box-Behnken模型的中心組和實驗優(yōu)化提取工藝，選取乙醇體積分數(shù)（A）、提取時間（B）、液料比（C）、粉碎粒度（D）四個因素，設定-1（低）、0（中）、1（高）三個水平，響應面優(yōu)化試驗設計方案見表1。

1.4 陳皮浸膏乙醚萃取物的GC-MS分析

1.4.1 氣相色譜及質譜條件

本文使用的毛細管色譜柱為TG-5MS（30×0.25 mm，0.25 μm），載氣（高純氦氣）為1 （mL/min）流量。280 ℃為進樣口溫度，升溫過程中，60 ℃為初始溫度，保持1 min，以10（℃/min）的速度升到180 ℃，保持20 min，再以20 （℃/min）的速度升到300 ℃，保持2 min。進樣量為1 μL，分流進樣，分流比為50∶1。質譜條件設置為：250 ℃為離子源溫度，5min為溶劑延遲時間，285 ℃為傳輸線溫度，質譜掃描范圍（m/z）為40～500。

1.4.2 定性分析方法

將陳皮提取浸出液過濾后濃縮，合并濃縮液蒸干稱重，得到陳皮提取浸膏，再將浸膏加水混懸后用乙醚萃取，制得乙醚萃取物，利用本文的GC-MS條件對乙醚萃取物的化學成分進行研究，通過峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

不同液料比、乙醇體積分數(shù)、提取時間及粉碎粒度對陳皮總黃酮提取結果的影響見圖1。

從圖1看出，當液料比為20∶1（mL/g）時，提取液吸光度值達到最高，選擇液料比為20∶1（mL/g）為宜。當乙醇體積分數(shù)為30%時，吸光度值最高，表明選擇乙醇體積分數(shù)30%最為合理。提取時間在1.0、1.5、2.0和2.5 h的范圍內，溶液吸光度值逐漸呈上升趨勢，在2.5 h達到最大值。所以最佳提取時間選擇2.5 h。當陳皮粉碎粒度為100目時，吸光度值達到最大值，因此選擇粉碎粒度100目為宜。

2.2 響應面優(yōu)化實驗及方差分析

在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數(shù)（A），提取時間（B），液料比（C）和粉碎粒度（D）四個因素為變量，陳皮總黃酮提取率Y為響應值，設計一組共計29次的BBD響應面分析，試驗結果如表2所示，方差分析結果如表3所示。

從表3得出，該回歸模型整體達到極顯著水平（P<0.0001<0.01），模型相關系數(shù)R2=0.9836，說明本文擬合程度較好，同時也說明響應值和自變量之間的關系顯著。模型失擬項P＞0.05，不顯著，表明實驗提取率的實測值與預測值接近，兩者之間不存在顯著失擬，模型調整復相關系數(shù)R2adj=0.9671，說明96.71%響應值變化能夠被該模型解釋。變異系數(shù)（C.V.%）為4.06，說明模型精密度高，實驗可靠性好。分析結果顯示，A、C、AC、BC、CD、A2、B2、C2、D2項極顯著，AB、BD項較顯著，說明料液比和乙醇體積分數(shù)及二者之間的交互影響顯著（P<0.01）。由表2可知各因素對陳皮總黃酮提取率的影響程度大小次序為C>A>D>B，即液料比>乙醇體積分數(shù)>粉碎粒度>提取時間。采用Design Expert 8.0進行二次回歸分析，得到陳皮總黃酮提取率Y的二次多項回歸方程為

Y=17.19+8.95×10-3A+0.13B+0.46C+0.07D+2.17×10-4AB+5.5×10-3AC+5.0×10-4AD－7.83×10-4BC+1.21×10-4BD－1.33×10-3CD－2.15×10-3A2－4.05×10-4B2－8.6×10-3C2－4.06×10-4D2。

2.3 響應面交互作用結果

對表3數(shù)據(jù)應用Design-Expert 8.0進行二次回歸擬合，可得到變量之間相互作用的三維等高線響應曲面圖，如圖2所示。

從圖2看出，當液料比固定在20 （mL/g），粉碎粒度固定在100目時，乙醇體積分數(shù)和提取時間的交互作用響應曲面彎曲度大，等高線為橢圓，說明交互影響作用顯著，與方差分析結果吻合。當乙醇體積分數(shù)固定在30%，提取時間固定在2.5 h時，液料比和粉碎粒度的交互作用響應曲面彎曲度較大，等高線呈橢圓，兩者交互作用較顯著，符合方差分析結果。當提取時間在2.0～2.5 h，粉碎粒度的范圍在80～100目時，觀察到總黃酮提取率顯著降低，粉碎粒度與提取時間的交互作用響應曲面彎曲度不大，等高線為圓形，表明交互作用不顯著，與方差分析結果一致。

2.4 回歸模型驗證

采用Design-Expert 8.0軟件的嶺脊分析對提取工藝條件進行優(yōu)化，得到陳皮總黃酮的最佳提取條件：乙醇體積分數(shù)為33.94%，提取時間為2.37 h，液料比為21.97∶1 （mL/g），粉碎粒度為96.63目，

陳皮總黃酮的提取率為1.68%。為方便實際操作，調整提取工藝中乙醇體積分數(shù)為35%，提取時間為2.5 h，液料比為20∶1 （mL/g），粉碎粒度為100目。采用上述調整過的最佳工藝條件提取三次，測得平均實際提取率為1.65%，與預測值1.68%接近，相對誤差為1.82%，擬合率為99%，說明此提取工藝可行。

2.5 陳皮乙醚萃取物的GC-MS分析

提取陳皮中的黃酮類有效成分三次，合并三次提取液，減壓濃縮得到浸膏，浸膏干燥后最終得干物質20.10 g，將所得浸膏加適量水成混懸液，用乙醚萃取，即得乙醚萃取物。取乙醚萃取液0.1 μL進樣，并用GC-MS分離鑒定其化學組成，如圖3所示，得到陳皮乙醚萃取物的總離子流色譜圖（見圖3），對各峰進行色譜掃描后得到質譜圖，通過質譜圖庫和Xcalibur工作站對分/QJLIlQRqlnLuMSaZecEImPm625WbzzRiisQCRkIo0M=離出的化合物進行質譜分析并確定化合物的結構，再通過峰面積歸一化法計算各成分的相對含量，結果如表4所示。

3 結論

響應面設計對實驗的各個水平可以進行連續(xù)分析，并通過中心組實驗研究幾種實驗間的交互作用，從而獲得高精密度的回歸方程。比傳統(tǒng)的正交實驗設計次數(shù)少、但精度高，得到的回歸方程可確定在實驗范圍內的任何試驗點的預測值，是用于優(yōu)化工藝條件的首選方法。本研究在優(yōu)化得到的陳皮乙醚萃取物經GC-MS分析后，鑒定出多甲氧基黃酮類化合物是含量最多的組成成分。多甲氧基黃酮化合物因具有良好的開發(fā)天然抗癌藥物或功能食品的價值，在人類抗炎劑、抗誘變劑和抗氧化劑等方面有很好的市場前景，可開發(fā)成食品添加劑、藥品和保健品等。本研究可為提取中草藥得到食品添加劑提供參考。

參考文獻：

［1］ 李柯柯， 任順成. 陳皮中黃酮類化合物的研究進展［J］. 食品研究與開發(fā)， 2017， 38（17）： 221-224.

LI K K， REN S C. The development of flavonoids in dried orange peel［J］. Food research and development， 2017， 38（17）： 221-224.

［2］ LIU M， XIAO W Z， ZHANG H， et al. Quality control strategies of medicine food homology materials based on fingerprint profiling and chemometrics： citri reticulata pericarpium as an example［J］. Spectrochimica acta part A， molecular and biomolecular spectroscopy， 2023， 286： 121968.

［3］ FU M Q， XU Y J， CHEN Y L， et al. Evaluation of bioactive flavonoids and antioxidant activity in pericarpium citri reticulatae （Citrus reticulata ′Chachi′） during storage［J］. Food chemistry， 2017， 230： 649-656.

［4］ 高蓓. 廣陳皮黃酮類化合物和揮發(fā)油成分及其活性研究［D］. 武漢： 華中農業(yè)大學， 2011.

GAO B. Studies on flavoids and essential oils and biological activities of flavoids and essential oils in PCR［D］. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2011.

［5］ ZHANG R J， CHEN J， MAO L Z， et al. Nobiletin triggers reactive oxygen species-mediated pyroptosis through regulating autophagy in ovarian cancer cells［J］. Journal of agricultural and food chemistry， 2020， 68（5）： 1326-1336.

［6］ SU D X， LIU H S， QI X Y， et al. Citrus peel flavonoids improve lipid metabolism by inhibiting miR-33 and miR-122 expression in HepG2 cells［J］. Bioscience， biotechnology， and biochemistry， 2019， 83（9）： 1747-1755.

［7］ GOYAL L， KAUSHAL S. Evaluation of chemical composition and antioxidant potential of essential oil from Citrus reticulata fruit peels［J］. Advances in research， 2018， 15（2）： 1-9.

［8］ MA W Z， FENG S L， YAO X J， et al. Nobiletin enhances the efficacy of chemotherapeutic agents in ABCB1 overexpression cancer cells［J］. Scientific reports， 2015， 5： 18789.

［9］ ZOU J M， WANG J J， YE W L， et al. Citri Reticulatae Pericarpium （Chenpi）： a multi-efficacy pericarp in treating cardiovascular diseases［J］. Biomedicine & pharmacotherapy， 2022， 154： 113626.

［10］羅琥捷， 楊宜婷， 黃壽根， 等. 超聲提取法與索氏提取法提取陳皮黃酮類有效成分的分析比較［J］. 中藥材， 2016， 39（2）： 371-374.

LUO H J， YANG Y T， HUANG S G， et al. Analysis and comparison of effective flavonoids from pericarpium citri Tangerinae by ultrasonic extraction and soxhlet extraction［J］. Journal of Chinese medicinal materials， 2016， 39（2）： 371-374.

［11］周興鵬， 張敬鋮， 樊龍星， 等. 超聲提取陳皮功效成分的工藝研究［J］. 中國調味品， 2019， 44（1）： 1-4， 19.

ZHOU X P， ZHANG J C， FAN L X， et al. Study on the technology of ultrasonic extraction of the functional components of tangerine peel［J］. China condiment， 2019， 44（1）： 1-4， 19.

［12］張婷婷， 梁燕， 彭燦. 不同方法提取陳皮中黃酮類有效成分含量比較［J］. 中國藥業(yè)， 2021， 30（13）： 40-43.

ZHANG T T， LIANG Y， PENG C. Comparison of flavonoids content in pericarpium citri reticulatae extracted by different methods［J］. China pharmaceuticals， 2021， 30（13）： 40-43.

［13］許姍姍， 許浚， 張笑敏， 等. 常用中藥陳皮、枳實和枳殼的研究進展及質量標志物的預測分析［J］. 中草藥， 2018， 49（1）： 35-44.

XU S S， XU J， ZHANG X M， et al. Research progress on citri reticulatae pericarpium， aurantii fructus immaturus， and aurantii fructus and Q-marker predictive analysis［J］. Chinese traditional and herbal drugs， 2018， 49（1）： 35-44.

［14］王少敏， 牛穎， 代敏， 等. 頂空-氣相色譜-質譜法同時測定7種甲磺酸酯類雜質［J］. 鄭州大學學報（理學版）， 2019， 51（3）： 104-108.

WANG S M， NIU Y， DAI M， et al. Simultaneous determination of seven methanesulfonate impurities by headspace-GC-MS［J］. Journal of Zhengzhou university （natural science edition）， 2019， 51（3）： 104-108.